Informe de bioquímica

Práctica No. 5. Cuantificación de proteínas

Elaborado por:
Jhon Jairo
Camila Rico
Laura Cristina Ocampo
Gabriela Rodríguez Arango
Liliana Carolina Rodríguez Huertas

Presentado a:
Jefferson Steve Aponte

Universidad nacional abierta y a distancia

UNAD
Escuela de ciencias agrícolas pecuarias y del medio ambiente
Programa zootecnia
2023
Introducción
 Objetivos

Generales
 Conocer métodos de cuantificación de proteínas y aplicar los conceptos de curva de
calibración

Específicos
 Realizar la regresión lineal a partir de los datos de la curva de calibración realizada
con la albúmina de suero bovino.
 Hallar las concentraciones de las muestras problema.
 Cuantificación de proteínas.
 Mapa conceptual Cuantificación de proteínas.

Se clasifican en

la propiedad intrínseca de las para la formación de derivados la capacidad que tienen las
proteínas para absorber luz en el químicos proteínas de formar complejos.
UV.
.

Métodos en la formación de
complejos colorimétricos entre
las proteínas y reactivos
específicos

Se encuentran

Lowry Biuret.
Bradford

El

El método de Bradford Está basado

en el cambio de color del colorante
azul brillante de Coomassie en
respuesta a diferentes
concentraciones de proteínas.

esta

Esta unión del colorante con as

proteínas provoca un cambio en el
máximo de absorción del colorante
desde 465 a 595 nm.

por lo tanto

La forma roja se convierte en azul

este método se basa en la propiedad del
cuando el colorante se une a la proteína.
Azul Brillante de Coomasie G-250 de
Experimentalmente se mide la diferencia
presentarse en dos formas con colores
de Absorbancias entre 595 y 465 nm.
diferentes, rojo y azul.
 Procedimiento

Pesar 0.1 g de caseína y colocarla en un vaso de

precipitado de 100 mL. Añadir 30 mL de solución
de NaCl al 1%, agregar gota a gota una disolución
concentrada de NaOH 1N hasta completar la
disolución de la proteína.

SI

Pasar la disolución a un matraz aforado de 50 mL

y afora. Esta es la disolución problema y de estas
se tomarán alícuotas para el desarrollo de la
prueba.

Para la preparación de la muestra problema de leche;

tomar 0.1 mL de leche y realizar una dilución de 1:10
(Vol. Final: 1 mL). Si la concentración de proteína no
se encuentra dentro del rango de absorbancia preparar
diluciones de 1:20, 1:100 y 1:1000 de la solución
inicial.
SI Separe los tubos de ensayo en dos grupos,
los seis primeros se utilizaron para
obtener la curva patrón y los otros seis
para analizar las muestras problema.
Prepare los 12 tubos.

Adicione a cada tubo el mismo volumen del

reactivo de Bradford (2 mL), homogenice la
llevar los tubos a 70 °C solución por medio de un agitador tipo
durante 10 minutos hasta la vortex. (Tenga presente, solamente al tubo 1
formación del complejo. se le agregaron 2 ml de reactivo de Bradford
Dejar reposar las y 2 ml de NaCl).
soluciones hasta alcanzar
la temperatura ambiente.

Realizar la cuantificación de la solución

Realice y grafique la regresión lineal
por medio de un espectrofotómetro a 595
a partir de los datos de la curva de
nm para el reactivo de Bradford, entre
calibración realizada con la albúmina
cada medición lavar las celdas; al tener
de suero bovino y halle las
todas las mediciones realizar la curva de
concentraciones de las muestras
calibración.
problema.
  Descripción de la practica
La práctica realizada el viernes 2 de abril, se evaluaron la concentración de proteínas en una

muestra mediante la cuantificación por métodos espectrofotométricos.

 Recursos a utilizar en la práctica (Equipos / instrumentos)

Materiales

 Matraz aforado de 50 mL

 pipeta graduada de 1,0 mL o micropipetas

 Tubos de ensayo

 Gradilla

 Termómetro

Reactivos

 Reactivo de Bradford

 Solución de Albúmina sérica Bovina (10 mg/mL)

 Caseína y sobrenadante (obtenidos en la práctica anterior)

 Leche

 NaCl al 1%

 NaOH 1N

Equipos

 Espectrofotómetro

 Incubadora
  Agitador

Procedimiento.

a. Pesar 0.1 g de caseína y colocarla en un vaso de precipitado de 100 mL. Añadir 30

mL de solución de NaCl al 1%, agregar gota a gota una disolución concentrada de

NaOH 1N hasta completar la disolución de la proteína.

Imagen 1. Peso 0,1 g de caseína

Imagen 2. Vaso precipitado de 100ml

y 30 ml de solución de NaCl al 1%

agregado NaOH 1N hasta completar la

disolución de la proteína.
b. Pasar la disolución anterior a un matraz aforado de 50 mL y aforar. Esta es la

disolución problema y de estas se tomarán alícuotas para el desarrollo de la prueba,

Este volumen es suficiente para todo el grupo de estudiantes presentes en el

laboratorio.

Imagen 3. Matraz aforado de 50 ml.

Imagen 4. Disolución problema

c. Para la preparación de la muestra problema de leche; tomar 0.1 mL de leche y

realizar una dilución de 1:10 (Vol. Final: 1 mL). Si la concentración de proteína no

se encuentra dentro del rango de absorbancia preparar diluciones de 1:20, 1:100 y

1:1000 de la solución inicial.

Imagen 5. Dilución de 1:10

d. A continuación, separe los tubos de ensayo en dos grupos, los seis primeros se

utilizaron para obtener la curva patrón y los otros seis para analizar las muestras

problema.
Imagen 6. Tubos separados, los seis primeros son para obtener la curva patrón y los

otros seis para analizar las muestras problema.

e. Adicione a cada tubo el mismo volumen del reactivo de Bradford (2 mL),

homogenice la solución por medio de un agitador tipo vortex. (Tenga presente,

solamente al tubo 1 se le agregaron 2 ml de reactivo de Bradford y 2 ml de NaCl).

Imagen 7. Reactivo de Bradford

 Imagen 8. Tubos con reactivo de Bradford, adicione dos (2 mL).

f. Posteriormente, llevar los tubos a 70 °C durante 10 minutos hasta la formación del

complejo. Dejar reposar las soluciones hasta alcanzar la temperatura ambiente.

Imagen 9. Baño de maría a

temperatura de 70°C.
 Imagen 10. Tubos a

temperatura de 70°C, durante 10

minutos hasta la formación del

complejo.

g. Finalmente, realizar la

cuantificación de la solución

por medio de un

espectrofotómetro a 595 nm para el reactivo de Bradford, entre cada medición lavar

las celdas; al tener todas las mediciones realizar la curva de calibración.

Imagen 11. Espectrofotómetro

a 595 nm para el reactivo de

Bradford

h. Realice y grafique la regresión lineal a partir de los datos de la curva de calibración

realizada con la albúmina de suero bovino y halle las concentraciones de las

muestras problema.
  Tablas de registro de datos obtenidos de las prácticas de laboratorio.

Tubo No. Solución * Absorbancia Proteína (mg)

1 2 ml NaCl al 1%, 0.524 Blanco

2 0.1 ml BSA y 1.9 2.223 Albumina de

ml NaCl al 1%, Huevo, color azul

claro

3 0.2 ml BSA y 1.8 2.427 Albumina de huevo,

ml NaCl al 1%, color azul claro

4 0.4 ml BSA y 1.6 2.409 Albumina de huevo,

ml NaCl al 1% color azul claro

5 0.8 ml BSA y 1.2 2.688 Albumina de huevo,

ml NaCl al 1%, color azul claro

6 1 ml BSA y 1 ml 2.663 Albumina de huevo,

NaCl al 1%,
color azul claro

7 0.25 ml caseína y 1.693 Caseína, color azul

1.75 ml NaCl al 1%, claro

8 0.5 ml caseína y 1.5 2.232 Caseína, color azul

ml NaCl al 1%, claro

9 0.25 ml 0.519 Sobrenadante de

sobrenadante y 1.75 caseína, color verde

ml NaCl al 1%, claro

 10 0.5 ml sobrenadante 0.637 Sobrenadante de

y 1.5 ml NaCl caseína, color verde

claro

11 0.25 ml leche 0.563 Leche, color azul

diluida y 1.75 ml claro

NaCl al 1%,

12 0.5 ml leche diluida 0.560 Leche, color azul

y 1.5 ml NaCl al claro

1%,

 Análisis y resultados obtenidos.

Mediciones por medio de un espectrofotómetro a 595 nm para el reactivo de Bradford.

Resultados

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6

0.524 2.223 2.427 2.409 2.688 2.663

Tubo 7 Tubo 8 Tubo 9 Tubo 10 Tubo 11 Tubo 12

1.693 2.232 0.519 0.637 0.563 0.560

Absorbancia de 595 para todos los tubos.

 Al tener todas las mediciones realizar la curva de calibración.

En la gráfica se observa, falta de cuantificación de proteína.

 Preguntas

Explique la ley de Beer-Lambert.

Esta se define como aquella relación directa entre la absorbancia de la luz de onda fija y la

concentración del cromóforo, donde se encuentra la cantidad de moles que se tiene de la

sustancia que en un litro de solución. Además, es importante para bioquímica y la química

en general, porque permite conocer la concentración de una sustancia, con tan solo medir la

absorbancia de la misma con un espectrofotómetro y la relación existente entre. (Geraldo,

2020)

 Conclusiones

A lo largo de la práctica se conocieron procedimientos de laboratorio a partir de la

concentración de proteínas en una muestra mediante la cuantificación por métodos

espectrofotométricos, donde se pudo observar la medición de la solución por medio de un

espectrofotómetro a 595 nm para el reactivo de Bradford, donde observo unos resultados

buenos.

 Bibliografía

Geraldo, J. (diciembre de 2020). Ley de Beer-Lambert - Práctica de Laboratorio. Obtenido

de https://www.researchgate.net/publication/354352388_Ley_de_Beer-Lambert_-
_Practica_de_Laboratorio#:~:text=De%20este%20concepto%2C%20se
%20define,2005%3B%20KhanAcademy%2C%202017).