ARTÍCULO / contenidos curados

1.TÍTULO DE LA ENTRADA
Uso novedoso del CRISPR/Cas9 para el tratamiento contra el VIH

2. URL/DOI
URL:https://onlinelibrary.wiley.com/share/GU9PUUEKCZEFVZFFPQMU?target=10.1002/
rmv.1998
DOI: 10.1002/rmv.1998

3. EXPLICACIÓN DEL CONTENIDO Me ha dicho Marina que tienen que ser 100 palabras
maximo jaja

-Resumen introducción, 1.1 y 1.2 (cuando pongáis vuestros resúmenes, miramos cómo los
juntamos y, en mi caso, reduzco mi parte jejjej VALE SARA JAJA)

Cada año, más de 2 millones de personas contraen VIH. A pesar del gran éxito de la TAR,
sus limitaciones exigen nuevas estrategias terapéuticas para erradicar la infección por VIH-
1, como el sistema CRISPR/Cas9, el cual tiene la capacidad de modificar con precisión el
genoma. En concreto, con la destrucción de la expresión de CCR5, molécula que ayuda al
virus a ingresar en las células huésped.

-Resumen partes 1.3 y 1.4:

CRISPR-Cas9 edita pues el genoma y podría usarse como técnica altamente eficaz
modificando el genoma del VIH, ya que CRISPR reconoce las secuencias específicas y
Cas9 las edita (con el correceptor CCR5 como intermediario y gracias al ARN guía).

Además, concretamente se forma un complejo tracrRNA/crRNA para finalmente guiar a la

endonucleasa Cas9 a la edición del ADN, siempre y cuando crRNA/trRNA resulten en una
guía correcta por el ARN guía de manera que se guíe a Cas9 en la edición del ADN celular

VAMOS CANDELA JAJA QUE TU PUEDES GUAPA jaja

4. REFERENCIA
Deng, Q., Chen, Z., Shi, L., Lin, H. (2018) . Developmental progress of CRISPR/Cas9
and its therapeutic applications for HIV-1 infection. Rev Med Virol. 28(5):e1998.
5. PALABRES CLAVE (de más a menos imp)
CRISPR/Cas9, Edición genética, VIH, CCR5,

5.1 ETIQUETA
Artículo científico

6. AUTORES
Componentes del grupo: Miguel Herraéz, Sara Santamaría y Candela Sanz
Profesor responsable: Tania Ayllón

EXPLICACIÓN DE MIGUEL:

INTRODUCCIÓN

CRISPR/Cas9 se utiliza para la edición específica del genoma, es una técnica muy eficiente
que modifica el genoma del VIH-1; CRISPR reconoce secuencias específicas que Cas9
edita.

Esta técnica se usa en terapia ARTE, dada la modificación que lleva CRISPR; y puede
usarse como prevención y tratamiento.

TERMINOLOGÍA (PALABRAS CLAVE):

VAA: virus adenoasociado

ARTE: terapia antirretroviral.

Carro: terapia antirretroviral combinada

CCR5: receptor de quimiocina 5

CRISPR: repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente espaciadas

ARNcr: ARN derivado de CRISPR

HEASES: endonucleasas dirigidas

Hu-BLT: médula ósea/hígado/timo humanizados

iPSC: células madre pluripotentes inducidas

LTR: repetición terminal larga

NHEJ: unión de extremos no homólogos

PAM: motivos adyacentes al protoespaciador

Pi: interacción PAM

RGEW: nucleasas diseñadas guiadas por ARN

RNP: ribonucleoproteínas

saCas9: Estafilococo aureus Cas9

ARNg: ARN de guía única

SRSR: repeticiones cortas regularmente espaciadas

TALEN: nucleasas efectoras similares a activadores de la transcripción

ARNtracr: ARN transactivador

ZFN: nucleasas con dedos de zinc

RESULTADOS:

1) Cas9 junto con ARN quimera artificial permitió la escisión del gen CCR5

2) La edición del genoma permitió eliminar la expresión gracias a LTR, que ocasionó la
mutación de una célula T infectada por VIH-1

Los genes virales en la célula huésped presentes en los cromosomas

3)

TALEN permitió la mutación homocigota del CCR5- 32(alta eficacia pero sin
conseguir la escisión, que por mediación de Ipscs (por mecanismos artificiales) para la
edición del genoma; se produjo la diferenciación de monocitos/macrófagos resistentes
de forma natural al VIH-1

4) Vectores lentivirales como mecanismo de resistencia, ya que la expresión mediante

ARNg específico de Cas9 y CCR5 produjo el silenciamiento del CCR5

La escisión de una vuelta de células CD4+ infectadas por VIH-1 en función de del eficiente
mecanismo de variación del gen CCR5

En un ensayo de endonucelasa 1 no se produjo la mutación del genoma en el loci de mayor

probabilidad fuera del objetivo de la secuencia similar a ARNg de CCR5 en células
transducibles estables

5) iPSCS mediante CRISPR frente al VIH

La activación transcripcional de Cas9 expresada por 2 proteínas o factores restrictivos, uno

el A3G y otro el A3B; en células humanas permitió su modificación

Se eliminaría la replicación del virus de forma sintética (síntesis de los dos factores
restrictivos)

La expresión puede darse por el ARNg o por nucleasas Cas9; que eliminan el provirus
latente y acaban con la nueva infección del VIH-1

6) Preenvasado del lentivirus con Cas9 permite la edición fuera del objetivo del locus
del cromosoma 4 gracias al ARNg de CCR5 cuyo objetivo es en el lentivirus la alta
eficacia de ARNg/Cas9 para la eliminación del VIH
Siendo la maquinaria reaprativa de extremos no homólogos (NHEJ) la que permite la
mutación del sitio por modificación del VIH-1 con Cas9

Teniendo dos resultados diametralmente opuestos, por un lado la eliminación de la

replicación del VIH-1 y por otro lado la evasión del ataque al virus.

EN ambos casos, no hubo mucha eficacia del ARNg/Cas9 para una probable eliminación
del VIH

Cas9/ARNg frente al VIH-1 y NHEJ con alta eficacia para que el virus evada el ataque
rápidamente (NHEJ consiguió que se dieran variantes virales en cuyo ataque: Cas9/ARNg
es un anti-VIH-1, que junto a los fármacos antivirales, contribuye al ataque a secuencias
virales no esenciales)

7) RNP (ribonucleoproteínas) con CRISPR/Cas9 permite la edición de factores en

células T humanas primarias cuyo objetivo es eliminar eficazmente el gen diana

Esto puede ser usado tanto en la terapia farmaceútica como en la celular

7.2) VIH latente (su reservorio es un grupo de inmunocitos en el cuerpo infectados pero que
no producen activamente nuevas copias del mismo: VIH ataca y entra en células del SI para
multiplicarse), el objetivo es la eliminación del VIH del SI

Para ellos se usaron factores de activación transcripcionales empleando CRISPR/Cas9 para

estimular la reactivación viral cmo puerta para la terapia combinada a ARTE

8) La eliminación con alta eficacia del ADN proviral del genoma huésped del VIH-1 de
modelos animales en un estudio preclínico:

El resultado fue: que por un lado se aumentó la viabilidad y la eficacia, en cuanto a la

edición del provirus VIH-1 mediante vectores de VAA; y por otro lado, la coordinación
múltiple de ARNg con S.aureus Cas9 (SaCas9)

Para comprobar la eficacia, se editó el genoma con saCas9/ARNg en ratones humanos de

médula ósea, del hígado y del timo (hu-BLT)

Se probó con VIH-1, su origen de infección fue a través de la mucosa vaginal o de

transmisores intraperitoneales

Y mediante un sistema de edición del genoma se obstaculizó la repliación activa del VIH-1
en ratones normales infectados agudamente de EcoHIV 8 (modelo del VIH)

Se eliminó el ADN proviral mediante saCas9/ARNg de tejidos y órganos sólidos; y gracias a

la participación de AAV, se tuvo éxito en ensayos clínicos.

8.2) La combinación del sistema de CRISPR/Cas9 y la utilización de dos ARNg para

apuntar a una célula y degradar el genoma del VIH

Todo esto inhibió la replicación vírica y la evolución del VIH, lo que permitirá en el futuro un
mayor manejo y control

LIMITACIONES

1) Efecto fuera del objetivo de enzimas de edición contribuyó a la inestabilidad

genómica mediante mutaciones y translocaciones cromosómicas
 2) Búsqueda del vector más adecuado y de la solución del vehículo de reparto

CONCLUSIONES

Al año mueren más de 2 millones de personas por lo que el SIDA es una

enfermedad pública de la salud mundial, que además es pandémica

Aún hay que superar muchos desafíos de la terapia frente al SIDA, pero la cura del
``paciente de Berlín´´ (trasplante de células madre, por el que se transfirió el gen mutado
natural de CCR5 y se evitó la entrada en células); de forma que se aumentó la probabilidad
de eficacia de CRISPR/Cas9 contra el VIH-1 en la práctica clínica

MECANISMO

1) Mediante ARTE se hace frente al VIH con gran éxito en la medicina de

finales del siglo XX, pero tiene un límite, y es que es urgente la
producción de medicamentos y de mecanismos anti-VIH de terapia eficaz
para su eliminación

La rutina de ARTE frente a VIH se basa en la edición del genoma mediante

su eliminación, inserción y reemplazo de secuencias de ADN específico, para
ello se emplean nucleasas como ZFN, TALEN o RGEN, que son derivadso
del CRISPR-Cas

CRISPR-CasII deriva de CRISPR-Cas9 y esto es vital para desarroalr

aplicaciones de edición genómica de CCR5 de VIH-1 para células huésped,
aunque no para el caso de aquellas personas que tengan resistencia natural,
es decir, que tengan una mutación natural del gen para el alelo CCR5- 32;
pues en estos individuos, esa mutación inhibe la entrada del VIH a la célula)

La consecuencia es la escisión de su genoma o la eliminación de CCR5

como mecanismos terapeúticos; en los cuales ZFN de forma autoinfundada
permitió la variación en células T CD4

El mecanismo consiste en la edición del genoma de VIH-1, de forma que se

edite el gen CCR5, en el cual sobre PAM de 3 nucleótidos, gracia al ARNg se
apunta específicamente a una secuencia que Cas9 corta, póxima a PAM, y
luego mediante la unión entre extremos por NHEJ y su reemplazo permite la
mutación del CCR5 delta 32.

Por otro lado, la mutación puede ser beneficiosa, activa; o perjudicial,

inactiva, de forma que el VIH siga entrando en la célula.

El VIH afecta al SI, y esta infección tiene tres estados de vulnerabilidad:

aguda, latencia clínica y SIDA

Se ha conseguido disminuir la muerte y morbilidad por SIDA gracias ARTE,

pero no acabar con el reservorio latente, debido a la resistencia a
medicamentos.

CRISPR-Cas9 tiene dos partes:

1) Cas, que es un segmento proteico

 2) 2cARN (I, II y III)

Tipo I: la proteína Cas3 en la célula es un motor proteico que con la

ayuda de la nucleasa, y la formación del complejo Cas-ARNcr;

tiene la consecuencia de que Cas3 sea dirigido al ADN exógeno de forma

que separe las dos hebras y produzca su eliminación

Tipo II: es muy similar, en este caso ARN dirigido permite llegar al ADN
diana y aquí es importante el ARNcr

Tipo III: una explosión del VIH por complejo crARN-tracrARN-Cas9 que
se une al ADN exógeno para su degradación

Los dominios de la nucleasa son HNH (proteína con múltiples dominios y

funciones; permite la edición del genoma con la consecuente mutación
gracias a ARNcr, que tiene 20 secuencias guía de nucleótidos) y RuvC
de Cas9

Además hay un dominio aparte que es PAM (PI)

El ADN no muta gracias al Dominio similar a RuvC

El complejo tracrARN/crARN se forma debido al emparejamiento

complementario de bases, y es guiado para que la Cas9, endonucleasa,
produzca la escisión del ADN diana por complementariedad de bases, y
con la participación de crRNA

Por otro lado, el complejo crRNA y trRNA da lugar al ARNg que escinde
la doble hélice de ADN al guiar a Cas9

RESUMEN FINAL DE MIGUEL (MIS PALABRAS): 512 PALABRAS Y OCUPA UNA CARA
DE WORD

RESUMEN FINAL: MIS PALABRAS

CRISPR-Cas9 es un sistema de reconocimiento y escisión del genoma de VIH-1, que con

los años ha ido aumentando su eficacia, como el caso de la primera persona que se
considera curada del VIH, el paciente de Berlín.

Es un sistema formado por CRISPR, que reconoce específicamente el genoma para que
Cas9, su otro componente, escinda el genoma.
Para que Cas9 actúe, el ARNg guía a esta proteína de edición genética. El corte se hará
próximo a PAM, que tiene 3 nucleótidos, y más tarde, tras el corte, se unirán los extremos
no homólogos gracias a ZNEJ.

Finalmente, habrá 2 resultados posibles: los dos primeros significarán o bien una mutación
activa beneficiosa para el paciente, o bien una inactiva y perjudicial. El resultado esperado
es que se da una mutación del genoma del VIH-1, concretamente del gen CCR5, con el
objetivo de que la célula no sea infectada por el virus, pues de forma natural hay
mutaciones en el alelo CCR5-delta32 que contribuyen a impedir la entrada del VIH-1 en la
célula, en el caso de individuos homocigotos.

Se ha llegado a muchos resultados, como la escisión del genoma del VIH-1, el

silenciamiento de la expresión de ese mismo genoma, por una mutación… También se ha
llegado al caso de la eliminación del ADN proviral.

Entre otras técnicas empleadas destacamos la del uso de otros dominios de nucleasas, los
factores restrictivos de Cas, las células madre pluripotenciales mediante un trasplante o
incluso la eliminación del ADN por separación de sus hebras (gracias al ARN guía y
complejos de ARN para apuntar al ADN diana de degradación). Y no menos importante, la
eliminación de la replicación vírica y obstaculización de la evolución del VIH (pues este
desarrolla resistencia a medicamentos).

Todo esto ha conseguido eliminar la morbilidad y mortalidad del SIDA, que es una
enfermedad de salud pandémica mundial, que mata a más de 2 millones de personas al
año, y que puede encontrarse una infección de VIH en tres estados, uno agudo, otro latente
y el SIDA.

La complicación a superar con técnicas como ARTE para la prevención y tratamiento en

ensayos clínicos busca superar la latencia, que es un reservorio o grupo de inmunocitos que
no producen copias activamente, es decir, el VIH infecta la célula al entrar y se multiplica.

Aunque se está buscando activar mediante factores de transcripción dicha latencia,

abriendo las puertas para una futura terapia genética contra el VIH.

Otras limitaciones han sido el efecto producido fuera del objetivo de la enzima de edición
genética, que provoca inestabilidad genómica tanto a nivel mutacional como a nivel de
translocación cromosómica.

Por otra parte, se está buscando el refinamiento en el uso de vectores adecuados u otras
soluciones de los ``vehículos de reparto´´.

En definitiva, con el resultado aparentemente favorable del paciente de Berlín, y el auge de

esta técnica de edición genética, a pesar de los desafíos en la terapia del SIDA, en el futuro
será probable que CRISPR-Cas9 resulte en un ataque favorable contra la infección del VIH-
1 en la práctica clínica.