FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE MEDICINAHUMANA

GENOMA Y SALUD

INFORME N° 6
Variaciones genéticas del genoma humana yenfermedades

CICLO : VIII

SECCION : MD8T1

GRUPO : PRACTICA 2

DOCENTE : DR. MARCO ANTONIO GALARZA PÉREZ

ALUMNO : WILLIAM WALTER SACIGA SAAVEDRA

MILENA ROSSEMARY VARGAS SERAFIN

2022
TECNOLOGÍAS BASADAS EN EDICIÓN GENÉTICA (CRISPR) CON IMPORTANCIA
EN SALUD

I. INTRODUCCION

La tecnología CRISPR es fruto del estudio del genoma de las bacterias, sabemos que
está compuesto por una única molécula circular, formada por dos cadenas,
constituidas por una secuencia de nucleótidos formados por las bases nitrogenadas
Adenina, Citosina, Guanina y Timina.
CRISPR significa repeticiones palindrómicas cortas de secuencias de bases
nitrogenadas. Tras cada repetición se encuentran segmentos cortos de ADN
espaciador proveniente de exposiciones previas a un virus bacteriófago. Muy cerca
de estas repeticiones se pueden encontrar los genes CAS que codificaban para un
tipo de proteínas nucleasas.

El CRISPR se configura como un sistema de defensa en la bacteria para evitar el

ataque de los virus y además como un sistema de almacenamiento de información
sobre los virus para que las futuras generaciones de la bacteria también puedan
defenderse de igual forma de sus atacantes. Para ello cuando el virus inyecta su ARN
en la bacteria, las proteínas Cas son capaces de cortar una pequeña parte del ADN
viral, modificarlo e integrarlo dentro de su ADN en el conjunto de secuencias CRISPR.
Los virus también han sido capaces de desarrollar su propio sistema CRISPR-Cas
para poder atacar a las bacterias, por lo que una vez que se conoce el funcionamiento
del sistema en las bacterias y comienza a utilizarse con aplicaciones terapéuticas, se
podría hacer lo mismo con los virus. El CRISPR permite a los investigadores cortar y
pegar secuencias de ADN.

Primero, los científicos componen un conjunto de letras genéticas o “ARN guía” que,
igual que los fragmentos originales del código viral, reconoce un tramo específico del
ADN entre los millones de letras A, T, G y C del genoma.
Luego, se introduce en la célula diana esta secuencia guía junto con una enzima
similar a Cas9, que coincide con el texto correspondiente y lo abren. Los científicos
usan este mecanismo para borrar, mutar, insertar o reparar secuencias genómicas de
ADN en células, animales y seres humanos.

En Medicina gracias a la tecnología CRISPR se podrá desarrollar la terapia génica en

la que además de identificar los genes responsables de alteraciones genéticas, estos
genes podrán ser reemplazados, corregidos y eliminados en el paciente, permitiendo
el tratamiento y prevención de enfermedades hereditarias. Algo que ya se está
haciendo a nivel de ensayos en animales de laboratorio y células humanas, pero que
en pocos años podrá aplicarse directamente sobre las propias personas.

II. OBJETIVOS

 Conocer La tecnología CRISPR y su importancia en la salud.

 Reconocer los polimorfismos que hacen susceptible o resistente a

 desarrollar una enfermedad.

III. MATERIALES

 Laptop
 Internet
 Cuaderno y lapiceros.
 Artículos científicos

IV. PROCEDIMIENTO:
Se expone el artículo científico asignado, se responden preguntas
despejando las dudas respectivas.
Se desarrolla el cuestionario

RESUMEN ARTICULO

La aplicación CRISPR–Cas9 brinda una forma flexible, cómoda y precisa para la

edición del genoma. Cas9, típicamente estreptococos pyogenes Cas9 (SpCas9)
, registra un motivo inmediato al protoespaciador (PAM) aguas arriba o aguas
debajo de la secuencia objetivo mediante el uso de un ARN guía e induce roturas
de doble cadena en el ADN objetivo. Esta aplicación clínica de la edición CRISPR
no ha sido del todo clara, ya que CRISPR-Cas9 podría causar genotoxicidad,
incluidos en sitios de escisión del genoma fuera del objetivo, translocaciones
cromosómicas u otros cambios complejos, lo que puede tener consecuencias
impredecibles. En algunos ensayos clínicos (piloto) nuevos que utilizaron células
madre editadas con CRISPR y células T, con múltiples genes en el tratamiento
del VIH/SIDA y el cáncer, incluidos el mieloma múltiple y el sarcoma, respaldan
la seguridad y la viabilidad de CRISPR-Cas9 en la clínica.

V. METODOS

 Diseño del estudio y pacientes

Ensayo clínico de fase I con aumento de dosis con cuatro cohortes.

En la cohorte pre-A, el objetivo es garantizar la seguridad de las células T editadas
con CRISPR en humanos, se tiene una muestra de dos pacientes que recibieron 2
x 107células T editadas por kg de peso corporal y fueron monitoreados
cuidadosamente durante un periodo de 28 días.

Después de corroborar que no existía toxicidad significativa, se inició con la

inscripción en el estudio de escalada de dosis de tres cohortes A,B y C. Aquí se
tiene una muestra de 3 pacientes para cada cohorte, cada paciente recibió
1×107,2x107 o 4 x 107 células T por Kg en una serie de tres infusiones en los días
1,3 y 5 respectivamente. Teniendo la primera infusión un 20% del numero total de
células, segunda infusión 30% y por último, la tercera infusión un 50% de células.
Hubo una correlación de días, con la siguiente descripción

 Tres días antes de la primera infusión, se administró

ciclofosfamida (20 mg x kg ) para la depleción de linfocitos.
 En el día 28 desde la primera infusión de células T, y en
ausencia de toxicidad importante o progresión de la
enfermedad, se administraría el ciclo 2 de la infusión de células
T modificadas genéticamente, pero sin infusión de
ciclofosfamida. Si los pacientes obtuvieran beneficio clínico,
recibirían tratamiento continuo hasta toxicidad inaceptable o
retiro del consentimiento, o progresión de la enfermedad.

La toxicidad inaceptable es un síndrome de liberación de citocinas de grado ≥3, así

como AE de grado ≥2 que requirieron terapia con glucocorticoides sistémicos;
además, los pacientes serían retirados en caso de cualquier AE, anormalidad de
laboratorio o enfermedad intercurrente que los investigadores juzgaron conduciría
a un gran riesgo clínico en los pacientes.

Los pacientes elegibles para el tester tenían entre 18 y 70 años y tenían NSCLC
en estadio IIIB o IV confirmado histológica o citológicamente. Otros criterios de
inclusión importantes incluyeron la progresión de la enfermedad después de tres o
más terapias sistémicas (incluyendo al menos una terapia molecular dirigida para
pacientes con mutación activadora de EGFR o ALK).

Las muestras de la nueva biopsia se recogieron para el análisis exploratorio en los

momentos antes del tratamiento, medio año y 1 año después del tratamiento, y en
la progresión del tumor si era clínicamente factible y estaba de acuerdo con los
pacientes. Los criterios de exclusión clave fueron la metástasis cerebral y la
compresión de la médula espinal que no estaban controladas, la enfermedad
autoinmune activa, el tratamiento con otros inmunomoduladores dentro de los 28
días anteriores al estudio y la inmunodeficiencia. Los criterios de elegibilidad
completos se proporcionan en el protocolo del estudio (Protocolo de ensayo clínico
complementario).

Los pacientes se inscribieron desde el 26 de agosto de 2016 hasta el 21 de marzo

de 2018.
 Estudio de los puntos finales y evaluaciones

Los criterios de valoración principales de este estudio de aumento de dosis de fase

I incluyeron la seguridad y la viabilidad.
La viabilidad se definió por la posibilidad de fabricar células T editadas suficientes
y viables (> 90 %) a partir de la mayoría (> 50 %) de los pacientes inscritos.
Los criterios de valoración secundarios incluyeron:
 Tasa de respuesta objetiva.
 Tasa de control de la enfermedad a las 8 semanas
 SLP
 Supervivencia general.
Otros objetivos exploratorios incluyeron el seguimiento in vivo de las células T
editadas, la diversidad y la dinámica de los clones de TCR en PBMC y las muestras
tumorales de nueva biopsia (si están disponibles) y sus posibles correlaciones
entre los resultados de eficacia.
Todos los pacientes se sometieron a una evaluación inicial del tumor, incluida la
evaluación mejorada con contraste, TEM y RMN del cerebro, dentro de los 28 días
antes del primer tratamiento.
Las respuestas tumorales se evaluaron utilizando los Criterios de Evaluación de
Respuesta en Tumores Sólidos en las semanas 8 y 12. Posteriormente, las
respuestas tumorales se evaluaron cada 8 semanas hasta la progresión de la
enfermedad o la muerte.

Los EA se monitorearon y calificaron durante 24 meses después de la última

infusión de células o hasta que el paciente se perdió durante el seguimiento. Las
DLT se definieron como eventos que ocurrieron dentro de los primeros 28 días
después de la primera infusión de células que requirieron la administración de
glucocorticoides sistémicos a los pacientes, toxicidades autoinmunes de grado ≥2
o cualquier otro evento de grado ≥3, que probablemente se atribuyó a la terapia
con células T. Los investigadores determinaron la asociación de los AE con el
tratamiento.

 Construcción de plásmidos CRISPR

Para interrumpir PD-1 en células T humanas, se diseñan un par de sgRNA

específicamente sgRNA1 y sgRNA2, que muestran la mayor eficiencia de edición
en la línea de células 293 T, para apuntar al exón 2 de PD-1. El vector de expresión
Cas9 pST1374-Cas9 (Addgene) se construyó como se describió previamente.

En el estudio se utilizó S. pyogenes Cas9 (SpCas9). Para la construcción del vector

sgRNA, el vector único pGL3-hPD1 que contiene dos sgRNA se construyó de la
siguiente manera.

 Los oligos para la generación de sgRNA se sintetizaron y

recocieron para formar sgDNA.
 Posteriormente, el vector pGL3-dual U6 sgRNA scaffold-
PGK-Puro se escindió usando endonucleasas de restricción
 Finalmente, los sgDNA se clonaron uno por uno en los sitios
 BsaI o BbsI del vector pGL3-dual U6 sgRNA scaffold-PGK-
Puro, formando vectores de expresión de sgRNA duales en
tándem. El vector pGL3-dual U6 sgRNA scaffold-PGK-puro
se modificó a partir del vector pGL3-U6 sgRNA scaffold-
PGK-puro (Addgene).

 Preparación de células T editadas con PD-1

Las células T editadas con PD-1 se fabricaron en MedGenCell (Chengdu, China).

Las PBMC se aislaron de 60 a 80 ml de sangre periférica de pacientes con NSCLC
antes de cada ciclo de tratamiento mediante centrifugación en un gradiente de
densidad de Ficoll.
Se transfectaron aproximadamente de 5 a 10 × 106 células mediante tecnología de
electroporación con los plásmidos previstos utilizando un dispositivo Nucleofector
2b y el kit Nucleofector de células T humanas VPA-1002. Después de la
electroporación, las células se Re suspendieron en medio X-VIVO15,contenía
suero autólogo al 10 % con IFN-ÿ (2000 UIml-1 ) y ADNasa (3 ugml-1 ) el día 1, y se
cultivaron con anticuerpo anti-CD3 (0,4 ugml-1), anticuerpo anti-CD28 (0,4 ugmlÿ1
) e interleucina-2 (IL-2) (1000 UIml-1 ) desde el día 2 a 37 °C en una incubadora
con CO2 al 5 %. El medio de cultivo celular se reemplazó a la mitad cada 2 o 3
días.
El primer y segundo ciclo de infusión de células se llevaron a cabo en la sala de
ensayos clínicos de fase I en el West China Hospital, y las infusiones posteriores
se administraron en la sala de hospitalización del West China Hospital.

 Ensayo de escisión de T7E1 y secuenciación.

El ADN genómico se extrajo con fenol-cloroformo y se precipitó con alcohol.
Posteriormente, los fragmentos seleccionados de PD-1 se amplificaron por PCR a
partir de ADN genómico usando rTaq (Takara), y los productos de PCR se
purificaron con un kit de limpieza de PCR (Axygen). Las secuencias de los
cebadores para la PD-1 humana son GTGGTGACCGAAGGGGACA (F) y
GGATGACGTTACCTCGTGCG (R) de 5’ a 3’. Los productos de PCR purificados
se desnaturalizaron y se reasociaron en NEBuffer 2 utilizando el termociclador
Veriti (Applied Biosystems). Los productos de PCR hibridados se digirieron con
T7E1 (NEB) durante 30 minutos y se separaron en geles de agarosa al 2 %. Los
productos de PCR purificados se ligaron con el vector pEASY-T1 (TransGen
Biotech). Los productos de ligación se usaron para la transformación y se
secuenciaron 50 colonias por transformación usando el cebador universal M13F.
Para predecir posibles sitios fuera del objetivo, analizamos todo el genoma humano
con la herramienta web Cas-OFFinder (v.2.4, http://www.rgenome.net/cas-
offinder/).

 Detección de sitios fuera de objetivo por NGS

Los 18 sitios principales (es decir, la mayor similitud con la secuencia de PD-1
objetivo se consideraron sitios potenciales fuera del objetivo. Brevemente, el ADN
genómico se aisló de células T editadas con PD-1 con un kit de ácido nucleico
circulante Qiagen. El oligonucleótido puente también se diseñó con un código
NNNNNNN de 7 pb y se sintetizó como una mezcla de moléculas degeneradas.
Las regiones seleccionadas dentro de las moléculas monocatenarias circularizadas
se amplificaron mediante PCR inversa utilizando pares de cebadores ubicados a
una distancia de 16 a 29 pb.

 Validación de eficiencia y seguimiento in vivo de células T editadas

Realizamos ensayos de NGS dirigidos al gen PD-1 en ADN genómico
aislado de células T editadas y PBMC con el kit QIAamp DNA Blood Mini
(Qiagen), y la concentración de ADN se midió con el kit de ensayo Qubit
dsDNA HS (Invitrogen). A partir de entonces, las regiones genómicas de
PD-1 se amplificaron mediante PCR con cebadores homólogos a la región
de interés y los adaptadores directos e inversos de Illumina apropiados.
En resumen, varios pasos, incluida la demultiplexación de las lecturas de
secuenciación por parte de MiSeq. Reporter (Illumina), se completó la
alineación de secuencias mediante una versión modificada del script
MATLAB y el algoritmo Smith-Waterman y la conversión de bases (<30 de
puntuación de calidad) a N. Luego, las indeles fueron cuantificadas por el
script de MATLAB. Después de filtrar las lecturas, se contaron los eventos
de inserción o eliminación de al menos 2 pb dentro de los 30 pb aguas arriba
o aguas abajo del sitio de escisión Cas9. Finalmente, la proporción de
lecturas de mutación a lecturas de secuenciación se calculó como la
frecuencia de edición de PD-1 de células T y PBMC editadas.

 Tinción inmunohistoquímica.

Para la tinción inmunohistoquímica, los tumores se fijaron en formaldehído

tamponado con fosfato al 10 %, se incluyeron en parafina y se seccionaron.
Se cortaron tejidos embebidos en parafina y fijados en formalina en
secciones de 4 ÿm de espesor y se colocaron en portaobjetos con carga
positiva. Los portaobjetos se calentaron a 65 °C durante la noche y luego
se desparafinaron en xileno, se hidrataron con alcoholes graduados y agua,
se pretrataron con microondas en tampón Tris-EDTA y se trataron las
peroxidasas endógenas con peróxido de hidrógeno al 3 % en PBS.
Posteriormente, se realizó inmunotinción incubando con anticuerpos
primarios dirigidos contra CD3, CD8 o CD68 (PGM-1) (1:100, Dako) durante
la noche a 4 °C. Luego, los portaobjetos se incubaron con reactivo de
anticuerpo secundario marcado con enzima (Dako) durante 45 min a
temperatura ambiente, seguido de la detección ultraView DAB en un
instrumento Ventana Ultra.
 Los portaobjetos se analizaron con un microscopio óptico (Olympus) y se
analizaron con el software ImageJ.

 Análisis estadístico

Usamos el método de Kaplan-Meier para resumir las variables de tiempo

hasta el evento, incluida la SLP y la supervivencia general. La SLP se define
como el tiempo desde la fecha de la primera infusión de células T editada
hasta la fecha de progresión de la enfermedad o muerte por cualquier
motivo. La supervivencia general es la duración desde la fecha de la primera
infusión de células T editada hasta la fecha de la muerte por cualquier
motivo. Un sujeto que no había experimentado progresión de la enfermedad
antes de la fecha de corte fue censurado en la última fecha de evaluación
de la enfermedad. Los sujetos vivos hasta la fecha de corte fueron
censurados en el último momento en el que se supo que estaban vivos para
el análisis de supervivencia global.
La producción de IFN-ÿ se comparó entre las células T pre y posteditadas
utilizando la prueba t pareada de dos colas.
La diversidad de TCR se comparó entre pacientes y donantes sanos con la
prueba de suma de rangos de Wilcoxon de dos colas. La densidad de tinción
inmunohistoquímica se semicuantificó mediante el software. La significación
estadística se fijó en Pÿ0,05 (bilateral). Todos los demás análisis, incluidos
los de EA, eficacia y datos inmunológicos, fueron descriptivos. Todos los
análisis se realizaron con Prism, v.7.0 (GraphPad) o SPSS, v.22.

VI. RESULTADOS

El estudiante de Medicina estará familiarizado con conceptos básicos de

Tecnologías basadas en edición genética (CRISPR) con importancia en
Salud.
VII. CONCLUSIONES

 El desarrollo de un método de edición genética basado en el sistema CRISPR

resalta la importancia de la investigación básica, ya que sus principios son los
mecanismos de replicación y reparación del DNA.
 Actualmente, la posibilidad para modificar genomas tanto de organismos
procariotas como eucariotas mediante este sistema parece ser ilimitada, lo que
a su vez, abre una gran diversidad de posibles aplicaciones médicas y
biotecnológicas, mismas que ya se están explorando, como es el caso del
diseño de terapias contra una gran cantidad de enfermedades, incluyendo las
infecciones bacterianas.

VIII. CUESTIONARIO

a) Describa los sistemas CRISPR-Cas disponibles en la actualidad y su

uso de cada uno en la edición genética para el tratamiento de
enfermedades.

Según Chávez (1), Hasta el momento se han clasificado seis tipos distintos
de sistemas CRISPR/Cas (I-VI) fundados en el mecanismo molecular que
emplean para el reconocimiento del ADN y la forma en que se unen al mismo
(1) .

Hernández acota (2). Existe gran diversidad entre los sistemas CRISPR/Cas
descritos en cuanto a la composición de proteínas, arquitectura del locus,
estructura del complejo efector y su mecanismo de acción. La Clase I
contiene complejos de efectores con múltiples subunidades mientras que en
la Clase II las funciones del complejo efector son realizadas por una única
proteína multidominios de gran tamaño como es Cas9. La Clase I contiene
los sistemas de tipo I que son más comunes y diversos, los sistemas de tipo
III más abundantes en arqueas, así como los sistemas de tipo IV que carecen
del módulo de adaptación. La Clase II incluye los bien caracterizados
sistemas de tipo II que incluyen la endonucleasa efectora Cas9, utilizada
ampliamente en la edición de genomas (2).

Además, contiene los sistemas de tipo V que han sido probados

experimentalmente e incluyen las proteínas efectoras Cas12a–e. Estas
proteínas poseen un dominio RuvC que corta la simple cadena de ADN,
excepto Cas12a (también Cpf1) que tiene además un dominio catalítico que
participa en el procesamiento del pre-crARN. Por otra parte, los sistemas
efectores de tipo VI contienen dos dominios HEPN de posible actividad
RNAsa. La descripción de sistemas que no se ajustan a la clasificación
anterior indica que aún existen nuevos tipos y subtipos por clasificar (2).

Lagunas sustenta (3). En la rama de la medicina, la edición del genoma es

de gran interés e importancia para la prevención y el tratamiento de diversas
 enfermedades. En la actualidad, con el sistema CRISPR/Cas se está
examinando una extensa variedad de padecimientos, incluidos los trastornos
de un solo gen, como la fibrosis quística, la hemofilia y la enfermedad de
células falciformes (con forma de media luna). Esto es prometedor para el
tratamiento y la prevención de afecciones más complejas, como el cáncer,
los padecimientos cardiacos, las enfermedades mentales y la infección por
el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) (3).
Con el sistema CRISPR/Cas se han transformado genéticamente ciertos
mosquitos para que no puedan transmitir la malaria; también se ha
experimentado en cerdos para que sus tejidos sean compatibles con los del
ser humano; asimismo, se ha utilizado en bacterias para la identificación de
cepas y para estudiar los mecanismos y genes relacionados con la
resistencia a los antibióticos. Asimismo, estas implicaciones médicas, el
sistema CRISPR/Cas también se puede utilizar para mejorar los alimentos
que consumimos y modificar las bacterias y otros microorganismos de uso
industrial y alimentario. El sistema CRISPR/Cas se ha implementado para
luchar contra las enfermedades que atacan a las plantas y los animales de
los que nos alimentamos, lo cual conlleva reducir el uso de fertilizantes y
hormonas, mejorarlos para que su consumo pueda resultar más favorecedor.
Otro ejemplo importante es en S. thermophilus, una bacteria muy utilizada
en la elaboración de quesos y yogur, la cual se modificó para protegerla de
los virus que pudieran dañarla, y así asegurar su producción o incluso
aumentarla. (3).

b) Describa el uso de ARN de interferencia en el tratamiento de

enfermedades.

Según Nakamura, Esparza , Garrido, Palomar, Gallardo (4), el ARN de

interferencia (ARNi) es una respuesta biológica conservada al ARN de doble
cadena (dsARN) que otorga resistencia a los ácidos nucleicos patógenos y
regula la expresión génica. El mecanismo puede haber evolucionado para
interrumpir la replicación viral o la actividad del transposón o para responder a
otras formas inapropiadas de expresión génica. se usa actualmente para reducir
la actividad de un gen específico. Por tratarse de un mecanismo biológico
presente en las células de muchos organismos, incluidos los humanos,
representa una estrategia nueva y muy específica para inhibir fisiológicamente
la expresión de un gen determinado (4). A pesar que el mecanismo de RNAi es
un descubrimiento nuevo, se ha utilizado para prevenir la expresión de genes
específicos que causan enfermedades, y las tecnologías modernas para su
aplicación en la vida están en constante desarrollo. Los efectos de la inhibición
de genes que causan diversas enfermedades ya han sido analizados en modelos
animales e in vitro. Recientemente, se ha demostrado que el dsRNA se puede
usar en animales vivos para prevenir infecciones virales de virus invasivos.Estos
hallazgos han planteado la posibilidad de usar fragmentos de dsRNA como
vacunas antivirales y marcaron el comienzo de una nueva era de medicamentos
antivirales puede significar tratamiento (4).
 Un ejemplo, el siARNs en enfermedades metabólicas se utiliza para estudiar el
papel de diferentes genes en la patogénesis de la diabetes y la obesidad. Uno
de los intentos para usar la tecnología del ARNi en enfermedades metabólicas
fue investigar las vías de señalización de la insulina. La señalización de insulina
es un mecanismo requerido para la homeostasis de glucosa. Dentro de las
principales vías metabólicas reguladas por insulina se encuentra la inhibición de
la gluconeogénesis en hígado y la estimulación del transporte de glucosa en
músculo y tejido adiposo. Otro grupo diseñó la estrategia de inducir
silenciamiento postranscripcional del gen para PEPCK, la enzima que controla
la gluconeogénesis utilizando siARNs clonados en vector, obteniendo una
disminución considerable de los niveles de glucosa en sangre, mejorando la
tolerancia a glucosa, así como la disminución de ácidos grasos y triglicéridos en
ratones.Estos datos validan a la PEPCK como un blanco para la terapia génica
de la diabetes. Un enfoque diferente fue a través de la administración de siARNs
dirigidos contra el ARN mensajero de la apolipoproteína B (Apo B) en hígado, y
se obtuvo una disminución en los niveles de dicha proteína en plasma.Apo B es
una proteína involucrada en el metabolismo de colesterol. Las concentraciones
en sangre de dicha proteína están relacionadas con las concentraciones de
colesterol y los altos niveles de ambos se asocian con un alto riesgo de
enfermedades coronarias. Además, se observó que la inyección intravenosa de
siARNs contra ApoB resultó en una disminución de los niveles de colesterol en
sangre comparado con los resultados observados en ratones, en el cual el gen
de la apolipoproteína había sido deletado (4).

c) Describir el uso de la tecnología CART T cells en el tratamiento de

leucemias.

La terapia de células T con receptores quiméricos de antígenos (CAR-T) es

una manera de hacer que las células inmunitarias llamadas células T luchen
contra el cáncer al alterarlas en el laboratorio para que puedan encontrar y
destruir a las células cancerosas, también es en ocasiones referida como un
tipo de terapia génica celular debido a que involucra la alteración de los genes
dentro de las células T para ayudar a combatir el cáncer. (5)
El sistema inmunitario reconoce sustancias extrañas en el cuerpo mediante
la búsqueda de proteínas llamadas antígenos en la superficie de esas células.
Las células inmunitarias llamadas células T tienen sus propias proteínas
llamadas receptores que se unen a antígenos extraños y ayudan a provocar
que otras partes del sistema inmunitario destruyan a la sustancia extraña.
En las terapias de células CAR-T, las células T son obtenidas de la sangre
del paciente y se alteran en el laboratorio al añadirles un gen con un receptor
(llamado receptor quimérico de antígenos o CAR) el cual ayuda a las células
T adherirse a un antígeno en específico de las células cancerosas. Luego, las
células CAR-T son regresadas al paciente.
Las terapias de células CAR-T para tratar estos cánceres están diseñadas
para adherirse al antígeno CD-19 y no funcionarán contra un cáncer que no
 contenga el antígeno CD19.(6)

d) Describa el uso de la tecnología de ADN recombinante en el tratamiento

de las enfermedades.

La tecnología del ADN recombinante ha permitido la manipulación de la

información genética de cualquier tipo de organismo, por lo que al día de hoy
se han presentado grandes avances en cuanto a su desarrollo y aplicación en
otras ramas, siendo una herramienta primordial en la creación de alternativas
médicas para el control y prevención de enfermedades, tal es el caso de la
obtención de la insulina recombinante humana que utiliza esta tecnología
para tener un mayor rendimiento en la producción, así como para evitar las
reacciones adversas que se presentaban con los productos obtenidos de
origen animal. Por tal motivo, es importante comprender esta tecnología ya
que con ello se han abierto las puertas a la producción de medicamentos y
enzimas que pueden ayudar al tratamiento terapéutico de múltiples
enfermedades.(6)

Mutaciones en el gen que codifica para globina β que dan por resultado
talasemia β.

El gen que codifica para la globina β se muestra en la orientación-5′ a 3′.

Las áreas con trama indican las regiones 5′ y 3′ no traducidas. Leyendo
desde la dirección 5′ hacia la 3′, las áreas sombreadas son los exones 1 a
3, y los espacios claros son los intrones 1 (I1) y 2 (I2). Las mutaciones que
afectan el control de la transcripción (•) están localizadas en el DNA de la
región 5′ flanqueante.

Se han identificado ejemplos de mutaciones sin sentido, mutaciones en

el procesamiento del RNA y mutaciones de división de RNA y se indican.
En algunas regiones se han hallado muchas mutaciones distintas, lo cual
se representa por el tamaño y localización de los corchetes.

Enfermedad de células falciformes

Produce por mutación de una base única de las 3 × 10 en el genoma, una

sustitución de T a A en el DNA, que a su vez suscita un cambio de A a U en
el mRNA que corresponde al sexto codón del gen que codifica para la
globina β. El codón alterado específica para un aminoácido diferente (valina
en lugar de ácido glutámico), y esto produce una anormalidad estructural de
la molécula de globina β lo queconduce a agregación de hemoglobina y que
los eritrocitos se conviertan en falciformes.
 III . REFERENCIA BIBLIOGRAFICA:

Chávez-Jacobo VM. El sistema de edición genética CRISPR/Cas y su uso como

antimicrobiano específico. TIP [Internet]. 2018 [citado el 28 de METODOS

 Diseño del estudio y pacientes

Ensayo clínico de fase I con aumento de dosis con cuatro cohortes.

En la cohorte pre-A, el objetivo es garantizar la seguridad de las células T editadas con
CRISPR en humanos, se tiene una muestra de dos pacientes que recibieron 2 x 107células T
editadas por kg de peso corporal y fueron monitoreados cuidadosamente durante un periodo
de 28 días.

Después de corroborar que no existía toxicidad significativa, se inició con la inscripción en

el estudio de escalada de dosis de tres cohortes A,B y C. Aquí se tiene una muestra de 3
pacientes para cada cohorte, cada paciente recibió 1×107,2x107 o 4 x 107 células T por Kg en
una serie de tres infusiones en los días 1,3 y 5 respectivamente. Teniendo la primera infusión
un 20% del numero total de células, segunda infusión 30% y por último, la tercera infusión
un 50% de células. Hubo una correlación de días ,con la siguiente descripción

 Tres días antes de la primera infusión, se administró ciclofosfamida (20

mg x kg ) para la depleción de linfocitos.
 En el día 28 desde la primera infusión de células T, y en ausencia de
toxicidad importante o progresión de la enfermedad, se administraría el
ciclo 2 de la infusión de células T modificadas genéticamente, pero sin
infusión de ciclofosfamida. Si los pacientes obtuvieran beneficio clínico,
recibirían tratamiento continuo hasta toxicidad inaceptable o retiro del
consentimiento, o progresión de la enfermedad.

La toxicidad inaceptable es un síndrome de liberación de citocinas de grado ≥3, así como AE

de grado ≥2 que requirieron terapia con glucocorticoides sistémicos; además, los pacientes
serían retirados en caso de cualquier AE, anormalidad de laboratorio o enfermedad
intercurrente que los investigadores juzgaron conduciría a un gran riesgo clínico en los
pacientes.

Los pacientes elegibles para el tester tenían entre 18 y 70 años y tenían NSCLC en estadio
IIIB o IV confirmado histológica o citológicamente. Otros criterios de inclusión importantes
incluyeron la progresión de la enfermedad después de tres o más terapias sistémicas
(incluyendo al menos una terapia molecular dirigida para pacientes con mutación activadora
de EGFR o ALK).

Las muestras de la nueva biopsia se recogieron para el análisis exploratorio en los momentos
antes del tratamiento, medio año y 1 año después del tratamiento, y en la progresión del tumor
si era clínicamente factible y estaba de acuerdo con los pacientes. Los criterios de exclusión
clave fueron la metástasis cerebral y la compresión de la médula espinal que no estaban
 controladas, la enfermedad autoinmune activa, el tratamiento con otros inmunomoduladores
dentro de los 28 días anteriores al estudio y la inmunodeficiencia. Los criterios de elegibilidad
completos se proporcionan en el protocolo del estudio (Protocolo de ensayo clínico
complementario).

Los pacientes se inscribieron desde el 26 de agosto de 2016 hasta el 21 de marzo de 2018.

 Estudio de los puntos finales y evaluaciones

Los criterios de valoración principales de este estudio de aumento de dosis de fase I

incluyeron la seguridad y la viabilidad.
La viabilidad se definió por la posibilidad de fabricar células T editadas suficientes y viables
(> 90 %) a partir de la mayoría (> 50 %) de los pacientes inscritos.
Los criterios de valoración secundarios incluyeron:
 Tasa de respuesta objetiva.
 Tasa de control de la enfermedad a las 8 semanas
 SLP
 Supervivencia general.
Otros objetivos exploratorios incluyeron el seguimiento in vivo de las células T editadas, la
diversidad y la dinámica de los clones de TCR en PBMC y las muestras tumorales de nueva
biopsia (si están disponibles) y sus posibles correlaciones entre los resultados de eficacia.
Todos los pacientes se sometieron a una evaluación inicial del tumor, incluida la evaluación
mejorada con contraste, TEM y RMN del cerebro, dentro de los 28 días antes del primer
tratamiento.
Las respuestas tumorales se evaluaron utilizando los Criterios de Evaluación de Respuesta
en Tumores Sólidos en las semanas 8 y 12. Posteriormente, las respuestas tumorales se
evaluaron cada 8 semanas hasta la progresión de la enfermedad o la muerte.

Los EA se monitorearon y calificaron durante 24 meses después de la última infusión de

células o hasta que el paciente se perdió durante el seguimiento. Las DLT se definieron como
eventos que ocurrieron dentro de los primeros 28 días después de la primera infusión de
células que requirieron la administración de glucocorticoides sistémicos a los pacientes,
toxicidades autoinmunes de grado ≥2 o cualquier otro evento de grado ≥3, que probablemente
se atribuyó a la terapia con células T. Los investigadores determinaron la asociación de los
AE con el tratamiento.

 Construcción de plásmidos CRISPR

Para interrumpir PD-1 en células T humanas, se diseñan un par de sgRNA específicamente

sgRNA1 y sgRNA2, que muestran la mayor eficiencia de edición en la línea de células 293
T, para apuntar al exón 2 de PD-1. El vector de expresión Cas9 pST1374-Cas9 (Addgene) se
construyó como se describió previamente.

En el estudio se utilizó S. pyogenes Cas9 (SpCas9). Para la construcción del vector sgRNA,
el vector único pGL3-hPD1 que contiene dos sgRNA se construyó de la siguiente manera.
  Los oligos para la generación de sgRNA se sintetizaron y recocieron
para formar sgDNA.
 Posteriormente, el vector pGL3-dual U6 sgRNA scaffold-PGK-Puro
se escindió usando endonucleasas de restricción
 Finalmente, los sgDNA se clonaron uno por uno en los sitios BsaI o
BbsI del vector pGL3-dual U6 sgRNA scaffold-PGK-Puro,
formando vectores de expresión de sgRNA duales en tándem. El
vector pGL3-dual U6 sgRNA scaffold-PGK-puro se modificó a
partir del vector pGL3-U6 sgRNA scaffold-PGK-puro (Addgene).

 Preparación de células T editadas con PD-1

Las células T editadas con PD-1 se fabricaron en MedGenCell (Chengdu, China).

Las PBMC se aislaron de 60 a 80 ml de sangre periférica de pacientes con NSCLC antes de
cada ciclo de tratamiento mediante centrifugación en un gradiente de densidad de Ficoll.
Se transfectaron aproximadamente de 5 a 10 × 106 células mediante tecnología de
electroporación con los plásmidos previstos utilizando un dispositivo Nucleofector 2b y el
kit Nucleofector de células T humanas VPA-1002. Después de la electroporación, las células
se Re suspendieron en medio X-VIVO15,contenía suero autólogo al 10 % con IFN-ÿ (2000
UIml-1 ) y ADNasa (3 ugml-1 ) el día 1, y se cultivaron con anticuerpo anti-CD3 (0,4 ugml-1),
anticuerpo anti-CD28 (0,4 ugmlÿ1 ) e interleucina-2 (IL-2) (1000 UIml-1 ) desde el día 2 a 37
°C en una incubadora con CO2 al 5 %. El medio de cultivo celular se reemplazó a la mitad
cada 2 o 3 días.
El primer y segundo ciclo de infusión de células se llevaron a cabo en la sala de ensayos
clínicos de fase I en el West China Hospital, y las infusiones posteriores se administraron en
la sala de hospitalización del West China Hospital.

 Ensayo de escisión de T7E1 y secuenciación.

El ADN genómico se extrajo con fenol-cloroformo y se precipitó con alcohol.
Posteriormente, los fragmentos seleccionados de PD-1 se amplificaron por PCR a partir de
ADN genómico usando rTaq (Takara), y los productos de PCR se purificaron con un kit de
limpieza de PCR (Axygen). Las secuencias de los cebadores para la PD-1 humana son
GTGGTGACCGAAGGGGACA (F) y GGATGACGTTACCTCGTGCG (R) de 5’ a 3’. Los
productos de PCR purificados se desnaturalizaron y se reasociaron en NEBuffer 2 utilizando
el termociclador Veriti (Applied Biosystems). Los productos de PCR hibridados se digirieron
con T7E1 (NEB) durante 30 minutos y se separaron en geles de agarosa al 2 %. Los productos
de PCR purificados se ligaron con el vector pEASY-T1 (TransGen Biotech). Los productos
de ligación se usaron para la transformación y se secuenciaron 50 colonias por transformación
usando el cebador universal M13F.
Para predecir posibles sitios fuera del objetivo, analizamos todo el genoma humano con la
herramienta web Cas-OFFinder (v.2.4, http://www.rgenome.net/cas-offinder/).

 Detección de sitios fuera de objetivo por NGS

Los 18 sitios principales (es decir, la mayor similitud con la secuencia de PD-1 objetivo se
consideraron sitios potenciales fuera del objetivo. Brevemente, el ADN genómico se aisló de
células T editadas con PD-1 con un kit de ácido nucleico circulante Qiagen. El
oligonucleótido puente también se diseñó con un código NNNNNNN de 7 pb y se sintetizó
como una mezcla de moléculas degeneradas. Las regiones seleccionadas dentro de las
moléculas monocatenarias circularizadas se amplificaron mediante PCR inversa utilizando
pares de cebadores ubicados a una distancia de 16 a 29 pb.

 Validación de eficiencia y seguimiento in vivo de células T editadas

Realizamos ensayos de NGS dirigidos al gen PD-1 en ADN genómico aislado de
células T editadas y PBMC con el kit QIAamp DNA Blood Mini (Qiagen), y la
concentración de ADN se midió con el kit de ensayo Qubit dsDNA HS (Invitrogen).
A partir de entonces, las regiones genómicas de PD-1 se amplificaron mediante PCR
con cebadores homólogos a la región de interés y los adaptadores directos e inversos
de Illumina apropiados.
En resumen, varios pasos, incluida la demultiplexación de las lecturas de
secuenciación por parte de MiSeq. Reporter (Illumina), se completó la alineación de
secuencias mediante una versión modificada del script MATLAB y el algoritmo
Smith-Waterman y la conversión de bases (<30 de puntuación de calidad) a N. Luego,
las indeles fueron cuantificadas por el script de MATLAB. Después de filtrar las
lecturas, se contaron los eventos de inserción o eliminación de al menos 2 pb dentro
de los 30 pb aguas arriba o aguas abajo del sitio de escisión Cas9. Finalmente, la
proporción de lecturas de mutación a lecturas de secuenciación se calculó como la
frecuencia de edición de PD-1 de células T y PBMC editadas.

 Tinción inmunohistoquímica.

Para la tinción inmunohistoquímica, los tumores se fijaron en formaldehído

tamponado con fosfato al 10 %, se incluyeron en parafina y se seccionaron. Se
cortaron tejidos embebidos en parafina y fijados en formalina en secciones de 4 ÿm
de espesor y se colocaron en portaobjetos con carga positiva. Los portaobjetos se
calentaron a 65 °C durante la noche y luego se desparafinaron en xileno, se hidrataron
con alcoholes graduados y agua, se pretrataron con microondas en tampón Tris-
EDTA y se trataron las peroxidasas endógenas con peróxido de hidrógeno al 3 % en
PBS. Posteriormente, se realizó inmunotinción incubando con anticuerpos primarios
dirigidos contra CD3, CD8 o CD68 (PGM-1) (1:100, Dako) durante la noche a 4 °C.
Luego, los portaobjetos se incubaron con reactivo de anticuerpo secundario marcado
con enzima (Dako) durante 45 min a temperatura ambiente, seguido de la detección
ultraView DAB en un instrumento Ventana Ultra.

Los portaobjetos se analizaron con un microscopio óptico (Olympus) y se analizaron

con el software ImageJ.
 Análisis estadístico

Usamos el método de Kaplan-Meier para resumir las variables de tiempo hasta el

evento, incluida la SLP y la supervivencia general. La SLP se define como el tiempo
desde la fecha de la primera infusión de células T editada hasta la fecha de progresión
de la enfermedad o muerte por cualquier motivo. La supervivencia general es la
duración desde la fecha de la primera infusión de células T editada hasta la fecha de
la muerte por cualquier motivo. Un sujeto que no había experimentado progresión de
la enfermedad antes de la fecha de corte fue censurado en la última fecha de
evaluación de la enfermedad. Los sujetos vivos hasta la fecha de corte fueron
censurados en el último momento en el que se supo que estaban vivos para el análisis
de supervivencia global.
La producción de IFN-ÿ se comparó entre las células T pre y posteditadas utilizando
la prueba t pareada de dos colas.
La diversidad de TCR se comparó entre pacientes y donantes sanos con la prueba de
suma de rangos de Wilcoxon de dos colas. La densidad de tinción
inmunohistoquímica se semicuantificó mediante el software. La significación
estadística se fijó en Pÿ0,05 (bilateral). Todos los demás análisis, incluidos los de EA,
eficacia y datos inmunológicos, fueron descriptivos. Todos los análisis se realizaron
con Prism, v.7.0 (GraphPad) o SPSS, v.22.

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