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Artículo

Las células CAR-T no virales, específicamente dirigidas,

logran una alta seguridad y eficacia en B-NHL

https://doi.org/10.1038/s41586-022-05140-y Jiqin Zhang1,8✉, Yongxian Hu2,3,4,5,8, Jiaxuan Yang1,8, Wei Li6, Ming Ming Zhang2,3,4,5, Qingcan Wang
6, Linjie Zhang1, Guo Qing Wei2,3,4,5, Yue Tian1, Kui Zhao7, Ang Chen1,6, Binghe Tan1,6, Jiazhen Cui
Recibido: 29 de marzo de 2021
2,3,4,5, Deqi Li6, Yi Li2,3,4,5, Yalei Qi1, Dongrui Wang2,3,4,5, Yuxuan Wu1,6, Dalí Li1,6✉, Bing Du1,6✉,
Aceptado: 25 de julio de 2022 Mingyao Liu1,6✉y él huang2,3,4,5✉

Publicado en línea: 31 de agosto de 2022

Acceso abierto Recientemente, la terapia con células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) se ha mostrado muy

Buscar actualizaciones
prometedora en el tratamiento de neoplasias malignas hematológicas.1–7. Sin embargo, la terapia con
células CAR-T actualmente tiene varias limitaciones.8-12. Aquí desarrollamos con éxito un enfoque dos en
uno para generar células CAR-T dirigidas a genes específicos y no virales a través de CRISPR-Cas9.
Utilizando el protocolo optimizado, demostramos la viabilidad en un estudio preclínico insertando un
casete CAR anti-CD19 en elAAVS1lugar de puerto seguro. Además, un tipo innovador de célula CAR-T
anti-CD19 conPD1Se desarrolló la integración y mostró una capacidad superior para erradicar células
tumorales en modelos de xenoinjerto. En la terapia adoptiva para el linfoma no Hodgkin de células B
agresivo en recaída/refractario (ClinicalTrials.gov, NCT04213469), observamos una tasa alta (87,5 %) de
remisión completa y respuestas duraderas sin eventos adversos graves en ocho pacientes. En particular,
estas células CAR-T mejoradas fueron efectivas incluso con una dosis de infusión baja y con un
porcentaje bajo de CAR.+células. El análisis unicelular mostró que el método de electroporación dio como
resultado un alto porcentaje de células T de memoria en los productos de infusión, y la interferencia de
PD1 mejoró las funciones inmunes antitumorales, validando aún más las ventajas de los métodos no
virales,PD1-células CAR-T integradas. En conjunto, nuestros resultados demuestran la alta seguridad y
eficacia de las células CAR-T integradas no virales y específicas de genes, proporcionando así una
tecnología innovadora para la terapia con células CAR-T.

En los últimos años, la terapia con células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) se
ha desarrollado rápidamente y muestra un gran potencial en la terapia contra el cáncer.1–7.
Sin embargo, aún persisten algunas limitaciones, incluido el complicado proceso de
fabricación, el alto costo de producción, el largo tiempo de preparación y los posibles
problemas de seguridad de las terapias actuales. El uso de virus en la producción de
células CAR-T es un área de preocupación, ya que las desventajas de este enfoque incluyen
un mayor riesgo de desarrollo de tumores como resultado de la mutagénesis por
inserción.8,9. Además, las respuestas específicas al ADN derivado de virus tienden a impedir
la expresión de CAR.10,11,y la fabricación de virus frecuentemente conlleva altos costos12.
Aunque algunas estrategias, como el uso de sistemas de transposones13-16y transducción
de ARNm17-19, se están explotando para generar células CAR-T sin virus, la baja
homogeneidad de los productos finales causada por la integración aleatoria y la expresión
de CAR descontinuada se convierten en problemas adicionales. Recientemente, varios
estudios han demostrado que las tecnologías de edición del genoma se pueden aplicar
para generar células CAR-T integradas específicas del locus utilizando un vector de virus
adenoasociado (AAV) como plantilla.20–22. Además, se propuso una estrategia no viral
preferencial para producir productos de células T con corrección de mutación puntual e
inserción precisa del elemento receptor de células T (TCR).23. Por lo tanto, para resolver
simultáneamente las desventajas del uso de virus y la integración aleatoria, aquí
desarrollamos ataques dirigidos no virales y específicos de genes.
Células CAR-T a través de CRISPR-Cas9 y demostraron su alta seguridad y
eficacia en el tratamiento de pacientes con linfoma no Hodgkin de células B
(r/r B-NHL) en recaída/refractario.
Características de las células AAVS1-19bbz.
En primer lugar, buscamos optimizar el protocolo para producir células T
integradas no virales y específicas de genes. Se descubrió que una plantilla de
reparación dirigida por homología (HDR), en forma de ADN bicatenario lineal
(ADNds), logra una alta eficiencia de recombinación homóloga y viabilidad
celular (Fig. 1a y Datos ampliados, Fig. 1a-c). Se adquirieron células más
viables que portaban una integración genética específica cuando se llevó a
cabo la electroporación en células T estimuladas mediante la aplicación de
brazos de homología de 800 pb (Fig. 1b, cy Datos ampliados, Fig. 1d-k).
Después de la confirmación de un protocolo óptimo, como prueba de
concepto, primero elegimos dirigir el casete que expresa CAR alAAVS1puerto
seguro para evaluar si este enfoque afectaría las propiedades de las células
CAR-T. Se construyó una secuencia CAR anti-CD19 que contiene 4-1BB y CD3ζ
(denominada 19bbz). La eficiencia de integración de 19bbz en AAVS1fue
aproximadamente del 10% (hasta 19,8%) y el porcentaje de indel osciló entre
67% y 87% (Fig. 1d, e y Datos ampliados Fig. 2a, m, n, q). Próximo,

1Centro Científico de Edición Genómica y Terapia Celular de las Fronteras de Shanghai, Laboratorio Clave de Biología Reguladora de Shanghai, Instituto de Ciencias Biomédicas y Facultad de Ciencias de la Vida,
Universidad Normal del Este de China, Shanghai, China.2Centro de trasplante de médula ósea, primer hospital afiliado, Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang, Hangzhou, China.3Laboratorio Liangzhu, Centro
Médico de la Universidad de Zhejiang, Hangzhou, China.4Instituto de Hematología, Universidad de Zhejiang, Hangzhou, China.5Laboratorio de ingeniería de células madre y terapia de inmunidad de la provincia de
Zhejiang, Hangzhou, China.6BRL Medicine, Inc., Shanghái, China.7Centro PETCT, primer hospital afiliado, Facultad de Medicina, Universidad de Zhejiang, Hangzhou, China.8Estos autores contribuyeron igualmente: Jiqin
Zhang, Yongxian Hu, Jiaxuan Yang.✉correo electrónico: zjqjeremy@163.com ; dlli@bio.ecnu.edu.cn ; bdu@bio.ecnu.edu.cn ; myliu@bio.ecnu.edu.cn ; huanghe@zju.edu.cn

Naturaleza | Volumen 609 | 8 de septiembre de 2022 |369

Artículo
a 5′brazo de homología 3′brazo de homología b C d
Plantilla 19bbz 25 AAVS1 4 Donante 1 Donante 2

PD1 250K 250K

Doblar el cambio en viable

20 13,5% 12,9%
TRAC 3
200K 200K

AUTO+células (%)
Lugar gen objetivo

AUTO+células
15 B2M 150K 150K

CSS
AAVS1 PD1 2
100K 100K
HDR 10
TRAC B2M 50K 50K
1
5 0 0
Lugar editado 19bbz 0 103104105 0 103104105
0 0
CAR-PE
AAVS1-19bbz PD1-19bbz

pb

pb

pb

pb

pb

pb
ro
TRAC-19bbz B2M-19bbz

nt

0
20

40

80

20

40

80
Co
mi F gramo CD69 CD137 CD25 PD1 LAG3
25 400 1.5 2.5 1.5 1.5 1.5
***
LV-19bbz NS
* NS

Doblar el cambio en las IMF

AAVS1-19bbz 2.0 **
20
Doblar cambio en COCHE+

300 Estimulación antigénica 1.0 1.0 1.0 1.0

1.5
expansión celular

NS
AUTO+células (%)

15
1.0
200 0,5 0,5 0,5 0,5
10 0,5
100 0 0 0 0 0
5

VS 19b l

VS 19b l

VS 19b l

VS 19b l

VS 19b l
AA LV- tro

AA LV- tro

AA LV- tro

AA LV- tro

AA LV- tro
19 z

19 z

19 z

19 z

19 z
C o

Co o

Co o

C o

Co o
z

z
1- b

1- b

1- b

1- b

1- b
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bb

bb

bb

bb

bb
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n
0 0
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at

at

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a
tr

tr

tr

tr

tr
0 3 6 9
no

no

no

no

no
AAVS1-19bbz
T

T
Tiempo después de la estimulación inicial (d)

h i j T no tratado LV-19bbz AAVS1-19bbz

IL-2 TNFα IFNγ 1.0
NS NS 60 Día 0 0,8
60 8 5 NS T no tratado
0,6 (×106)
4 50 Control 0,4
6 Día 4 0,2
Citotoxicidad (%)

40 40 LV-19bbz
doblar el cambio

3 NS 1.0
4 30 AAVS1-19bbz
Día 7 0,8
2
20 20 0,6 (×106)
2 1 0,4
10 Día 10
0,2
0 0 0 0
1:9 1:3 1:1 3:1 9:1 Día 22
VS 19b l

VS 19b l

VS 19b l
AA LV- tro

AA LV- tro

AA LV- tro
19 z

19 z

19 z
Co o

Co o
z

z
1- b

1- b

1- b
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ad

d
bb

bb

bb
a
n

n
at

at

at

relación E/T
Co
tr

tr

tr
no

no

no

Día 55
T

Figura 1 | no viral,AAVS1-Las células CAR-T integradas eliminan eficazmente las después del cocultivo con células Raji durante 24 h. Los datos se muestran como la media ± sem (norte=3
células tumorales. a, Integración específica del casete CAR en el locus objetivo mediante donantes sanos independientes). IL-2, interleucina-2; TNFα, factor de necrosis tumoral α; IFNγ, interferón-γ.i

recombinación homóloga a través de CRISPR-Cas9.b,C, Porcentaje de CAR+ , Citotoxicidad in vitro contra células Raji determinada mediante el ensayo de lactato deshidrogenasa (LDH).
células (b) y número de CAR viables+células (C) detectado 7 días después de la electroporación Relación E/T, relación efector/objetivo. Los datos se muestran como la media ± sem (norte=3 donantes
utilizando cantidades equimolares de plantillas de ADN con diferentes longitudes de brazos de sanos independientes).j, Imágenes por bioluminiscencia del crecimiento de células tumorales después de
homología (norte=2 donantes sanos independientes).d, La expresión de CAR en células de dos diferentes tratamientos en los días indicados después de la infusión de células CAR-T (norte=5). La escala de
donantes sanos representativos se determinó 7 días después de la electroporación. SSC, radiancia (ps–1cm–2señor–1) se muestra. A ratones inmunodeficientes se les inyectó por vía intravenosa 2 ×
dispersión lateral. K, ×1.000.mi, Porcentaje de CAR+células detectadas 7 días después de la 105Células Raji transducidas con luciferasa de luciérnaga (ffLuc) y 2 × 106Las células CAR-T se administraron
electroporación (norte=23 donantes sanos independientes).F, Ampliación de la CAR+células por vía intravenosa después de 5 días. Las muestras de control se electroporaron de la misma manera que
después de estimulación repetida con células Raji. Los datos se muestran como la media ± sem. las células AAVS1-19bbz, excepto que sin adición de ARN guía único (ARNsg). El valor medio se muestra enb,
(norte=3 donantes sanos independientes).gramo, Intensidad de fluorescencia media (MFI) de la C,mi,gramo.PAGLos valores se calcularon mediante ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones
expresión de CD69, CD137, CD25, PD1 y LAG3 en células T detectada después de 24 h de cocultivo múltiples de Tukey (gramo,h) o ANOVA de dos vías con la prueba de comparaciones múltiples de Sidak (F) o
con células Raji (norte=3 donantes sanos independientes). CD3+(T no tratado, control) o CD3+AUTO la prueba de comparaciones múltiples de Tukey (i). ***PAG<0,001, **PAG<0,01; NS, no significativo.
+(LV-19bbz, AAVS1-19bbz) se analizaron células seleccionadas. h, Secreción de citocinas medida
mediante inmunoensayo basado en perlas en el sobrenadante

comparamos exhaustivamenteAAVS1-Células CAR-T anti-CD19 integradas En conjunto, estos resultados demuestran que la estrategia para producir células
(AAVS1-19bbz) y producidas por lentivirus (LV-19bbz). Aunque el procedimiento de CAR-T dirigidas a genes específicos y no virales es factible.
electroporación en sí provocó cierto daño celular, la expansión de las células T no se
vio afectada y se detectó una alta viabilidad celular después de una recuperación
completa (Datos ampliados, figuras 2b-d). Mientras que la infección por lentivirus Las células PD1-19bbz superan a las células LV-19bbz
resultó en un mayor porcentaje de CAR+células entre CD4+células que entre CD8+ Dado que se ha informado que el bloqueo de la vía PD1-PD-L1 mejora la
células, la integración fue imparcial entre CD4+y CD8+células mediante la estrategia actividad antitumoral de las células CAR-T24–27, nos propusimos desarrollar un
de electroporación (Datos ampliados, Fig. 2j). En particular, la electroporación tipo mejorado de células CAR-T mediante la integración de una secuencia CAR
aumentó la proporción de CD8+a CD4+Células T en comparación con la transducción anti-CD19 en elPD1gen (PD1-19bbz) (Fig. 1a y Datos ampliados Fig. 2m, o – q).
lentiviral (Datos ampliados, figuras 2k y 8d-f), lo cual fue consistente con un estudio Se observó expresión de CAR en aproximadamente el 20% (hasta el 30,3%) de
anterior23. Observamos que las células AAVS1-19bbz respondieron a las células las células T de donantes sanos, y se detectó un alto porcentaje de indel (83–
tumorales como lo hicieron las células LV-19bbz (Fig. 1f-h y Datos ampliados Fig. 93%) y deterioro de PD1 (Fig. 2a-d). Las células PD1-19bbz tuvieron una mayor
2e). Por el contrario, se encontraron algunas diferencias en la expresión de proliferación que las células LV-19bbz después de la estimulación repetida
marcadores celulares y la secreción de citocinas. En particular, al igual que las con células Raji que expresan PD-L1 (Fig. 2e y Datos ampliados Fig. 2r). Como
células LV-19bbz, las células AAVS1-19bbz erradicaron vigorosamente las células lo indican otros informes.28–30, la alteración de PD1 no afectó la elevación de
tumorales in vitro e in vivo (Fig. 1i, j y Datos ampliados Fig. 2f-i). los marcadores de activación y la secreción de citocinas a

370|Naturaleza | Volumen 609 | 8 de septiembre de 2022