UNIVERSIDAD CATÓLICA DE

SANTA MARÍA

FACULTAD DE CIENCIAS Y SALUD

ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE ODONTOLOGÍA

ACTIVIDAD:

INFORME DE PRÁCTICA DNA

DOCTOR(A):

JULITZA LINDSEY PAREDES FUENTES

ALUMNOS:

● Sergio Daniel Gonza Laura

● Gissel Milenka Flores Huaquipaco
● Ivanna Alexia Ramirez Delgadillo.
● Lisbeth Paloma Sota Quispe

SEGUNDO SEMESTRE - TERCERA FASE

 Procedimiento
1. Aislamiento del DNA
a) Homogenizar 2 g de timo de ternera en una licuadora en 25 ml de una solución
salina 0,15 M más EDTA 0,1M pH 8
b) Transferir el homogenizado anterior a una probeta de 100 ml y añadir 2 ml de
detergente anionico ( Lauril Sulfato al 25%, mezclar )
c) Colocar en baño maria a 60 °C durante 10 min.
d) Añadir 6,3 ml de NaCl 5 M; mezclar.
e) Añadir solución de cloroformo-alcohol isoamílico (24 :1 v/v) en un volumen igual
al obtenido en la etapa anterior; aproximadamente 30 ml, agitar vigorosamente
f) Centrifugar a 10 000 rpm. por 15 minutos.
g) Separar el sobrenadante con todo cuidado para evitar que el DNA se desnaturalice
y colocarlo en una probeta de 100 ml. Agregar dos volúmenes de alcohol etílico al
95%. El alcohol debe añadirse lentamente, mientras que con una varilla de vidrio
se trata de enrollar el DNA.
h) Colocar la varilla de vidrio con el DNA enrollado en un tubo de prueba y
disolverlo en 20 ml de solución salina citrato (0,015 - 0,0015 M). Dejar en reposo
30 min.

1. Identificación de Desoxirribosa : Reacción de Dische Fundamento:

Desoxirribosa reacciona en presencia de ácido acético y sulfúrico con difenilamina
(DPA), dando como resultado un color azul.

Se ha conseguido mayor sensibilidad adicionando a la reacción ácido perclórico

y acetaldehído y dejando que desarrolle el color por 17 horas a 30 ºC. El color azul
producido por el ADN, sólo mide los azúcares enlazados a purinas, ya que el reactivo DPA
reacciona solamente con las moléculas de desoxirribosa unidas a purinas.

Según Stacey y col., se ha identificado al intermediario responsable del

desarrollo del color azul, el cual corresponde a un compuesto llamado: Hidroxilevulínico
aldehído.

H3C – CO – CHCH2 – COOH HOH2C – CO – CHCH2 – CHO

 Ac. Levulínico  OH levulínico aldehido

En cambio las desoxirribosas enlazadas a pirimidinas pueden ser detectadas por

el reactivo Carbazol. Pruebas con varios tejidos usando los reactivos DPA y Carbazol, han
mostrado que la cantidad de ADN es la misma, sin considerar cual reacción se empleó para
la determinación. Esto indica por supuesto que el ADN de estos tejidos contienen iguales
proporciones de nucleótidos púricos y primidínicos, puesto que del apareamiento de bases
según Watson-Crick, se asume que la suma de A + G = T + C .

Procedimiento:

a) Tomar 2 tubos de prueba y marcarlos de la siguiente manera :

X (Solución de DNA obtenido en la práctica) y C (Control)
b) En cada tubo medir lo siguiente :

C X
Solución de ADN obtenido ------- 2.0 ml.
Agua destilada 2.0 ml. -------
Reactivo difenilamina en 4.0 ml 4.0 ml.
solución ácida

c) Mezclar el contenido de cada tubo, colocarlos en baño hirviente durante 10 min.

d) Enfriar en baño de agua corriente por unos minutos. La presencia de desoxirribosa
se revela por la aparición de un color azul

3. Identificación de fosfato.

Primero se procederá a hidrolizar el DNA con el objeto de liberar el fosfato,

luego se identificara éste mediante una reacción de coloración.

a) Tomar dos tubos de prueba y marcarlos de la manera

siguiente: X (solución de DNA obtenida en la práctica)
C(control) b) Luego medir lo siguiente:

X C
 Solución de DNA obtenida en la práctica 0.5 ml -----
Solución salina citrato ----- 0.5 ml
Acido perclórico 7.5 N 0.5 ml 0.5 ml

c) Colocar en cada tubo un embudo pequeño con una perla de vidrio. Luego colocarlo en
baño hirviente durante 30 minutos.
d) Enfriar y proceder a identificar el fosfato inorgánico de la siguiente manera:

C X
Contenido del tubo X después de la hidrólisis ácida. ----- 0.5 ml.

Contenido del tubo C después de la hidrólisis ácida. 0.5 ml. -----

Agua destilada 3.5 ml. 3.5 ml.

Molibdato de amonio al 2.5 % 0.5 ml. 0.5 ml.
Reactivo Reductor (ácido amino reductor naftol 0.5 ml. 0.5 ml.
sulfónico

e) Mezclar el contenido de cada tubo. Dejar en reposo durante 5 minutos. Observar la

presencia de fosfato inorgánico que se manifiesta por la aparición de un color azul.

4. Desnaturalización del DNA: Efecto hipercrómico.

Diversos agentes externos, como el calentamiento, la disminución de la

constante dieléctrica del medio, pH extremos menores de 4 y superiores de 11, reactivos
como la urea y la formamida pueden debilitar las fuerzas que unen las dos cadenas
complementarias del ADN y rompen los puentes de hidrógeno lo que origina que las dos
cadenas se desenrollen y se separen, proceso conocido como desnaturalización del DNA. En
estas condiciones las bases nitrogenadas quedan más expuestas que en su estado nativo y
tienden a absorber mayor luz a 260 nm, hecho que se conoce con el nombre de efecto
hipercrómico. Cuando la temperatura desnaturaliza el 50 % del ADN esta se le conoce
como Tm o Temperatura de Fusión; esta es mayor o menor según la proporción de pares de
bases G, C o A,T respectivamente.
 Figura Nº 7.3.- Esquema que explica el proceso de desnaturalización del DNA

Procedimiento.

a) Medir en un tubo 5 ml de la solución del DNA obtenida en la práctica. Colocar el

tubo en baño hirviente durante 15 min., enfriar.
b) Medir la absorbancia de la muestra en el espectrofotómetro a 260 nm.
c) Si la solución del DNA es muy concentrada, diluirla con solución salina citrato y
determinar nuevamente la absorbancia, hasta que ésta arroje una absorbancia entre
0.5 y 1.0 .
d) Medir la absorbancia a varias longitudes de onda entre 230 y 320 nm.
e) Hacer lo propio con la solución de DNA nativo obtenida en la práctica
f) Comparar la absorbancia obtenida, con ambas soluciones de DNA.

Expresión de Resultados.

Realizando los mismos pasos señalados anteriormente, en una práctica similar a

la presente, se obtuvieron los resultados que a continuación se muestran en el presente
cuadro
 Longitud de onda en nm. Absorbancia del ADN nativo Absorbancia del ADN
desnaturalizado
320 0.005 0.020
310 0.019 0.026
300 0.025 0.038
290 0.062 0.125
280 0.135 0.335
270 0.205 0.520
260 0.283 0.650
250 0.235 0.600
240 0.175 0.420
230 0.140 0.350

En el siguiente espacio coloque el gráfico obtenido con los resultados anteriores,

colocando en el eje de las ordenadas las ABSORBANCIAS y en el de abscisas las
LONGITUDES DE ONDA tanto para el DNA nativo como para el desnaturalizado en el
mismo gráfico.
INTERROGANTES

1. Que otros tejidos podrían ser utilizados para aislar DNA en la presente práctica.
Se podría utilizar la sangre, el semen, el cabello, el hueso, el diente y los tejidos.

2. Si luego de la extracción del DNA realizada en la práctica al leer la absorbancia a 260

nm se obtiene una lectura de 1,25 D.O. y al calentarla durante un tiempo considerable,
en baño hirviente la lectura es de 1,26 D.O. Que explicación daría Ud.
Si después de la extracción del ADN, la lectura de absorbancia a 260 nm es de
1,25 D.O. y aumenta ligeramente a 1,26 D.O. después de calentarlo en un baño hirviente,
podría indicar la presencia de contaminantes o impurezas en la muestra. La absorbancia a
260 nm se utiliza comúnmente para cuantificar la concentración de ácidos nucleicos, pero
ciertos contaminantes o impurezas pueden afectar esta medida.
 El calentamiento en el baño hirviente puede influir en la solubilidad de algunas sustancias
y, en este caso, podría haber liberado o solubilizado pequeñas cantidades de material que
no se detectaron inicialmente. Esto podría explicar el ligero aumento en la lectura de
absorbancia.
3. Qué base se encuentran comúnmente formando la molécula del DNA y RNA
● Adenina (Purinas)
● Timina( Piridina)
● Uracilo( Piridina)
● Guanina ( Purinas)
● Citocinas (Piridina)

4. ¿Qué bases no comunes se encuentran también en las moléculas de los ácidos nucleicos
y particularmente cuál ?
Además de las bases nitrogenadas comunes (adenina, timina, citosina y guanina), en
algunos casos se encuentran bases no comunes. Un ejemplo es la 5-metilcitosina, que
puede sustituir a la citosina en ciertos contextos, especialmente en bacterias.

5. Qué importancia cree Ud. ¿Qué tiene el hecho de que en el DNA las bases queden en el
interior de la doble hélice ?
La disposición de las bases en el interior de la doble hélice de ADN es crucial debido a la
formación de puentes de hidrógeno entre ellas. Esta disposición protege las bases
nitrogenadas, asegurando una interacción específica: la adenina siempre se empareja con
la timina mediante dos puentes de hidrógeno, y la citosina con la guanina mediante tres
puentes. Esta estructura precisa facilita la replicación del ADN y garantiza la transmisión
precisa de la información genética durante la división celular, lo que es esencial para la
herencia y la función celula

6. Qué tipos de RNA conoce Ud. donde se encuentran localizados en la célula?

Los principales tipos de ARN presentes en la célula son:
● 1. ARN mensajero (ARNm)
● 2. ARN ribosómico (ARNr)
● 3. ARN de transferencia (ARNt)
● 4. ARN pequeño nuclear (ARNsn)
● 5. ARN pequeño nucleolar (ARNsno)

7. Cuáles son las funciones de los diferentes tipos de RNA?

El ARN tiene varias funciones que pueden comprenderse mejor a través de la descripción de
sus diferentes tipos:
● ARNm o mensajero: Es una copia complementaria de DNA, son portadores de la
información genética y se encargan de transportar esta copia del genoma a los
ribosomas.
❖ Actúa como molde y transporta la información para la síntesis de proteínas.
❖ Presenta conodes, grupo de 3 nucleótidos
● ARNt o de transferencia: Se encarga de la síntesis de proteínas que consiste, en
"transferir" el aminoácido activado a la cadena de proteína que se está formando, de
acuerdo con la secuencia del ARN mensajero que se lee en cada momento
❖ Transporta los aminoácidos hacia los ribosomas para la síntesis de proteínas
❖ Está en el citoplasma
❖ Contiene anticodones
● ARNr o ribosómico: Vincula el aminoácido correspondiente a una cadena peptídica en
crecimiento. Es un grupo prostético de las proteínas que forman subunidades de los
ribosomas, éstas desempeñan un papel estructural y funciones catalíticas, como es la
catálisis de la síntesis proteica.

❖ Recibe la información genética

❖ Traduce las proteínas
❖ Se ubica en el ribosoma, organelo donde se sintetiza las proteínas

● ARN pequeño nuclear (ARNsn):

❖ Participa en procesos de empalme y maduración del ARNm en el núcleo. Está
involucrado en la eliminación de intrones y la unión de exones.

● ARN pequeño nucleolar (ARNsno):

❖ Contribuye a la modificación del ARNr y juega un papel en la maduración de los
ribosomas.
● ARN heteronuclear:
❖ Es el proceso de los ARN
❖
8. Cuál es el fundamento de la reacción del DISCHE?
La reacción de Dische es una prueba química utilizada para la detección de ácidos
nucleicos, especialmente ADN. El fundamento de esta reacción radica en la interacción
entre el ácido desoxirribonucleico (ADN) y el reactivo de Dische, que es una mezcla de
ácido sulfúrico y el compuesto químico llamado ácido orcinosulfúrico.
La reacción en sí implica que el grupo fosfato del ADN reacciona con el ácido
orcinosulfúrico, dando lugar a una coloración característica. La intensidad de la
coloración está relacionada con la cantidad de ADN presente.
 En resumen, el fundamento de la reacción de Dische es la capacidad del ADN para
reaccionar con el ácido orcinosulfúrico, produciendo un cambio de color que permite la
detección y cuantificación del ADN. Esta prueba es comúnmente utilizada en
bioquímica y biología molecular para evaluar la presencia y concentración de ácidos
nucleicos.

9. ¿Indique las medidas que se han empleado para detener la actividad de la DNAasa II ?
Se usó un agente quelante, ácido nitrilotriacético (NTA), éste tiende a tener una alta
afinidad por los iones, es decir que los atrapa desde el medio para evitar la activación
de la DNAasa II. Como se sabe, si las DNAasas no se logran unir con estos iones
metálicos (magnesio) debido a que, éstos van a ser atrapados por agentes quelantes,
las DNAasa no activaran, por lo que tampoco cumplirán con su función de
degradación de DNA.