Prácticas de Biología Molecular – Semestre 2023-II

PRÁCTICA N° 3
CARACTERIZACIÓN DEL ADN: CUANTIFICACIÓN, PUREZA E INTEGRIDAD

I.- MARCO TEÓRICO

La caracterización del ADN aislado, usando las diversas técnicas de biología molecular, está
determinada por tres factores importantes:
• La concentración del ADN
• La pureza
• La integridad del ADN
La calidad del ADN extraído va a impactar en los diversos análisis posteriores que se le practique como
la digestión por enzimas de restricción, la PCR, la secuenciación, la hibridización entre otras.

FACTORES PARA LA CARACTERIZACIÓN:

A. CONCENTRACIÓN DEL ADN POR ESPECTROMETRÍA
La concentración de los ácidos nucleicos en solución es determinada rutinariamente por su pico de
absorbancia a 260 nm. Así, el coeficiente de absorción específica (E260) del ADN dúplex es 0.02
(µg/ml)-1cm-1. Para el ADN de doble cadena una unidad de A260 es equivalente a 50 µg ADN; para
el ADN de cadena sencilla es equivalente a 33 µg de ADN y para el ARN de cadena sencilla es
equivalente a 40 µg de ARN. Todas estas cantidades darían una A260 de 1 si se disuelven en 1 ml y
son medidas en una cubeta de 1 cm.
TABLA 1:
1.0 A260 = 50 µg/mL dsADN
1.0 A260 = 33 µg/mL ssADN
1.0 A260 = 40 µg/mL ARN
(1.55 x A280)-(0,76 x A260) = mg/mL Proteína

B. PUREZA DEL ADN

Se puede demostrar una contaminación de nuestro ADN con proteínas, ARN o compuestos fenólicos
que podrían haber quedado después del proceso de extracción. Sabemos que las proteínas absorben
muy poco a 260 nm, pero sí lo hacen a 280 nm; entonces como indicador de la pureza del ADN se
utiliza la relación o proporción de A260/A280.
Cuando la relación A260/A280 de la muestra de ADN es menor a 1.8 o mayor a 2.0 una cantidad
significativa de impurezas todavía está presente en la muestra. Las muestras de ADN altamente
purificadas tienen una relación A260/A280 de 1.8-1.9, mientras que las muestras de ARN altamente
purificadas tienen una proporción A260/A280 de 1.9 a 2.0. Por otro lado, se puede determinar que la
muestra está libre de ARN, carbohidratos, péptidos, etanol, fenoles o cualquier compuesto orgánico,
cuando al obtener la relación A260/A230 de 1.8 y 2.2.

C. INTEGRIDAD DEL ADN: DENATURACIÓN ALCALINA Y DEGRADACIÓN

ENZIMÁTICA EVIDENCIADA POR A260 (EFECTO HIPERCRÓMICO)
Las dos hebras en un dúplex de ADN son mantenidas por fuerzas no covalentes, principalmente
entre las bases los puentes de hidrógeno y las interacciones hidrofóbicas y las interacciones de Van
der Waals entre los anillos aromáticos de las bases llamadas interacciones de apilamiento o stacking
interactions. Estas interacciones débiles pueden romperse por el calor y cambios de pH. Así cuando
el ADN es calentado se desenrolla y se separa en cadenas sencillas, este proceso es llamado
denaturación.
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Es así como la absorbancia del ADN a 260 nm se incrementa conforme el ADN se va denaturando,
este es un fenómeno conocido como EFECTO HIPERCRÓMICO. Por lo que, una disminución en
la absorbancia se llama efecto hipocrómico. El efecto hipercrómico sobre el dúplex de ADN no solo
ocurre con la denaturación de sus hebras sino también con su degradación o hidrólisis, lo que
produce nucleótidos libres, que al carecer de las interacciones de apilamiento aumentan su A260.

II. OBJETIVOS:
 Determinar la concentración y pureza de los extractos de ADN mediante espectrofotometría.
 Evaluar la integridad (denaturación) de los extractos de ADN por el nivel del efecto
hipercrómico y por su degradación con una nucleasa y medir la actividad enzimática con el
sustrato sintético.

III. MATERIALES DEL PROCEDIMIENTO

Proporcionados por el laboratorio:
• Solución de ADN extraído en la práctica anterior (disuelto en Solución C: 0.1MNaCl y 0.01M
Citrato de Na)
• Enzima nucleasa (2 mg/mL)
• Buffer TE 10:1 pH 8.5 y Buffer TE 10:1 pH 9.0
• NaOH 1 N y NaOH 0.1 N
• Sustrato sintético: bis-pNFF 20 mM
Proporcionados por los estudiantes de cada mesa de trabajo:
• 10 tubos de vidrio de 13x100 mm y 6 tubos de vidrio de 16x150 mm limpios y secos
• 02 gradillas
• 3 pipetas Pasteur de plástico graduadas de 3 mL
• Plumón marcador
• Un rollo de papel toalla y un paquete de papel tissue
• Alcohol
• Por cada alumno: Guantes de nitrilo y calculadora

IV. PROCEDIMIENTOS
EXPERIMENTO 1:
CONCENTRACIÓN Y PUREZA DEL ADN: método de espectrofotometría A260/A280
 En un tubo de 13x100 rotulado B colocar 2mL de la solución C.
 Calibrar el espectro llevando A=0 con el blanco a una longitud de onda 260 nm.
 En tubos de vidrio (16x150 mm) colocar 0.5 mL de cada muestra del extracto de ADN (debe
estar totalmente disuelto) y añadir 4.5 mL de la Solución C.
 Leer la absorbancia a 260 nm de ambos tubos de ADN diluido.
 De acuerdo con la lectura obtenida, hacer las diluciones apropiadas en Solución C para obtener tener
una Absorbancia de 0.5. A partir de esta última dilución, preparar la siguiente batería de tubos
(13x100 mm) utilizando el siguiente protocolo:
B 1 2

Solución C (mL) 2.0 --- ---

ADN Argopecten diluido (mL) --- 1.0 ---

ADN Pisum diluido (mL) --- --- 1.0

Agua destilada (mL) --- 1.0 1.0

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 Leer la A260 y A280 de los tubos 1 y 2. Anotar las lecturas

 Con las equivalencias A260 de la Tabla 1 determinar la concentración de las 2 muestras de ADN
nativo.
 Con la relación de A260/A280 determinar el grado de pureza de la muestra de ADN y el tipo de
contaminante si los hubiera. En caso de obtener contaminación proteica use el dato respectivo de la
Tabla 1 para calcular concentración de proteína considerando también el factor de dilución.
 Interpretar los resultados.

EXPERIMENTO 2:
INTEGRIDAD DEL ADN: DENATURACIÓN ALCALINA EVIDENCIADA POR EFECTO
HIPERCRÓMICO
 Rotular 2 tubos de 13x100 mm y colocar las soluciones de acuerdo con la siguiente tabla.

B 3 4

Solución C (mL) 2.0 --- ---

ADN Argopecten diluido (mL) --- 1.0 ---

ADN Pisum diluido (mL) --- --- 1.0

NaOH 1 N (mL) --- 1.0 1.0

 Calibrar el espectro llevando A=0 con el blanco a una longitud de onda 260 nm.
 Leer la A260 de los tubos 3 y 4. Registrar las lecturas.
 Comprobar el efecto hipercrómico (>A260 nm) comparando las lecturas de A260 de los tubos del
Exp.1 y Exp. 2 para el ADN de Argopecten (tubos 1 vs 3) y las lecturas de A260 parael ADN de
Pisum (tubos 2 vs. 4). Determinar el estado del ADN de acuerdo los siguientes datos:

Si el incremento A260 ≥ 30%, entonces el ADN se encontraba en estado nativo al inicio

Si el incremento A260 < 30%, entonces el ADN se encontraba en estado denaturado al
inicio

EXPERIMENTO 3:
EFECTO HIPERCRÓMICO (>A260) POR DEGRADACIÓN ENZIMÁTICA DEL ADN POR
ACCIÓN DE UNA NUCLEASA
 Con la muestra de ADN diluida anteriormente preparar la siguiente batería de tubos (16x150mm):
B 1

Buffer pH 9.0 (mL) 3.0 1.4

ADN (mL) --- 1.5

 Calibrar el espectrofotómetro llevando A0 con el blanco a una longitud de onda 260 nm.
 Registrar la A260 del tubo 1 pre-incubación
 Adicionar 0.1 mL de Nucleasa (2 mg/mL) e incubar a 37 °C durante 15 min.
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 Registrar la A260 del tubo 1 post-incubación.

 Comparar ambas lecturas e interpretar los resultados.

EXPERIMENTO 4:
MEDICIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE UNA NUCLEASA CON SUSTRATO
SINTÉTICO (bis-pNitro Fenil-Fosfato)
 Preparar la siguiente batería de tubos (13x100 mm):

B 1 2 3

Sustrato sintético (mL) 0.5 0.5 0.5 0.5

Buffer pH 8.5 (mL) 0.5 0.4 0.4 0.4

Nucleasa (2 mg/mL) --- 0.1 0.1 0.1

Tiempo incubación a 37 °C 3 min 3 min 5 min 7 min

NaOH 0,1 N (mL) 2 2 2 2

Leer A400 nm de los tubos 1, 2 y 3 usando como blanco el tubo B

 Registrar la A400 de los tubos 1, 2 y 3.

 Para calcular concentración µM de producto liberado usar el Factor de calibración de p-
nitrofenol = 6 µM
 Determinar la actividad específica (A.E.) de la nucleasa empleada:

A.E. = Cantidad de producto liberado / Unidad de tiempo / Cantidad de enzima usada

(µM) (min) (mg)

V.- BIBLIOGRAFÍA
• García-Segura, JM; Gavilanes J y otros. 1999. Técnicas instrumentales de análisis en Bioquímica.
Ciencias Química: Química básica. Editorial Síntesis. Madrid
• Herráez, Angel. 2012. Biología molecular e ingeniería genética. Elsevier. Barcelona
• Schmid, F-X. 2001. Biological Macromolecules: UV-visible Spectrophotometry. Encyclopedia of
Life Sciences. doi:10.1038/npg.els.0003142.
• Sambrook J, Russell DW. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed. New York:
ColdSpring Harbor Laboratory Press

Prof. Nadia Vera Munárriz