FACULTAD DE MEDICINA UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN

AGUSTÍN DE AREQUIPA

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA

INFORME DE PRÁCTICAS

ASIGNATURA: BIOLOGÍA MOLECULAR

ESTUDIANTE: LUIS CARLOS MAMANI COSSIO

DOCENTE: Dr. Juan Aquino Puma

AREQUIPA – PERÚ
2021
RESOLUCIÓN DE LA PRÁCTICA N° 1

PURIFICACIÓN DE ADN y ARN

RELACIÓN DE EXPERIMENTOS
1. Extracción y purificación de ADN de un tejido animal
2. Identificación de desoxirribosa de una muestra de ADN: Reacción de
Dische (Difenilamina)
3. Identificación de fosfato de una muestra de ADN
4. Desnaturalización del ADN: Efecto hipercrómico

INTRODUCCION

Los á c i d o s nucleicos son polímeros lineales de una unidad repetitiva llamada

nucleótido, el cual está constituido por:

a.- Una pentosa: ribosa o desoxirribosa

b.- Una base nitrogenada: púrica o pirimidínica
c.- Ácido fosfórico (Ácido ortofosfórico)

La unión de las bases nitrogenadas con la pentosa constituye un nucleósido, y la

unión éster de un nucleósido con ácido
fosfórico se conoce como nucleótido.

El ADN es el responsable de la transmisión

de los caracteres hereditarios en el ser humano
y está formado por dos cadenas
polinucleotídicas, enrolladas en espiral a lo
largo de un eje común. Las dos cadenas corren
en direcciones opuestas (antiparalelas).
El esqueleto azúcar fosfato de cada una de las cadenas se encuentra hacia el exterior
de la doble hélice (por su hidrofilicidad) y las bases nitrogenadas están en el interior
(por su hidrofobicidad).

Las dos cadenas están unidas por puentes de hidrógeno establecidos entre las
bases, dos puentes de hidrógeno entre los pares A-T y tres puentes de hidrógeno
entre los pares G-C; la adenina siempre se unirá a la timina y la guanina siempre
se unirá con la citosina. Los puentes de hidrógeno pueden romperse por el calor y
por agentes químicos, obteniéndose un DNA desnaturalizado.

El ADN, el Código de la Vida

Cada vez más los clínicos, científicos e incluso los medios de comunicación, están
hablando sobre el genoma y el impacto de los datos que tienen ahora y en el futuro,
sobre la asistencia sanitaria.

El genoma describe el conjunto completo de instrucciones genéticas de un

organismo. Para el genoma humano esto significa los ~ 3.2 mil millones de bases
que contienen el código para ~ 30 000 genes.

El ADN (o ácido desoxirribonucleico) es una molécula larga que contiene

nuestro código genético único. Como un libro de recetas, contiene las
instrucciones para hacer todas las proteínas y ARNs de nuestro cuerpo.

El aislamiento y purificación del DNA se puede realizar aprovechando su

propiedad de absorber luz a la longitud de onda de 260 nm. La purificación del DNA
unido a proteína (principal contaminante del proceso por su abundancia), se basa
en la medida de la absorbancia de luz a la longitud de onda de 260/280 nm. ya que
las bases nitrogenadas absorben luz a 260nm y las proteínas a 280 nm de longitud
de onda.

Existen tres pasos fundamentales en la extracción de un ácido nucleico

(DNA o RNA):
 Longitud de una
vuelta de DNA

Figura 1.1. Estructura helicoidal del ADN

Figura 1.2. Modelo de la molécula de ADN según Watson y Crick

 1) Homogeneización de la muestra: Permite la disgregación de la estructura
tisular y celular para facilitar la salida de los ácidos nucleicos.

2) Separación y Purificación: Permite la eliminación progresiva de proteínas

y otros contaminantes celulares y la obtención de un material genético cada
vez más limpio, el cloroformo permite la separación de las fases durante la
centrifugación, además de también ser desnaturalizante de proteínas y
disolvente de lípidos.

3) Precipitación: Permite la obtención del ácido nucleico listo para ser

almacenado o diluido a la concentración deseada para su utilización. Este
paso se realiza mediante el agregado de 1 volumen de isopropanol o 2 a 3
volúmenes de etanol.

Se pueden mencionar muchas metodologías para la extracción de ADN y ARN

en función del tipo de muestra (células procariotas o eucariotas, virus, vegetales,
animales, etc.) y del grado de pureza que se quiera obtener condicionado por las
técnicas posteriores de análisis. Estos procedimientos tardan de 2 a 3 horas y en
ellos se desarrollan necesariamente las siguientes actividades:

1) Lisis celular
2) Desnaturalización de las nucleoproteínas
3) Inhibición de nucleasas
4) Maximización de la recuperación de ácidos nucleicos (eliminar
contaminantes)
5) Maximización de la calidad de los ácidos nucleicos a purificar

EXTRACCIÓN DE ADN

OBJETIVOS

1. Obtención del ADN usando como fuente, timo de ternera

2. Identificación del componente desoxirribosa del DNA: Reacción de Dische
 3. Identificación de fosfato: Reacción del Molibdato de amonio
4. Desnaturalización del DNA: Observación del efecto hipercrómico

Procedimiento

1. Aislamiento del DNA

a) Homogenizar 2 g de timo de ternera en una licuadora en 25 ml de una
solución salina 0,15 M más EDTA 0,1M pH 8
b) Transferir el homogenizado anterior a una probeta de 100 ml y añadir 2 ml
de detergente anionico (Lauril Sulfato al 25%, mezclar)
c) Colocar en baño maria a 60 °C durante 10 min.
d) Añadir 6,3 ml de NaCl 5 M; mezclar.
e) Añadir solución de cloroformo-alcohol isoamílico (24 :1 v/v) en un volumen
igual al obtenido en la etapa anterior; aproximadamente 30 ml, agitar
vigorosamente
f) Centrifugar a 10 000 rpm. por 15 minutos.
g) Separar el sobrenadante con todo cuidado para evitar que el DNA se
desnaturalice y colocarlo en una probeta de 100 ml. Agregar dos volúmenes
de alcohol etílico al 95%. El alcohol debe añadirse lentamente, mientras que
con una varilla de vidrio se trata de enrollar el DNA.
h) Colocar la varilla de vidrio con el DNA enrollado en un tubo de prueba y
disolverlo en 20 ml de solución salina citrato (0,015 - 0,0015 M), puede
ayudarse con el vortex. Dejar en reposo 30 min.
i) Añadir 2 ml de solución acetato de sodio 3 M a pH 7 la cual contiene 0,001
M de EDTA.
j) Mezclar con una varilla de vidrio, añadiendo simultáneamente gota a gota
9,5 volúmenes de isopropanol para precipitar selectivamente al DNA. Seguir
mezclando con la varilla de vidrio tratando de enrollar el DNA.
k) Disolver el DNA obtenido en 20 ml. de solución salina citrato.

2. Identificación de Desoxirribosa: Reacción de Dische

 Fundamento:
Desoxirribosa reacciona en presencia de ácido acético y sulfúrico con
difenilamina (DPA); las desoxipentosas debido a la hidrólisis ácida sufren
deshidratación produciendo aldehídos δ-hidroxi-levulínicos, estos reaccionan con
difenilamina, dando un producto de color azul.

El color azul producido por el ADN, sólo mide los azúcares enlazados a
purinas, ya que el medio ácido proporcionado por los ácidos presentes en el
reactivo de Dische, solo rompe los enlaces N-glicosídicos unidos a purinas, los unidos
a pirimidinas resisten este pH, evitando la reacción. El color obtenido corresponde
solo a la mitad del total de desoxiribosas de ese ADN puesto que del apareamiento
de bases según Watson-Crick, se asume que la suma de:

A+G= T+C

Procedimiento:

a) Tomar 2 tubos de prueba y marcarlos de la siguiente manera:

X (Solución de DNA obtenido en la práctica) y C (Control)
b) En cada tubo medir lo siguiente:

C X
Solución de ADN obtenido ------- 2.0 ml.
Agua destilada 2.0 ml. -------
Reactivo difenilamina en
4.0 ml 4.0 ml.
solución ácida (DPA)
 c) Mezclar el contenido de cada tubo, colocarlos en baño hirviente durante 5
min.
d) Enfriar en baño de agua corriente por unos minutos. La presencia de
desoxirribosa se revela por la aparición de un color azul

3.- Identificación de fosfato.

Primero se procederá a hidrolizar el DNA con el objeto de liberar el fosfato,
luego se identificará éste mediante una reacción de coloración.
a) Tomar dos tubos de prueba y marcarlos de la manera siguiente: X (solución
de DNA obtenida en la práctica), C(control)
b) Luego medir lo siguiente:

X C
Solución de DNA obtenida en la
0.5 ml -----
práctica
Solución salina citrato ----- 0.5 ml
Acido perclórico 7.5 N 0.5 ml 0.5 ml

c) Colocar en cada tubo un embudo pequeño, obturado con una perla de

vidrio. Luego colocarlo en baño hirviente durante 30 minutos.
d) Enfriar y proceder a identificar el fosfato inorgánico de la siguiente manera:

C X
Contenido del tubo X después de la
----- 0.5 ml.
hidrólisis ácida.
Contenido del tubo C después de la
0.5 ml. -----
hidrólisis ácida.
Agua destilada 3.5 ml. 3.5 ml.
Molibdato de amonio al 2.5 % 0.5 ml. 0.5 ml.
Reactivo Reductor (ácido amino reductor
0.5 ml. 0.5 ml.
naftol sulfónico

e) Mezclar el contenido de cada tubo. Dejar en reposo durante 5 minutos (a

temperatura ambiente). Observar la presencia de fosfato inorgánico que se
manifiesta por la aparición de un color azul.

4.- Cuantificación de los ácidos nucleicos:

 Para la cuantificación de los ácidos nucleicos aislados se realiza la medida de
absorbancia de la muestra a una longitud de onda de 260 nm en un
espectrofotómetro. Se sabe que la densidad óptica a 260 nm de una solución de
DNA puro de doble cadena de 50µg/ml es igual a 1. Con esta relación puede
calcularse la concentración de DNA de nuestra muestra.

Para el caso del RNA la relación es de 40µg/ml para una unidad de

absorbancia a 260 nm.

Una vez obtenido el material genético, es importante determinar el rendimiento

mediante espectrofotometría. La ley de Beer-Lambert indica que la concentración
de una molécula en solución depende de la cantidad de luz absorbida de las
moléculas disueltas. Se debe considerar el factor de dilución para obtener la
concentración en nanogramos/microlitro (ng/µl).

En el caso de algunos equipos como el espectrofotómetro Nanodrop, no es

necesario diluir la muestra y el equipo nos proporciona directamente la concentración
en ng/µl. Considerando que para una reacción de PCR se requieren de 10 a 200 ng
debemos obtener al menos, 5 ng/µl de ADN en cada muestra, si se recuperaron 50
µl, el rendimiento neto de la extracción sería de 0.25 µg. Concentraciones menores
dificultan la estandarización de la PCR u otras técnicas.

Para estimar la pureza del ADN se considera la proporción de la

absorbancia a 260 nm y 280 nm. Una proporción de 1.8 a 2.0 es aceptada como
ADN puro, proporciones menores a este valor indican la presencia de proteínas,
mientras que valores mayores se deben a contaminación con sales.

Una segunda valoración de la pureza de ácidos nucleicos es la proporción

260/230, los valores aceptados se encuentran en el rango de 2.0 a 2.2, si la
relación es menor indican la presencia de contaminantes como carbohidratos o
fenol.
5.- Comprobación de la integridad del ADN por electroforesis

Además de conocer la cantidad y calidad del ADN por espectrofotometría,

es importante conocer si el ADN obtenido está integro. La integridad del ADN se
puede observar mediante electroforesis en gel de agarosa. Si el ADN está integro,
se debe observar una banda estrecha cercana al pozo en que se colocó la mezcla
de ADN. Si está fragmentado, se observará una banda de más de un cm de ancho
o un sendero luminoso en el carril de la muestra (Figura 1.3). El ADN fragmentado
dificulta la amplificación de productos de PCR de alto peso molecular y afecta la
reproducibilidad de las técnicas.

Muestra íntegra

Figura 1.3. Gel de agarosa para visualizar la integridad del ADN. Carril 1 marcador de
peso molecular, carril 2 y 3 vacíos, carril 4 y 7 muestras con poca
fragmentación, carril 5 muestra fragmentada, carril 6 muestra integra.

6.- Desnaturalización del DNA: Efecto hipercrómico.

Diversos agentes externos, como el calentamiento, la disminución de la constante

dieléctrica del medio, pH extremos menores de 4 y superiores de 11, reactivos como
la urea y la formamida, pueden debilitar las fuerzas que unen las
dos cadenas complementarias del ADN y rompen los puentes de hidrógeno lo que
origina que las dos cadenas se desenrollen y se separen, proceso conocido como
desnaturalización del DNA; este hallazgo ha permitido a la medicina tecnologías de
hibridización sumamente importantes. En estas condiciones las bases nitrogenadas
quedan más expuestas que en su estado nativo y tienden a absorber mayor luz a
260 nm, hecho que se conoce con el nombre de efecto hipercrómico. Cuando la
temperatura desnaturaliza el 50 % del ADN esta se le conoce como Tm o
Temperatura de Fusión; esta es mayor o menor según la proporción de pares de
bases G, C o A,T respectivamente.

Calor Calor

DNA Nativo DNA Desnaturalizado

Figura 1.4. Esquema que explica el proceso de desnaturalización del DNA

Procedimiento.

a) Medir en un tubo 5 ml de la solución del DNA obtenida en la práctica. Colocar

el tubo en baño hirviente durante 15 min.
b) Medir rápidamente la absorbancia de la muestra en el espectrofotómetro a
260 nm.
c) Si la solución del DNA es muy concentrada, diluirla con solución salina citrato
y determinar nuevamente la absorbancia, hasta que ésta arroje una
absorbancia entre 0.5 y 1.0.
 d) Medir la absorbancia a varias longitudes de onda entre 230 y 320 nm.
e) Hacer lo propio con la solución de DNA nativo obtenida en la práctica
f) Comparar la absorbancia obtenida, con ambas soluciones de DNA.

Expresión de Resultados.

Realizando los mismos pasos señalados anteriormente, en una práctica

similar a la presente, se obtuvieron los resultados que a continuación se muestran
en el presente cuadro

Longitud de onda en Absorbancia del ADN Absorbancia del ADN

nm. nativo desnaturalizado
320 0.005 0.020
310 0.019 0.026
300 0.025 0.038
290 0.062 0.125
280 0.135 0.335
270 0.205 0.520
260 0.283 0.650
250 0.235 0.600
240 0.175 0.420
230 0.140 0.350

Menor Mayor

Haga un gráfico con los resultados anteriores, colocando en el eje de las

ordenadas las ABSORBANCIAS y en el de abscisas las LONGITUDES DE ONDA
tanto para el DNA nativo como para el desnaturalizado en el mismo gráfico.
 INTERROGANTES

1.- ¿Qué otros tejidos podrían ser utilizados para aislar DNA en la presente

práctica?

Fuente: https://es.slideshare.net/BiocientificaSA/mara-ngeles-baridon-mtodos-de-extraccin-y-purificacin-de-
cidos-nucleicos
A efectos prácticos se pueden usar como muestras las células de casi todos los tejidos

del cuerpo, sin embargo, existen algunas que no se pueden utilizar para la extracción de

ADN, debido a la auscencia de material genético, tales como glóbulos rojos maduros,

plaquetas, células del cristalino y la córnea.

Respecto a la utilización de muestra de hígado para la extracción de ADN, la dificultad

radica en la alta actividad de las nucleasas presentes en este órgano, lo cual dificulta en

gran medida la obtención de ADN íntegro si se utilizan las metodologías tradicionales de

extracción de ADN, pero dependiendo de las técnicas y reactivos que se utilizen también

puede ser viable utilizarla, dada su alta concentración de material genético.

2.- ¿Por qué razón se usan 6,3 ml de NaCl 5 M en una de las etapas de extracción

del DNA?

Se adiciona esa cantidad de NaCl, para contribuir a la precipitación de las proteínas, que

constituyen los principales contaminantes biológicos en la extracción de ADN, luego se

puede utilizar la centrifugación de la muestra de ADN en el experimento de extracción,

para luego proceder a descartarlas mediante la utilización de alcohol isonílico.

Fuente: http://ufq.unq.edu.ar/Docencia-Virtual/BQblog/Salting-in-
Salting-out-precipitacion-solventes.pdf
 3.- ¿Qué otros métodos de lisis celular se utilizan en la purificación de ácidos

nucleicos?

SDS (Dodecil sulfato de sodio)

Fuente: https://es.slideshare.net/BiocientificaSA/mara-ngeles-baridon-mtodos-de-extraccin-y-purificacin- de-

cidos-nucleicos

- Nitrógeno líquido: Macerado de la muestra con nitrógeno líquido, en un mortero de

porcelana hasta obtener un polvo muy fino.

- Pistilos u homogeneizadores: Los pistilos disgregan la muestra mediante fricción con la

pared del tubo, adicionalmente se puede utilizar algún abrasivo como vidrio pulverizado

o resinas.

- Agentes Caotrópicos como guanidino, úrea y tioúrea.

- Mixers: Instrumento más utilizados en laboratorios modernos, pero tienen el

inconveniente de ser muy costosos.

4.- Si luego de la extracción del DNA realizada en la práctica al leer la

absorbancia a 260 nm se obtiene una lectura de 1,25 D.O. y al calentarla

durante un tiempo considerable, en baño hirviente la lectura es de 1,26 D.O.

¿Qué explicación daría Ud.?

Explicación 1: Al aumentar la temperatura los puentes de hidrógeno que unían

ambas cadenas de ADN se rompieron pasando de una forma nativa a una

desnaturalizada de cadena simple, lo cual deja al descubierto bases

nitrogenadas, que por estar ocultas no absorbian luz, pero que ahora si lo hacen,

aumentando por consiguiente la absorbancia de la muestra; como el aumento de

es pequeño, Podemos inferir que el ADN ya estaba casi totalmente

desnaturalizado (parcial) y el ligero aumento de temperatura, culminó el proceso

de desnaturalización (total).

Explicación 2: Que solo haya habido ARN en la muestra

Explicación 3: Que el ADN de la muestra haya estado fragmentado (hidrolizado),

debido a la acción de las nucleasas

5.- ¿Qué otras formas para identificar el ADN, aparte de la reacción de DISCHE

se pueden utilizar?

a) Espectrofotometría: Con una lectura a 260nm, utilizando una solución muestra

de ADN purificado

b) Identificación de fosfato mediante la reacción del molibdato de amonio:

Primero se procederá a hidrolizar el DNA con el objeto de liberar el fosfato, luego

se identificará éste mediante una reacción de coloración.

 c) Identificación de timina: Debido a su presencia exclusiva en el DNA, sin embargo

hasta el momento no se ha logrado identificar este compuesto de manera directa, sino

a sus derivados.

6.- ¿Qué bases no comunes se encuentran también en las moléculas de los

ácidos nucleicos y particularmente en cuál?

- En el ARN a menudo se encuentran bases como la N2-Dimetilguanina, hipoxantina,

dihidroxiuracilo.

- En el ADN se puede encontrar la 5-metilcitosina o 5-hidroximetilcitosina

- Hipoxantina y xantina, ribotimidina uridine

- En el ARNt: dihidrouridina y seudouridina, esta última no es una base, sino un

sustituyente.
 7.- ¿Qué importancia cree Ud. que tiene el hecho de que en el DNA las

bases queden en el interior de la doble hélice?

Durante la evolución, debido a su naturaleza hidrofóbica las bases nitrogenadas, se

ubicaron en la parte interna del ADN, debido a las siguientes razones:

- La principal importancia de esta conformación radica en que al estar en el interior de la

doble cadena, se aisla a las bases nitrogenadas (cuya secuencia guarda la información

genética del organism), de agentes mutagénicos (físicos, químicos o biológicos) que

podrían cambiar su estructura molecular, produciendo una mutación genética

- Permite formar enlaces puentes de hidrógeno que contribuyen a estabilizan la

estructura molecular del ADN.

Grupos fosfato ionizados

ubicados en la periferia
de la molécula de ADN

Pares de bases nitrogenadas

en el centro de la estructura
 8.- ¿Qué tipos de RNA conoce Ud.? ¿En qué cantidades y donde se

encuentran localizados en la célula?

a) ARN mensajero (ARNm) → 5% en el Citoplasma

b) ARN de transferencia (ARNt) → 15 - 20%

c) ARN ribosómico (ARNr)→ 75 – 80%

El resto son minoritarios en la célula, algunos son productos de la degradación del RNAm

y cumplen funciones como interferencia en la expression de genes, tratamiento de

enfermedades, etc.

9.- ¿Cuáles son las funciones de los diferentes tipos de RNA?

a) ARN de mensajero (mRNA)

el mRNA explica el apenas 5% del ARN total en la célula. el mRNA es el más

heterogéneo de los 3 tipos de ARN en términos de serie baja y talla. Lleva la clave
genética elogiosa copiada, de la DNA durante la transcripción, bajo la forma de tríos de
los nucleótidos llamados los codones.

Cada codón especifica un aminoácido determinado, aunque un aminoácido se puede

cifrar para por muchos diversos codones. Aunque haya 64 codones o bases posibles
del trío en la clave genética, sólo 20 de ellos representan los aminoácidos. Hay también
3 codones STOP, que indican que los ribosomas deben cesar la síntesis de la proteína
por la traslación.

b) ARN Ribosomal (rRNA)

Los rRNAs se encuentran en los ribosomas y explican el 80% del ARN total presente en
la célula. Los ribosomas se componen de una subunidad grande 50s y de una pequeña
subunidad llamada 30s, que se compone de sus propias moléculas específicas del rRNA.
Diversos rRNAs presentes en los ribosomas incluyen los pequeños rRNAs y los rRNAs
grandes, que pertenecen a las subunidades pequeñas y grandes del ribosoma,
respectivamente.
los rRNAs combinan con las proteínas y las enzimas en el citoplasma para formar los
ribosomas, que actúan como el sitio de la síntesis de la proteína. Estas estructuras
complejas viajan a lo largo de la molécula del mRNA durante la traslación y facilitan el
montaje de aminoácidos para formar una cadena del polipéptido. Obran recíprocamente
con los tRNAs y otras moléculas que son cruciales a la síntesis de la proteína.

c) ARN de la transferencia (tRNA)

el tRNA es el más pequeño de los 3 tipos de ARN, poseyendo alrededor 75-95

nucleótidos. los tRNAs son un componente esencial de la traslación, donde está la
transferencia su función principal de aminoácidos durante síntesis de la proteína.

los tRNAs tienen una estructura de la hoja de trébol que es estabilizada por las uniones
puente de hidrógeno entre las bases nitrogenadas complementarias. Contienen
normalmente algunas bases inusuales además de los 4 usuales (Adenina, guanina,
citosina y timina), que son formadas por la metilación de las bases usuales. La guanina
y la metilcitosina metílicos son dos ejemplos de bases desnaturalizadas.

d) Otros tipos de ARN

Más allá del papel primario del ARN en síntesis de la proteína, varias variedades de
ARN existen que están implicadas en la modificación post-transcriptiva, la réplica de la
DNA, y la regla del gen. Algunas formas del ARN son solamente particularmente
formas encontradas de la vida, por ejemplo en eucariotas o bacterias.

• Pequeño ARN nuclear (snRNA)

El snRNA está implicado en el tramitación del ARN de premensajero (pre-mRNA)
en el mRNA maduro. Son muy cortos, con un largo medio de solamente 150
nucleótidos.
• RNAs regulador
Varios tipos de ARN están implicados en la regla de la expresión génica,
incluyendo el ARN micro (miRNA), el pequeño ARN de interferencia (siRNA) y el
ARN antisentido (aRNA).
el miRNA (NT 21-22) se encuentra en eucariotas, y actos con la interferencia del
ARN (RNAi). el miRNA puede analizar el mRNA que es complementario a, con el
socorro de enzimas. Esto puede cegar el mRNA de ser traducido, o acelere su
degradación.
el siRNA (NT 20-25) es producido a menudo por avería del ARN viral, aunque hay
también fuentes endógenas de siRNAs. Actúan semejantemente al miRNA. Un
mRNA puede contener elementos reguladores sí mismo, tal como riboswitches,
 en el 5' región sin traducir o 3' región sin traducir; estos elementos cis-reguladores
regulan la actividad de ese mRNA.
• ARN del Transferencia-mensajero (tmRNA)
Encontrado en muchas bacterias y plastidios. Su función es evitar que el ribosoma
se atasque debido al codón STOP faltante.
• Ribozimas (enzimas del ARN)
Son RNAs que adoptan estructuras terciarias complejas y actuan como
catalizadores biológicos. Tales enzimas del ARN se conocen como ribozimes, y
exhiben muchas de las características de una enzima clásica, tales como un sitio
activo, un punto de enlace para un substrato y un punto de enlace para un
cofactor, tal como un ión del metal.
• ARN Doble-trenzado (dsRNA)
Este tipo de ARN tiene dos cabos limitados juntos, como con la DNA doble-
trenzada. el dsRNA forma el material genético de algunos virus.

Disponible en: https://es.slideshare.net/bentuu/tipos-de-rna

10.- ¿Cuál es el fundamento de la reacción del DISCHE?

11.- Indique las medidas que se han empleado para detener la actividad de
la DNAasa II

- EDTA (ácido etilendiaminotetraacético): Debido a su acción quelante de iones

magnesio, inhibe competitivamente a las enzimas desoxirribonucleasas evitando

la degradación del ADN.

- Temperatura de más de 60 °C (baño maría): El aumento de temperature

desnaturalizó a las enzimas desoxirribonucleasas.

- Lauril Sulfato de Sodio (SDS): su acción deergente contribuyó a desnaturalizar a

las DNAasas II.

- Altas concentraciones de sales como NaCl: Contribuyó a la precipitación de las

proteínas en general (incluyendo las ADNasas).

12.- La muestra de ADN obtenida fue leída en el espectrofotómetro UV a 3

longitudes de onda:

DO230: 0,36
DO280: 0,39
DO260: 0,75
 ¿Qué se puede decir respecto a su pureza?

a) Relación 260/280 = 0.75 /0.39= 1.923

> Valores de pureza (1,8 – 2.0)

> Conclusión → Muestra pura de contaminación proteica y por sales

b) Relación 260/230 = 0.75 /0.36= 2.08

> Valores de pureza (2.0 - 2,2)

> Conclusión → Muestra pura de contaminación por carbohidratos o fenoles

13.- ¿Cuál es la concentración de ADN que tiene la muestra purificada?

(expresarla en µg/ml y ng/µl)

1 50 ug/ml

0.75 x ug/ml

X = 0.75 x 50 ug/ml = 37.5 ug/ml

1

X = 37.5 ug x 1000 ng x 1ml = 37.5 ng/ul

ml 1 ug 1000ul

14.- A la muestra se le hizo una electroforesis en gel de agarosa, ¿Para qué?

Se le hizo una electrophoresis en

gel de agarose para comprobar la

integridad del ADN de la muestra

(grado de fragmentación)
15.- En el método desarrollado, ¿Cómo obtendría ARN puro?

Durante la precipitación con alcohol isopropílico este hace precipitar

selectivamente al DNA, mas no al RNA (el cual queda como un sobrenadante);

con una varilla de vidrio Podemos enrollar practicamente todo el DNA, quedando

en la pipeta ARN puro; ahora para purificar la muestra de RNA, se agregaría

etanol.

16.- La cantidad de ADN/ml obtenida, ¿es adecuada para realizar con ella un

PCR? Explique

Sí, es suficiente cantidad ya que se obtienen 37.5 ng/ul de muestra y se necesita

como mínimo 5 ng/ul para realizar un PCR.

17.- ¿Cómo sería la gráfica de temperatura vs Absorbancia a 260 nm de un

ADN de doble hebra? ¿Cómo se determina el Tm en ell

18. - Averigüe el Tm para las siguientes secuencias:

ratCYP GATGCTGAGGACCAGGAAACCGC: Forward primer (5’-3’)

1A1
CAGGAGGCTGGACGAGAATGC Reverse primer (5’-3’)

Tm = 2(A + T) + 4(G + C)

➢ Los primers o cebadores no deben tenerTm muy diferentes entre sí

(menos de 2°C)
➢ Tm = 58 – 60°C
a) Tm1 = 2(7+2) + 4(8+6)

Tm1 = 18 + 56 = 74

b) Tm2 = 2(6+2) + 4(9+4)

Tm2 = 16 + 52 = 68

19.- La cubeta del espectrofotómetro donde se hacen las lecturas de las

muestras de ácidos nucleicos deben ser de cuarzo ¿Por qué?

Se utilizan cubetas de cuarzo, porque permite pasar la luz UV y permiten

mantener las muestras durnte el

experimento, además son resistentes a las ralladuras; sin embargo su costo es

muy elevado y bastante frágiles, por lo que se suelen usar cubetas de materiales

sintéticos que si bien no da mediciones tan precisas supple los principals

inconvenientes de las de cuarzo.

20.- ¿Cómo se haría un experimento para determinar el Tm de un ADN

bicatenario puro? Proponga un protocolo

A fin de determiner el Tm de una muestra, se extrae el DNA bicatenario, se

agrega un tampón adecuado y una temperatura inicial de 0°C, luego se tabula

las absorbancias a 260nm con las temperaturas 10, 20, 30…, los valores de

absorbancias obtenidos se trasladan al gráfico, obteniendo la función del Tm

para este experimento.

21.- ¿Qué es PCR? ¿Para qué se usa?

La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en

inglés (polymerase chain reaction) o como RCP, es una técnica de la biología

molecular cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento

de ADN particular de interés, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de

una sola copia de ese fragmento original, o molde.

Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras

la amplificación resulta mucho más sencillo identificar, con una probabilidad muy

alta, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas

(cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado. Estos

usos derivados de la amplificación han hecho que se convierta en una técnica

muy extendida, sobre todo en el ámbito de la investigación forense, pruebas

genéticas de paternidad, evluaciones médicas rutinarias; todo lo anterior con el

consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevar a cabo dicha

técnica.
RESOLUCIÓN DE LA PRÁCTICA N° 2

XERODERMIA PIGMENTOSA

CASO PROBLEMA

S.L.M es una paciente de 5 años de edad que acude al servicio de Urgencias

del Hospital Obrero Nº 2 en agosto de 2007. Antecedentes personales: madre de 23
años sana, padre de 27 años sano, sin antecedentes patológicos familiares. Producto
del cuarto embarazo nacida de un parto a término eutócico, llanto retardado, con
buena succión y alimentación. La madre refiere que desde el primer mes de vida
presentó erupción eritematosa en regiones expuestas al sol, que luego se fueron
tornando de color oscuro y luego se generalizaron, recibió tratamiento en base a
corticoides y antihistamínicos en varias oportunidades con mejoría relativa de las
lesiones.

Al examen físico de ingreso destaco la presencia de erupción en cara y manos

caracterizada por aumento de la pigmentación, entremezclada con áreas de
hipopigmentación y regiones con atrofia; se observan también escamas y
telangiectasias generalizadas y múltiples cicatrices en brazos y cara.

Figura 2.1. Lesiones en la cara tanto en vista de frente como lateral. Camargo, Rosario et
al. Xeroderma pigmentoso. Rev. bol. ped, La Paz , v. 47, n. 1, p. 16-18, 01-
2008
BASES MOLECULARES

La Xerodermia pigmentaria (XP) es una enfermedad de la piel que se hereda

con carácter autosómica recesiva y en donde el homocigoto muestra una marcada
tendencia a desarrollar cáncer de piel como consecuencia de la exposición al sol Los
heterocigotos son frecuentemente asintomáticos. La mayor parte de pacientes son
hijos de matrimonios consanguíneos, lo que determina que en los países en donde
este matrimonio entre parientes sea más frecuente, también lo será la incidencia
de XP, como el caso de Egipto, Israel y Japón. En general, la frecuencia de esta
enfermedad es de uno cada 250 000 nacimientos. Aunque la enfermedad es
sospechada por los efectos de la luz solar sobre las zonas expuestas (piel y ojos),
existen variedades de XP en donde el compromiso neurológico es muy serio,
determinando un cuadro de una progresiva deficiencia mental, sordera, ataxia,
retardo en el crecimiento, microcefalia y arreflexia. No existe por el momento un
tratamiento efectivo para esta enfermedad por lo que solo se recomienda evitar la
exposición al sol y realizar la extirpación de los tumores que vayan apareciendo.

El defecto molecular en la xerodermia pigmentaria está asociado con un

defecto en el mecanismo de reparación por escisión del DNA dañado por la luz
ultravioleta. La reparación de lesiones en el DNA mediante la escisión de nucleótidos
es una muy buena medida que toma el organismo para reparar el DNA dañado del
genoma. Y no obstante haberse avanzado mucho en lo que respecta al mecanismo
de reparación, aún quedan muchas dudas referentes a la conexión que tiene con la
XP y en el rol de la reparación del DNA dañado y el cáncer de piel.

La lesión más significativa que determina la luz ultravioleta sobre el DNA

consiste en la formación de los dímeros de timina. Dos timinas adyacentes (en
una misma cadena de DNA) se sueldan covalentemente, determinando problemas
muy serios en el proceso de replicación del DNA, que finalmente explican
molecularmente las alteraciones que presentan los pacientes con XP.
Mecanismo de la Reparación de lesiones en el DNA por escisión
El mecanismo de reparación de las lesiones en el DNA usando la escisión,
ocurren todos los organismos y se caracteriza por 4 etapas secuenciales: incisión,
escisión, resíntesis y ligazón. La etapa de incisión corresponde al reconocimiento
de la lesión y es a su vez etapa limitante del proceso. Durante la etapa de escisión
un sector que incluye a la lesión, en una de las cadenas, es retirado, dejando un
espacio. En la resíntesis se llena este espacio con los nucleótidos correctos mediante
la participación de la polimerasa I.

Finalmente se suelda el DNA con la formación del enlace éster fosfórico

entre el fosfato y el grupo OH del C-3' de la pentosa. Para esta última etapa las
bacterias usan la energía derivada de la liberación del pirofosfato del NAD; en tanto
que en los eucariontes se usa la energía derivada de la hidrólisis del ATP.

Si bien el mecanismo general de reparación por escisión es muy parecido en

bacterias y eucariontes, existen algunas distinciones importantes. La actividad
exonucleásica en las células humanas implica la participación de más proteínas
(16- 17 diferentes proteínas) que las 4 descritas para bacterias (UvrA, B, C y D).-
De estas proteínas necesarias para eucariontes, siete han podido ser identificadas
usando test de complementación, lo que igualmente corresponde a las siete
variantes genéticas de la xerodermia pigmentaria. Las proteínas así detectadas son
simbolizadas de la siguiente manera: XPA, XPB (ERCC3), XPC, XPD (ERCC2), XPF,
XPG, ERCC1, HSSB(RPA).

BIBLIOGRAFÍA
1. Tanaka K y Wood R.D. Xerodermia pigmentosum and nucleotide excisión repair
of DNA. TIBS: 83, 1994

2. Montgomery R., Conway T., Spector A and Chappell D. Biochemistry: acase

oriented approach. VI Ed. Mosby. 1998 p 487

3. Chu G and Chang E. Xerodermia pigmentosum group E cells lack a nuclear

factor that bind to damaged DNA. Science 242 : 564,1988

4. Cleaver J.E. Xerodenna Pigmentosum. En The metabolic basis of inherited

disease - Stambury J y col. V Ed. Mc Graw, 1990, p 1227
INTERROGANTES

1. Cuáles son las lesiones más importantes que determina la luz ultravioleta
y cuales longitudes de onda provocan estas lesiones?

La piel se puede quemar si es sometida a exposiciones intensas y prolongadas de luz

UV que pueden llegar a dañar las estructuras en el corion y causar foto-envejecimiento

prematuro de la piel, así como elastosis solar.

En estas zonas se produce inmunodepresión, y se desencadenan procesos oxidativos

donde se generan especies reactivas del oxígeno (ROS) que pueden causar el daño a

las proteínas celulares, lípidos, y carbohidratos. También pueden generarse especies

reactivos del nitrógeno y este exceso de radicales libres provoca una cascada de eventos

que propician un deterioro progresivo de las estructuras y funciones celulares.

• La radiación UVA (315 – 400nm) se considera como la “radiación de

envejecimiento” y es capaz de penetrar profundamente en la epidermis y en la

dermis de la piel. Es más eficaz que la UVB en producir oscurecimiento de la

melanina en la epidermis (hiperpigmentación). La lesión de UVA tiende a causar

necrosis de las células endoteliales, dañando los vasos sanguíneos dérmicos.

Dado que este tipo de radiación puede producir daño estructural al DNA y dañar

el sistema inmunológico, puede llevar a la formación de cáncer. La misma se ha

relacionado con el 67% de los melanomas malignos.

• La radiación UVB (280 – 315nm) se considera como la “radiación de quemaduras”.

Posee 1000 veces mayor capacidad patogénica que la UVA. Es capaz de penetrar

en la epidermis actuando principalmente a nivel de la capa basal de células,

dañando el genoma de los queratinocitos, las células vitales del tallo de la

epidermis. Produce efectos biológicos adversos directos e indirectos por ejemplo:

 formación de fotoproductos, isomerización de trans- a cis- ácido urocánico,

inducción de la actividad ornitina descarboxilasa, estimulación de la síntesis de

DNA, detención del ciclo celular, fotoenvejecimiento prematuro y

fotocarcinogénesis

2. Haga un esquema y explique cómo es el mecanismo de reparación por escisión

de nucleótidos en bacterias. Que diferencia tiene con la reparación de la lesión

de la luz UV por el mecanismo directo (fotoreactivación).

3. Haga un esquema y explique cómo es el mecanismo de reparación del ADN

por escisión de nucleótidos en eucariontes, destacando sus diferencias con

su contraparte bacteriana.

El mecanismo de reparación ADN por escisión de nucleótidos, ocurren todos los seres

vivos que poseen como material genético el ADN; se caracteriza por poseer 4 etapas

básicas: Incisión, escisión, resíntesis y ligazón. La etapa de incisión corresponde al

reconocimiento de la lesión, en la etapa de escisión se elimina una porción del ADN que

posee el error, el espacio entonces queda vacío, para llenarlo en la resíntesis se

sintetizan y acoplan nuevos desoxirribonucleótidos para reemplazar a los que se

retiraron.

La principal diferencia entre ambos procesos son las proteínas implicadas, ya que en

procariontes son apenas 4 principales (UvrA, UvRB, UvRC y UvRD), mientras en

eucariontes son más de 25, otras diferencias son que en eucariontes el oligonucleótido

escindido es más largo que en procariontes, y las fuentes energéticas utilizadas (En

procariontes se usa NAD y en eucariontes ATP).

EUCARIONTES PROCARIONTES
4. En una tabla, haga un listado de los diferentes genes afectados en las diferentes

variantes de XP. Indique la localización cromosómica, la función de su producto

(proteína) en el momento de la reparación de las lesiones en el DNA y las

características clínicas.
Existen ocho tipos genéticos distintos de Xerodermia Pigmentosa, cada tipo se

caracteriza por un cambio distinto en los genes del sistema de reparación del ADN; siete

de los ocho tipos muestran una disminución en la actividad de uno de los sistemas de

reparación del ADN; el octavo tipo muestra una disminución en la actividad de otro

sistema de reparación del ADN, y este último tipo de XP-V es conocido como forma

“variante”, mientras que los otros siete tipos son conocidos como grupos de

complementación: A, B, C, D, E, F y G.

5. Cómo son las pruebas de complementación que han permitido tipificar las

variantes genéticas en la XP?

Son agrupaciones de las distintas variantes de la XP que tras producirse la fusión de

las células in vitro de 2 pacientes de diferentes grupos, la lesión en el ADN es reparada

recíprocamente, esto debido a que las variantes de XP se diferencian por el gen mutado

que existe en el paciente, al combinarse mutuamente, completan los genes que les

faltan. Los más frecuentes son el A, C y XP-V.

6. Cómo es que los defectos moleculares en la XP podrían explicar la

predisposición al cáncer?

Las investigaciones han determinado que en muchos cánceres de la piel existen

mutaciones principalmente en dos tipos de genes.

• A los genes que ayudan a las células a crecer, dividirse y a mantenerse vivas se

les denominan oncogenes.

• Los genes que mantienen el control del crecimiento celular reparan los errores en

el ADN, o que provocan que las células mueran en el momento oportuno se llaman

genes supresores de tumores.

El cáncer puede ser causado por mutaciones en el ADN (u otros tipos de cambios) que

mantienen activados a los oncogenes, o que desactivan los genes supresores de

tumores. Estos tipos de cambios genéticos pueden ocasionar que las células crezcan

fuera de control. Por lo general, es necesario que ocurran cambios en varios genes

diferentes para que una célula se torne cancerosa.

En su estado normal estos genes reducen la probabilidad de que una célula en un

organismo multicelular se transforme en una célula cancerosa, por lo que su mutación

provoca la omisión de dicha regulación.

Lo anterior explica parcialmente la relación existente entre la radicación solar y el cáncer

de piel, y por qué las personas con XP poseen una alta predisposición a contraer

cáncer de piel.

7. Proponga una explicación molecular de la heterogeneidad genética observada

en al xerodermia pigmentaria

La xerodermia pigmentosa o pigmentaria es ocasionada por mutaciones en 8 genes

implicados en la transcripción/reparación del ADN. 7 de estos genes, de XPA a XPG

(ERCC5), están implicados en la reparación del ADN por escisión de nucleótidos

(NER). El gen POLH (XPV) codifica para la DNA polimerasa necesaria para la

replicación del ADN con daños inducidos por radiación UV. XPA Y DDB2 se ligan al ADN

dañado, ERCC3 y ERCC2 codifican proteínas helicasas de sentido 3’ – 5’ y 5’ – 3’

respectivamente, la proteína producida por XPC se encarga de reconocer al ADN dañado

y ERCC4 y ERCC5 codifican para endonucleasas. Por lo anterior podemos determinar

que debido a la variedad de funciones que desempeñan los genes alterados en las

distintas variantes de XP existe una gran heterogeneidad de manifestaciones clínicas

que pueden presentar los pacientes con xerodermia pigmentosa.

8. Qué avance(s) importantes puede Ud. señalar se han conseguido con el uso

de los sistemas libres de células en el estudio de las bases moleculares de la XP?

Este procedimiento ha permitido determinar el tamaño de fragmentos de ADN que se

retiran,el número de proteínas que participan en la reparación de lesión en el ADN y

sus diferencias comparativas entre procariontes y eucariontes.

9. Qué información se pudo obtener con respecto a la proteína XPB humana con

la utilización de modelos de animales?

La utilización de modelos animales para el estudio de enfermedades dermatológicas con

base genética permite disminuir los costos investigación si se hicieran en humanos,

debido a que algunos como el ratón poseen una estructura dérmica similar a la humana,

por supuesto, estoy estos mismos deben realizarse tomando en consideración la bioética

laboral.

La primera caracterización de un alelo mutante de un gen de la subunidad TFIIH fue el

gen haywire (hay), que codifica la subunidad XPB de Drosophila. Este alelo, llamado

haync , se identificó en un cribado genético de genes que interactúan con la tubulina

específica del testículo y generan esterilidad masculina.

Curiosamente, también se observaron defectos en el desarrollo del sistema

nervioso en mutantes del hay, lo que demuestra que estos defectos se

correlacionan con un aumento de la apoptosis durante el desarrollo del cerebro de las

moscas. Por lo tanto, estos estudios mostraron que defectos similares, pero no idénticos,

a los observados en humanos pueden estudiarse en la mosca.

la eliminación de p8 (KO) en ratones fue letal para el embrión. Un modelo de ratón con

alteraciones en XPB que causan una combinación de XP y CS en humanos mostró

NER solo parcialmente defectuoso e hipersensibilidad a los rayos UV en los ojos y la

piel. Por otro lado, los modelos de ratón de XP y CS en los que se mutó XPD fueron

más informativos, ya que además de una mayor sensibilidad a la radiación UV, los

ratones desarrollaron cáncer de piel, neurodegeneración y caquexia. Además, un

modelo de ratón de TTD en el que se mutó XPD presentó cabello quebradizo similar

al TTD y envejecimiento acelerado. Estos modelos de ratón han sido útiles para obtener

una mejor comprensión de los efectos de estos síndromes relacionados con TFII
RESOLUCIÓN DE LA PRÁCTICA N° 3

FIBROSIS QUÍSTICA

CASO CLÍNICO

F.L. es una niña caucásica de 5 años fue remitida a pediatría porque tenía un
peso considerablemente inferior al normal para su tamaño. Desde su nacimiento ha
tenido episodios ocasionales de obstrucción del intestino delgado
espontáneamente reversible.

Estos episodios se superponen y los síntomas gastrointestinales sugieren un

grado de malabsorción de lípidos de la dieta, como heces malolientes voluminosas
y relucientes 2 a 3 veces al día. El análisis de las heces indica que contenían una
gran cantidad de lípidos; su historia clínica reveló que sufría de repetidas
infecciones del tracto respiratorio, muchas de las cuales requirieron de tratamiento
con antibióticos. Ella ha experimentado brotes recurrentes de bronquitis bacteriana
en los últimos 10 meses, cada vez causados por Pseudomonas aeruginosa. Una
prueba de sudor con iontoforesis cuantitativa de pilocarpina fue inequívocamente
positiva (se encontró exceso de sodio y cloruro en su sudor en dos ocasiones).

En base a estos hallazgos, el pediatra informó a sus padres que F.L.

probablemente tiene fibrosis quística (FQ). Se envió una muestra de su sangre al
laboratorio de investigación genética y de biología molecular para determinar
específicamente cuál de las muchas mutaciones genéticas potenciales que se sabe
que causan FQ estaba presente en sus células.

BASES MOLECULARES

La fibrosis quística, una enfermedad autosómica recesiva, es la enfermedad

hereditaria letal del origen monogénico más común en la raza blanca. Se produce
por mutaciones en el gen CFTR que codifica una proteína anómala que regula el
transporte de iones en las células epiteliales. Este transporte anormal de iones
ocasiona un espesamiento de las secreciones, lo que da lugar a la aparición de
manifestaciones clínicas, fundamentalmente a nivel respiratorio y digestivo. Su
frecuencia ha sido estimada en 1 por cada 2000 a 2500 nacimientos. Es una
enfermedad que compromete varios órganos y que presenta una triada característica:
(1) aumento en la concentración de cloro en el sudor. (2) una insuficiencia exocrina
pancreática que ocurre tempranamente. (3) enfermedad pulmonar caracterizada por
la presencia de secreciones mucosas sumamente densas que obstruye las vías
respiratorias menores y favorecen los procesos infecciosos.

Precisamente es la enfermedad pulmonar que condiciona la causa de muerte

más frecuente en los pacientes con CF.

Figura 3.1. Fisiopatología de la afectación respiratoria en FQ.

En los últimos años ha mejorado notablemente la expectativa de vida de los

pacientes con fibrosis quística, no siendo raro que actualmente sobrepase los 30
años de edad. En este sentido ha contribuido la mejor antibioticoterapia que hoy
tenemos, la terapia de reemplazo de las enzimas pancreáticas y el mejor apoyo
nutricional que puede darse a estos enfermos.
 En al año 1989, fue identificado y clonado el gen de la fibrosis quística. Esta
alteración genética es debida a la aparición de mutaciones en el gen regulador de
la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), mediante
estudios en familias con fibrosis quística se determinó que el gen comprometido
estaba localizado en el brazo largo del cromosoma 7 en base a establecer la relación
con muchos RFLP que correspondían a dicho cromosoma.

Posteriormente se delimito una región más pequeña del cromosoma 7, que

contenía dicho gen (7q31-32) estudiando las mutaciones que se detectaron en
estos pacientes se precisó mejor la localización del gen. Con parte de él se pudo
estudiar los cDNA (DNA complementario) elaborados a partir de mRNA de células
granulares sudoríparas. Se encontró un clon positivo y pudo secuenciarse un cDNA
de aproximadamente 6000 bp que codificaba para una proteína.

El gen de la CFTR consta de 250 Kb, distribuidos en 27 exones y codifica

para un mRNA de 6.5 Kb. Este mensajero se traduce en una glicoproteína de 1480
residuos de aminoácidos, la proteína CFTR. Esta proteína está situada en la
membrana apical de las células epiteliales de diferentes sistemas y órganos,
regulando los canales de transporte de cloro y sodio y la activación de otros
canales secundarios que participan en el transporte de electrolitos. Este transporte
anormal de iones ocasiona un espesamiento de las secreciones, lo que da lugar a
la aparición de manifestaciones clínicas a nivel respiratorio (afectación pulmonar
progresiva) y digestivo (insuficiencia pancreática y hepatopatía), sin olvidar otras,
como la deshidratación por pérdida de iones en sudor o la azoospermia obstructiva
por agenesia de los conductos deferentes, que ocasiona infertilidad en los varones.

Esta proteína de membrana contiene dos porciones, cada una de las cuales
tiene 6 regiones transmembrana (Figura 3.2). Tiene dos dominios que unen ATP y
un domino regulatorio, que experimenta fosforilación por una proteína quinasa
cAMP dependiente. La función de la proteína CFTR es la de un canal de cloro. En
los conductos sudoríparos las células de la fibrosis quística son incapaces de
reabsorber los iones cloro, explicando la alta concentración de cloro que tienen
estos pacientes en el sudor.
Figura 3.2. Esquema de la proteína CFTR. Presenta dos dominios que atraviesan 6 veces
cada uno la membrana y dos dominios de unión para el ATP y un dominio
regulador R

La actividad de la proteína CFRT es regulada por fosforilación, sin embrago

no solo esto es necesario para conseguir que funcione como canal de cloro, tiene
que unir e hidrolizar el ATP a nivel de su dominio y así se abre el canal. Los
movimientos del cloro a través del canal se determinan por la gradiente
electroquímica y no requiere de mayor energía.

A fecha de hoy, se han descrito 2.007 mutaciones del gen CFTR, siendo la
mayoría de ellas, mutaciones puntuales mínimas en las que solo se ve afectado un
nucleótido que causa diferentes efectos. La primera mutación descrita, y la más
frecuente a nivel mundial, es la delección a nivel del residuo 508 (F508) y determina
una de las formas más severas de la enfermedad. La siguiente mutación que
compromete con mayor frecuencia se localiza en la posición 504, representa el 2,4
%. Pero existen otras mutaciones específicas cuya frecuencia varía entre los
distintos grupos étnicos. Dependiendo del efecto a nivel de la proteína, las
mutaciones del gen CFTR pueden agruparse en seis clases funcionales (Figura 3.3.).
 Figura 3.3. Clases de mutaciones de CFTR. Tomado de Rowe SM, Miller S, Sorscher EJ.
Cystic Fibrosis. N Engl J Med. 2005; 352:1992-2001.

Las mutaciones de clase I conducen a un codón de parada prematuro en el ARN

mensajero que impide que la proteína se traduzca al completo. Por tanto, la proteína
producida es corta y no funcionante. Las mutaciones de la clase II codifican una
proteína mal plegada, estructuralmente anormal, y que se elimina por el retículo
endoplásmico antes de llegar a la superficie de la célula. A este grupo pertenece la F508.
En las mutaciones de las clases III a VI las proteínas llegan a la superficie de la célula,
pero no funcionan adecuadamente. En el caso de las mutaciones de clase III, tienen
disminuida la activación del canal y permanecen cerradas. Las mutaciones de clase IV
provocan una disminución de la conductibilidad de iones a través del canal. Las
mutaciones de clase V codifican proteínas en menor cuantía, que resulta en una cantidad
reducida de CFTR en la superficie celular, por lo que se produce una cierta función, pero
a un nivel disminuido. Finalmente, las mutaciones de la clase VI conducen a una vida
media acortada, debido a la inestabilidad de la proteína y también pueden dañar la
regulación de los canales vecinos a la CFTR en la superficie celular. Algunas
mutaciones pueden tener propiedades de más de una clase. Las mutaciones de clase I,
II y III se conocen como “mutaciones graves”, ya que se asocian con formas clínicas más
graves, mientras que las mutaciones de clase IV y V son “mutaciones leves”, asociadas
con formas clínicas menos severas.

BIBLIOGRAFIA
1. RIORDAN JR; ROMMENS JM: KEREM B. Y col (1989). Identification of cystic fibrosis
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2. MONTGOMERY R; CONWAY T. SPECTOR A. And CHAPPELL D.
Biochemistry. A case-oriented approach. VII Ed. Mosby, 1977.
3. JAMESON J. Principles of Molecular Medicine. Humana Press, 1998.
INTERROGANTES

1.- En base a la lesión molecular que tienen los pacientes de fibrosis quística,

¿Cómo explica los procesos infecciosos respiratorios que presentan

frecuentemente los pacientes con FQ?

El insuficiente o nulo funcionamiento de la proteína CFTR provoca alteraciones en el

transporte de los iones, a nivel de todas las células donde se expresa esta proteína,

existiendo manifestaciones clínicas relevantes en el aparato respiratorio, el sistema

digestivo (páncreas, hígado), los conductos deferentes y las glándulas sudoríparas,

dando lugar a que las secreciones del moco habitual que cubre los epitelios sean más

espesas.

Hablando de la enfermedad pulmonar en la FQ afecta fundamentalmente a las vías

aéreas, en tanto que los alvéolos y el intersticio pulmonar no son afectados hasta etapas

muy tardías. La expresión del CFTR se da en las células epiteliales de las vías aéreas,

sobre todo en las células serosas de las glándulas submucosas bronquiales. La

alteración del transporte iónico produce una deshidratación del líquido periciliar (es un

medio acuoso, de baja resistencia, ideal para el batido ciliar. Alberga moléculas con

actividad antibacteriana, antifúngica y antiviral como lisozima, lactoferrina, siderocalina,

lactoperoxidasa y defensinas, facilitando la acción de macrófagos epiteliales) de la

superficie de la vía aérea. El aumento de viscosidad del moco impide un correcto

aclaramiento mucociliar. Todo ello favorece la colonización bacteriana crónica asociada

a una respuesta inflamatoria neutrofílica alterada y mal regulada. Ambos procesos, la

infección y la inflamación crónica, producen un círculo vicioso de destrucción tisular,

obstrucción del flujo aéreo, aparición de bronquiectasias y otras complicaciones, que

determinan una destrucción del tejido pulmonar y, finalmente, conducen a un fallo

respiratorio que produce la mayor parte de los casos de morbimortalidad por esta

enfermedad.
2.- ¿En qué consiste la prueba del oligonucleótido alelo especifico en el

diagnóstico de las enfermedades genéticas? ¿En qué se diferencia del RFLP?

Un oligonucleótido específico de alelo (ASO) es una pieza corta de material sintético

ADN complementaria a la secuencia de un ADN diana variable. Es una herramienta

común utilizada en Prueba genética, forense, y Biología Molecular investigación.

Un ASO es típicamente un oligonucleótido de 15-21 bases de nucleótidos en longitud.

Está diseñado (y utilizado) de una manera que lo hace específico para una sola versión,

o alelo, del ADN que se está probando, juegan un papel en su especificidad. Estas

sondas generalmente se pueden diseñar para detectar una diferencia de tan solo 1 base

en la secuencia genética de la diana. Para ser detectado después de que se ha unido a

su objetivo, el ASO debe estar marcado con una etiqueta radiactiva, enzimática o

fluorescente.

El análisis ASO es solo uno de los métodos utilizados para detectar polimorfismos

genéticos. Una alternativa al ASO es la Técnica de Polimorfismos de longitud de

fragmentos de restricción, más conocida como RFLP (del inglés: Restriction Fragment

Length Polymorphism) es una técnica de biología molecular que nos permite detectar

fragmentos de ADN de diferentes longitudes. Esta técnica se basa en la acción de las

enzimas de restricción, las cuales reconocen secuencias específicas de nucleótidos del

ADN y hacen un corte en la cadena. Si exponemos dos cadenas que tengan

diferentes alelos, el corte de la misma enzima nos va a producir fragmentos de ADN

de diferentes longitudes. Ya que los polimorfismos específicos de cada alelo

modificarán el reconocimiento por parte de la enzima y por ende, su capacidad de

corte.
3.- En el caso de nuestra paciente (F.L.) y de sus familiares, se utilizó el método del

oligonucleótido alelo específico. Para tal efecto se amplifico mediante PCR el gen CFTR

de la paciente, de ambos padres y de sus dos hermanos transfiriéndose el material a

filtros de nitrocelulosa y se hibridizó con una prueba normal (N) y con una prueba

pan la mutación ∆F508. Los resultados se muestran en el siguiente grafico en donde las

manchas oscuras indican unión a la prueba.

Padre Hermano Hermano Paciente Madre

Mayor Menor

Prueba Normal

Prueba para
F508

FIGURA.- Autoradiograma

¿Qué explicación le merecen estos resultados?

Podría indicarnos que tanto la madre, el hermano menor y el padre son heterocigotos

(un gen normal y el otro alelo mutado), por lo que no demostrán la enfermedad. En el

caso del hermano mayor el tendría ambos genes normales, pero en el caso de la

paciente, ella sería homocigota con ambos genes mutados y por ende expresaría el

fenotipo de la enferemedad de la Fibrosis Quística.

4.- Se señala que el estudio que se hizo de las bases moleculares de la FQ resulta

un claro ejemplo de genética reversa. ¿Qué significa esto?

La genética directa y reversa

La genética clásica o directa se basa en la selección de un fenotipo como el color de la

semilla del guisante o la identificación de un gusano longevo y la búsqueda posterior del

gen asociado a estos fenotipos. En cambio, en la genética reversa se dirige una

modificación determinada a una secuencia específica del genoma con el objetivo

de reemplazarla o mutarla (knock-in), eliminarla (knock-out), o bien introducir una copia

extra para incrementar su expresión (transgénico ).

se alteran secuencias específicas y en seguida se busca el fenotipo resultante. Y en el

caso de la FQ se realizó esto, primero se alteraron secuencias del ADN y recién se

busco el fenotipo resultante.

5.- ¿Cómo explica la esteatorrea descrita en los pacientes con FQ?

La fibrosis quística es una de las causas de grasa en las heces, sucede debido a

alteraciones genéticas que llevan a la producción de secreciones muy espesas y

viscosas que pueden acumularse en algunos órganos y causar síntomas respiratorios y

digestivos. En el páncreas se produce la pérdida de la función de los acinos

pancreáticos y de los conductos pancreáticos, esto reduce la secreción de agua,

bicarbonato y enzimas, dando lugar a una mala digestión de grasas y proteínas; lo que

ocasiona las manifestaciones gastroenterológicas como la diarrea crónica con

esteatorrea, esteatorrea y disminución de la absorción de vitaminas liposolubles.

6.- Describa el fundamento de alguno de los dos métodos comúnmente

usados para secuenciar el DNA.

a. Método de Sanger: se basa en el proceso biológico de la replicación del ADN. Su

fundamentación está en el empleo de dideoxinucleótidos que carecen del grupo hidroxilo
del carbono 3', de manera que cuando uno de estos nucleótidos se incorpora a una
cadena de ADN en crecimiento, impide que esta cadena pueda continuar elongándose.
Esto sucede porque la ADN polimerasa necesita un grupo terminal 3’ OH para añadir el
siguiente nucleótido y el dideoxinucleótido incorporado carece de este grupo hidroxilo.
Se necesitan los siguientes componentes:
• un ADN de cadena sencilla que actúa como molde
• un cebador para iniciar la síntesis de ADN
• los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato (dATP, dGTP, dCTP y dTTP)
• la enzima ADN-polimerasa
El método comienza una vez que se aísla y se clona el ADN que se desea secuenciar.
Este DNA se desnaturaliza y se emplea una sola hebra para la secuenciación. En la
secuenciación se utiliza un cebador (denominado “primer” en inglés), que se encarga de
suministrar el terminal 3’OH que necesita la ADN polimerasa para comenzar a elongar.
Se preparan cuatro tubos de reacción, cada uno con el ADN molde de hebra sencilla
que se desea secuenciar, con ADN polimerasa, con el “primer” y con los cuatro
nucleótidos trifosfatados.
A cada tubo se le añade una pequeña proporción de un dideoxinucleótido trifosfato; un
tubo con ddATP, otro con ddTTP, el tercero con ddGTP y el cuarto con ddCTP. En cada
uno de estos tubos se producen cadenas de ADN de distintas longitudes, todas las
cuales terminan en el lugar en el que se incorporó el dideoxinucleótido correspondiente
añadido al tubo. Los productos de las 4 reacciones, cada una conteniendo una pequeña
cantidad de uno de los cuatro dideoxinucleótidos, se cargan en un gel de acrilamida y
se someten a electroforesis. Así obtendremos un patrón de bandas en orden, del cual
es posible deducir la secuencia del ADN introducido. Mediante este método se puede
determinar la secuencia de moléculas de ADN de hasta 800 nucleótidos de longitud.

b. Secuenciación de nueva generación (NGS): El término hace referencia a las

tecnologías diseñadas para analizar gran cantidad de ADN de forma masiva y paralela.
Las pruebas basadas en NGS han revolucionado el estudio de los genomas, pues
permiten la lectura de millones de secuencias de ADN de forma masiva y paralela en un
menor lapso y a menor costo por base. Estas pruebas incluyen la secuenciación de
panel de genes, la secuenciación completa del exoma y la secuenciación completa del
genoma. El análisis de sus resultados es complejo y requiere un proceso bioinformático
y clínico exhaustivo para su adecuada interpretación. Las limitaciones de las pruebas
NGS incluyen aspectos técnicos como cobertura, profundidad y longitud de las
secuencias, las cuales se pueden solventar implementando buenas prácticas de
laboratorio.
7.- Si se detecta una mutación importante en el dominio NBD de la proteína CFRT,

que no afecta su procesamiento, ¿pero le impide la unión del ATP, que

alteraciones esperaría encontrar?

La actividad de la proteína CFRT es regulada por fosforilación, sin embargo no solo esto

es necesario para conseguir que funcione como canal de cloro, tiene que unir e hidrolizar

el ATP a nivel de su dominio y así se abre el canal. Así que si tenemos impedida la unión

con el ATP deberíamos esperar las mismas características a las observadas en la

mutación de la CFTR, parecida a una mutación de clase III donde se encuentra

disminuida la activación del canal y permanecen cerradas.

8.- Utilizando células de la mucosa oral de la paciente, se aísla el DNA y se

amplifico mediante el PCR el gen involucrado. Se secuencio dicho gen y el

resultado se muestra en la gráfica siguiente, en donde se encuentra

alteraciones en la secuencia con respecto al normal. A qué tipo de mutación

corresponde? ¿Qué alteración existirá en la proteína sintetizada

Consiste en una deleción de 3 pares de bases que provoca la pérdida de

fenilalanina en la posición 508 del gen, en el exón 10. Lo que lleva a la

inestabilidad del en nucleótido dominio 1 (NBD1) NBD1 interacciona de manera

no efectiva con dominio 2 (MSD2).

9.- Para determinar la causa de la anemia de un paciente, se toma una

muestra de hemoglobina y se observa que hay muchas más cadenas b que

cadenas a, lo que indica talasemia a. Para determinar las bases genéticas

de la talasemia, se aíslan los ácidos nucleicos de la sangre del paciente.

Durante el procedimiento de aislamiento de los ácidos nucleicos, se

requiere tratamiento de calor y álcali ¿Para qué?

Tanto los álcalis como el calor provocan que las dos cadenas de DNA se

separen. Los álcalis no rompen los enlaces fosfodiéster del DNA, pero sí

escinden los enlaces fosfodiéster del RNA, degradando el RNA en nucleótidos.

El RNA es monocateriano, no bicateriano. En el análisis de DNA, muchas

técnicas requieren su separación del RNA (el tratamiento con álcalis) y su

desnaturalización (separación de las cadenas dobles).

10.- ¿Por qué el código genético se define como degenerado y no

ambiguo?

El código genético no es ambiguo ya que cada triplete tiene su propio significado.

Todos los tripletes tienen sentido, o bien codifican un aminoácido en particular o

bien indican terminación de lectura. La mayoría de los aminoácidos se codifican

por al menos dos codones. La metionina y el triptófano son los únicos

aminoácidos que se codifican sólo por un codón. Pero cada codón codifica sólo

para un aminoácido o señal de stop.

El código genético es degenerado porque más de un codón puede codificar a un

solo aminoácido.

Finalmente se puede decir que el código genético es unidireccional, todos los

tripletes se leen en sentido 5’-3’.

11.- Muchos medicamentos que se usan para tratar cáncer inhiben

la replicación del DNA en tanto que algunos inhiben las vías que se

requieren para sintetizar proteínas a partir de ciertos genes ¿Cuál es

el paso que va desde la replicación de DNA hasta la síntesis de una

proteína?

El rRNA y el tRNA son parte del aparato de la síntesis de proteínas, pero las

secuencias de rRNA y de tRNA no codifican proteínas. El mRNA lleva la

información genética que se convierte en la secuencia de aminoácidos de una

proteína pero que se usa en el proceso de traducción.

Algunos fármacos inhibidores de la replicación del ADN son: 5-fluorouracilo.

Arabinosilcitosina. Capecitabina. Gemcitabina. Decitabina.

12.- Los antibióticos se pueden dirigir a las diferencias en el

procesamiento del código genético entre las bacterias y los humanos. En

la lectura del código genético en procariotes ¿Cuál es el proceso que

ocurre primero?

En los procariotes no hay núcleo, y la traducción comienza antes de que termine

la transcripción (acoplamiento de traducción y transcripción). Así, antes de que

el ribosoma pueda moverse de un codón al siguiente (transposición), o de que

la maquinaria de síntesis proteínica termine (vía factores de terminación), el

tRNA iniciador debe unirse y alinearse con el mRNA para iniciar la traducción.

13.- Uno de los fármacos que está tomando un hombre joven portador del

VIH, la principal causa del SIDA es AZT (3’-azido-3’-desotimidina), un

análogo de las pirimidinas. El paciente le pide al médico que le explique

por qué tiene que tomar el fármaco si no tiene síntomas del sida, y cómo

actúa este fármaco.

La zidovudina El AZT (3'-azido-3'-desotimidina),es un análogo (modificado en el

azúcar y misma base nitrogenada) al sustrato natural (nucleósido de timidina)

por lo que es competitivo con el centro activo y reacciona igual en las primeras

fases de la ruta metabólica (sustrato de reacción), una vez fosforilado, por la

célula, actúa como el nucleótido timidina utilizado en la síntesis de DNA pero el

cambio de un nucleófilo en 3'(-OH), por un electrófilo -N3 (azida) impide la

elongación de la cadena de ADN, provocando la muerte celular. Ello impide la

replicación de virus, ayudando a mantenerlo controlado.

Es eficaz frente al virus del sida porque la DNA polimerasa del virus del sida es

aproximadamente 100 veces más sensible al fármaco que la enzima celular.

14.- En un paciente con fibrosis quística causada por la mutación

ΔF508, la proteína reguladora de la conductancia transmembrana de la

fibrosis quística (CFTR) mutante se pliega incorrectamente. Las células

del paciente modifican esta proteína anómala mediante la unión de

moléculas de ubiquitina. ¿Cuál es el destino de esta proteína CFTR

modificada?

El destino de esta proteína es ser degradada por el proteosoma. La ubiquitación

normalmente marca proteínas viejas, dañadas o mal plegadas para ser

destruidas en el proteosoma citosólico. No se conoce ningún mecanismo celular

para la reparación de las proteínas dañadas.

El objetivo del proyecto «Expanding the knowledge on mammalian endoplasmic

reticulum-associated degradation» (MAMMALIAN ERAD), financiado con

fondos comunitarios, consistió en determinar los mecanismos de la ERAD

destinados a eliminar proteínas mal plegadas con mutaciones comunes.

Los resultados mostraron que una enzima de la ERAD, gp78, era clave en el

proceso de degradación de la proteína mutada asociada a la fibrosis quística.

Por lo tanto, esta enzima constituye una posible diana para futuros tratamientos.
15.- ¿Cómo se pretende tratar esta enfermedad mediante terapia genética?

La terapia génica puede ser una potencial alternativa para curar la fibrosis

quística, el objetivo es entregar una copia funcional del gen a las células

y programarlas para comenzar a hacer las copias funcionales; pero para que la

terapia génica de la FQ funcione, es fundamental una administración eficiente de

CFTR sano dentro de las células de la vía aérea. Para facilitar este proceso, se

administra el ADN de CFTR en las células mediante diferentes vehículos

denominados vectores. Entre los utilizados con más frecuencia se incluyen virus

modificados genéticamente y agentes no virales como los liposomas. Aunque los

virus son generalmente más eficientes, se precisa una administración repetida

para conseguir una expresión mantenida de CFTR, lo que hasta la fecha ha sido

imposible con dichos vectores.

RESOLUCIÓN DE LA PRÁCTICA N° 4

ENFERMEDAD DE CREUTZFELDT-JAKOB

INTRODUCCION

Las proteínas mal plegadas habitualmente son eliminadas por degradación

proteolítica. Varias enfermedades neurológicas ilustran las consecuencias de la
acumulación celular de agregados de proteínas mal plegadas o de sus productos
de degradación parcial.

Antes de que se identificaran los priones, se creía que la enfermedad de

Creutzfeldt-Jakob y otras encefalopatías espongiformes provenían de virus. Los
priones (agentes infecciosos proteicos) son mucho más pequeños que los virus y
distintos de estos, de las bacterias y de todas las células vivas, porque no
contienen material genético, pero poseen algunas características de los patógenos
víricos o microbianos.
‘

Los priones, pueden alojarse hasta 30 años en el cerebro para después

manifestarse y causar daño en este órgano, reveló una reciente investigación del
Centro para el Control y Prevención de Enfermedades de Estados Unidos (CDC).

Las enfermedades priónicas son un grupo de desórdenes neurodegenerativos

transmisibles y progresivos causados por la conformación anómala y consecuente
agregación de unas proteínas “infecciosas” llamadas priones. Las características
típicas de todos los perfiles clínicos son una uniforme, progresiva y fatal encefalopatía
con demencia, dificultad en la coordinación de los movimientos voluntarios y
aparición de movimientos bruscos e involuntarios.

En las enfermedades por priones, una glucoproteína de 254 residuos,

llamada PrP o proteína priónica, codificada por el gen PRNP (cromosoma 20)
soluble en disoluciones de detergentes suaves, que se encuentra predominando en el
tejido nervioso. La función fisiológica de esta proteína no es totalmente conocida, pero
es muy probable que intervenga en la plasticidad neuronal, transducción de señales,
adhesión celular y regulación y distribución de los receptores de acetilcolina. La proteína
PrP en su conformación nativa PrPC es rica en hélices y contiene una región altamente
inestable de cinco repeticiones en tándem, cada una compuesta por ocho aminoácidos.
Mutaciones en esta región, así como en otras partes del gen de forma secundaria,
provocan que la proteína adquiera una conformación anómala (plegamiento incorrecto)
y no funcional por la aparición de hojas en su estructura. La propagación de estos
priones con conformación anormal es la que conduce al desarrollo de las diferentes
enfermedades priónicas. Varias mutaciones de la PrPC están implicadas en la formación
de la PrPSc infecciosa.

Esta proteína priónica anómala se denomina scrapie (PrPSc), o prión (la

palabra scrapie se refiere a una enfermedad por priones observada por primera vez
en las ovejas). El scrapie (tembladera de las ovejas) se denomina así porque las
ovejas tienden a restregarse contra árboles, postes u otras estructuras similares y
se arrancan la lana. Esta isoforma patológica resulta del plegamiento anormal de la
isoforma normal (PrPC) con mayor contenido de estructura de lámina beta y, por
consiguiente, mayor resistencia a la digestión proteolítica y mayor agregación
intracelular por ser mucho menos soluble que polimeriza en fibras amiloides mediante
interacciones entre los segmentos con estructura de los monómeros insolubles que
causan las patologías neurales. La formación de los polímeros amiloides que forma
la fibra amiloide es irreversible.

Algunas de las enzimas en el cerebro no consiguen degradar los priones

recién formados y, por lo tanto, se acumulan lentamente. Los priones también
hacen que otros PrPC cercanos se conviertan en priones y así continúa el
proceso. Cuando se alcanza un número determinado de priones, aparece la
enfermedad. Los priones nunca se convierten de nuevo en PrPC normales.

La PrPC está presente en todas las células del cuerpo, pero en el encéfalo se
observa una alta concentración sobre todo en la superficie exterior de las neuronas.
Por lo tanto, la mayoría de las enfermedades por priones afectan de forma
predominante o exclusiva al sistema nervioso.

El cambio más frecuente causado por priones es la formación de pequeñas

burbujas en las células cerebrales y el encéfalo se llena de agujeros microscópicos.
Cuando se examinan las muestras de tejido cerebral al microscopio, estas se
asemejan a una esponja (de ahí el término espongiforme). Al cabo de un
tiempo, las células afectadas dejan de funcionar y mueren.

Las dolencias humanas causada por priones comprenden el kuru, la

enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ) y una forma de ECJ derivada de la
encefalopatía espongiforme bovina (BSE), popularmente conocida como
“enfermedad de las vacas locas” en el ganado. Estas enfermedades difieren en el
curso y en la rapidez de su desarrollo, pueden ser heredadas, espontaneas o ser
resultado de una infección, pero todas causan neurodegeneración como ataxia,
demencia y parálisis, y finalmente la muerte. El examen patológico del cerebro
muestra degeneración espongiforme (vacuolas) y acumulación intracelular de
depósitos de placa amiloide en forma de bastón.

La enfermedad puede ser causada por una mutación heredada (enfermedad

familiar), una mutación espontanea o un proceso infeccioso. La infección se
produce por consumo de comida, en especial tejido nervioso, que contenga PrPSc.
La forma infecciosa se observó por primera vez en los nativos de Nueva Guinea, que
manifestaban una encefalopatía espongiforme transmisible denominada Kuru, en la
cual los priones se transmitían a través de la práctica del canibalismo ritual, consumo
de cerebro humano y la inclusión de vísceras infectadas en los piensos para animales
extendió el temblor ovino y la BSE. Los humanos han adquirido la variante ECJ al
consumir ternera infectada con la BSE. La PrPSc actúa alterando la conformación de
la PrPc celular normal; PrPSc funciona como una chaperona facilitando la adopción
de la conformación PrPSc por parte de la PrPc existente o recién sintetizada. La
forma resistente a las proteasas se acumula junto con fragmentos de proteólisis
parcial y forma los agregados característicos de la enfermedad (aunque no son
necesariamente la causa de sus síntomas).
 El proceso de “infectividad” priónica ocurre a través de un mecanismo por el
cual la proteína anómala o PrPSc actúa como plantilla para convertir PrPc en la
forma aberrante (de ahí que hablemos de “infección” o propagación). Cuando la
PrpSc, entra en contacto con la PrPc, se forma un complejo resistente a las proteasas
celulares que altera la estructura de la proteína normal, convirtiéndose ésta en PrPSc.
Al disociarse el complejo la nueva proteína anómala actúa como plantilla para la
malformación de otras proteínas nativas, iniciando una cascada de “infectividad”
exponencial que conduce al desarrollo de daño neuronal y, en el peor de los casos,
a la muerte.

Esta enfermedad es realmente tan antigua como el ser humano. Los primeros
casos de animales enfermos por encefalopatía espongiforme se declararon en el
Reino Unido en 1986 y a partir de entonces se tiene constancia de cientos o incluso
miles de casos alrededor del mundo. En 1996 se detectó por primera vez en
humanos la variante de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (vCJD) que se
relacionó con la epidemia en el ganado vacuno. Esta enfermedad es la patología
priónica que tiene una mayor importancia para la salud pública ya que resulta,
principalmente, del consumo de carne de animales “infectados” por priones, así como
de productos derivados de animales contaminados, principalmente vacunos en este
contexto. La toma de priones a través del epitelio intestinal hace que estos se
acumulen en el tejido linfoide y que finalmente lleguen al sistema nervioso
central, lugar donde ejercen el daño. El siguiente esquema muestra el proceso de
contagio de la enfermedad desde los animales al ser humano.

Existen cuatro formas etiológicas de ECJ en humanos: la forma esporádica

(esECJ), familiar (fECJ), iatrogénica (iECJ) y la variante (vECJ), cada una con
características particulares. La esECJ es la más común, representa alrededor del
85% de los casos de ECJ, con una incidencia anual de 1 caso/millón habitantes,
con mayor frecuencia en individuos con predisposición genética. El diagnóstico
definitivo de esECJ se realiza mediante el estudio histopatológico; aunque
mediante pruebas diagnósticas como el electroencefalograma, el análisis del
líquido cefalorraquídeo y la resonancia magnética, se puede realizar un diagnóstico
probable.
 En el presente se reportan las características clínicas de seis casos con
diagnóstico definitivo por confirmación histopatológica de esECJ atendidos entre
los años 1998 y 2013 en el Departamento de Enfermedades Neurodegenerativas
del Instituto Nacional de Ciencias Neurológicas del Perú.

CASO 1
Varón de 64 años. Inicia con visión borrosa, mareos, inestabilidad para la
marcha, alteración de la memoria e insomnio. Al examen se le encontró parcialmente
orientado, con hemiparesia derecha y espasticidad, hiperreflexia y signo de Babinski
presente, rigidez en hemicuerpo izquierdo, dismetría bilateral; apraxia y compromiso
de memoria.

CASO 2
Varón de 35 años. Tiempo de enfermedad de un año; caracterizado por ánimo
depresivo, por lo que recibe fluoxetina. Meses después se añadió alteración de memoria
(corto y largo plazo) y “fallas en la escritura” (escritura incorrecta de algunas palabras).
Progresó con inestabilidad para la marcha, “olvidó la utilidad de las cosas” y presentó
pérdida del cuidado personal. En la evaluación se le encontró bradipsíquico,
desorientado, con conducta pueril, rigidez en hemicuerpo izquierdo, posturas distónicas,
mioclonías generalizadas, presencia de reflejo de prehensión y palmomentoniano;
fluencia verbal disminuida, repetición y nominación alteradas; apraxia ideatoria. En las
semanas siguientes: cuadriparesia espástica hiperrefléxica con signo de Babinski
bilateral llegando a estado de mutismo aquinético. Falleció a los 15 meses de
enfermedad. Estudio histopatológico: marcada vacuolización neuronal asociada a
gliosis reactiva en corteza y núcleos basales con distribución irregular.
CASO 3
Mujer de 64 años. Dos meses antes del ingreso presentó “temblor” de
miembro superior derecho, inestabilidad para la marcha, alucinaciones visuales,
dificultad para nominar objetos y labilidad emocional. Al examen, se encontró
desorientada, con hemiparesia derecha espástica hiperrefléxica, mioclonías
generalizadas a predominio de miembros superiores; en la evaluación de funciones
superiores: afasia global. Cursó con evolución tórpida con crisis tónico-clónicas
generalizadas y deterioro del nivel de conciencia. Falleció a los 6 meses de
enfermedad. El estudio histopatológico evidenció gliosis reactiva con presencia de
astrocitos gemistocíticos y moderada vacuolización neuronal en diferentes zonas
del cerebro a predominio frontal.

CASO 4
Varón de 59 años. Tiempo de enfermedad de dos semanas; caracterizado por
visión borrosa, inestabilidad para la marcha, “habla incoherente” e incontinencia
urinaria. En la evaluación se encontró paciente parcialmente orientado, bradipsíquico,
hipoactivo, con espasticidad generalizada; en la evaluación de funciones superiores:
apraxia, agnosia, compromiso de memoria a corto plazo. Cursó con deterioro
rápidamente progresivo de funciones superiores, presentó mioclonías generalizadas
y evolucionó a estado de mutismo aquinético. Falleció a los 4 meses de enfermedad.
Estudio histopatológico: en la corteza cerebral, el cerebelo y los núcleos basales,
abundantes vacuolas de 5-10 micras a nivel del neuropilo, acompañada de
abundante gliosis que reemplaza parénquima normal. Escasas neuronas de aspecto
encogido y citoplasma eosinófilo intenso.

CASO 5
Varón de 69 años. Tiempo de enfermedad de cuatro semanas; caracterizado
por insomnio, “no sabía el nombre de los objetos”, “olvidó la forma de comer y
vestirse”, “habla incoherente”, episodios de autoagresión y desorientación. Al
examen, se encontró paciente parcialmente orientado, hipoactivo, con temblor de
reposo y postural en miembros superiores. Durante las semanas siguientes el
cuadro progresó con hemiparesia derecha espástica hiperrefléxica, limitación en la
supraversión de la mirada, afasia global y mioclonías periorales y en miembros
superiores. Falleció a los 5 meses de enfermedad. Estudio histopatológico: corteza
cerebral, cerebelo y núcleos basales con presencia focal de espongiosis de
neuropilo, marcada gliosis, con astrocitos gemistocíticos y marcada ausencia
neuronal.

CASO 6

Mujer de 54 años. Inició con “temblor” de reposo en miembro superior

derecho, apatía, pérdida del cuidado personal, “lenguaje incoherente”,
alucinaciones visuales y pérdida progresiva de la fluencia verbal. Al examen, se
encontró desorientada, hipoactiva, con posturas distónicas episódicas,
cuadriparesia hipertónica normorrefléxica, mioclonías generalizadas; a la
evaluación de funciones superiores: afasia global. Semanas después entró en estado
de mutismo aquinético. Falleció a los 13 meses de enfermedad. Estudio
histopatológico: focos de espongiosis de neuropilo en corteza cerebral, cerebelo y
núcleos basales, definida por vacuolas ovales y redondas de 5-10 micras
acompañadas de pérdida neuronal severa y algunos astrocitos gemistocíticos.

CORRELATO CLÍNICO MOLECULAR

La edad de inicio en los casos definitivos fue de 55,8 años, con predominio
del sexo masculino, aunque la forma esporádica de ECJ afecta en igual proporción
a ambos sexos. El tiempo de enfermedad fue de 8,8 meses es más corto en los
pacientes con forma esporádica de ECJ comparado con la variante ECJ.
Aproximadamente el 90% de casos de la forma esporádica de ECJ fallece antes
del primer año de enfermedad

Se encontró un EEG típico en 50% de los casos definitivos. La proteína 14-3-

3 en líquido cefalorraquídeo fue positiva en un caso probable y los hallazgos típicos
en resonancia magnética se observaron en dos casos probables. Todos los casos
cursaron con una evolución clínica típica de la enfermedad.

Esta heterogeneidad fenotípica en la forma de presentación y en el curso de

la forma esporádica de ECJ ha sido relacionada a los diversos polimorfismos en el
codón 129 del gen PRNP y a las características fisicoquímicas de la PrPSc. Varios
fenotipos de la enfermedad han sido descritos dependiendo del genotipo (homo o
heterocigoto) de metionina o valina en el codón 129. La forma más frecuente, en más
del 70% de los casos, presenta el genotipo MM1 o MV1 (variante mioclónica de
Heidenhein), normalmente en pacientes de avanzada edad y por lo general mortal
en 3-4 meses.

El diagnóstico probable de forma esporádica de ECJ según los criterios actuales

propuestos por Zerr et al. requiere la presencia de un síndrome demencial
rápidamente progresivo y dos signos clínicos (mioclonías, disturbios visuales y/o
cerebelosos, signos piramidales/extrapiramidales y mutismo aquinético) asociados
a hallazgos típicos en por lo menos una prueba complementaria y la ausencia de
un diagnóstico alternativo. Las tres pruebas complementarias son: el
electroencefalograma (EEG), el análisis del líquido cefalorraquídeo (LCR) y la
resonancia magnética (RM). Según el estudio de Zerr et al., la combinación de los
resultados de estas pruebas alcanza una sensibilidad y especificidad de 98 y 71%
respectivamente.

El diagnóstico definitivo de la ECJ solo puede ser realizado mediante el

estudio histopatológico. Macroscópicamente, se observa distintos grados de atrofia
cerebral y cerebelosa. En la microscopia de los pacientes con forma esporádica de
ECJ, tinciones como la hematoxilina-eosina, muestran la triada característica de
vacuolización intracitoplasmática (cambio espongiforme), marcada pérdida
neuronal y gliosis en zonas de la corteza cerebral, cerebelo y núcleos basales. Previa
autorización del familiar directo, se realizó el estudio histopatológico post mortem
a seis de nuestros casos y se observaron dichos cambios en todos nuestros
casos definitivos. No se encontraron placas amiloides rodeadas de cambios
espongiformes, típicas de la variante ECJ.
Histopatología de la forma esporádica de la enfermedad Creutzfeldt Jacob. Se observa
marcada pérdida neuronal, gliososis y vacuolización intracitoplasmática en
parénquima cerebral (hemotoxilina-eosina x400)

Por su parte, la proteína 14-3-3 que es un polipéptido citosólico, que al estar

presente en el LCR indicaría daño cerebral producto de muerte neuronal, tiene
relevante valor como herramienta de apoyo diagnóstico. Su detección en el LCR tiene
una sensibilidad de 94% y una especificidad de 84% en un contexto clínico adecuado.
Hay autores que prefieren la determinación de la proteína tau ya que contaría con
una mayor especificidad. Si bien la detección de la proteína 14-3-3 no genera un
diagnóstico confirmatorio de la ECJ, se encuentra presente sólo en un bajo porcentaje
de otros cuadros a plantear como diagnósticos diferenciales. En encefalopatía de
Hashimoto se encuentra presente sólo en 12% de los casos, siendo incluso inferior
en otras patologías autoinmunes. En el caso presentado destaca un notorio
incremento en los niveles de proteína 14-3-3 al transcurrir el cuadro, siendo indudable
su positividad en la etapa final, lo cual está en concordancia con lo descrito
previamente.
BIBLIOGRAFIA
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der Kamp MW, Daggett V. Biophys J 2014, 106(5):1152-63.
INTERROGANTES

1.- ¿Que son los priones y que tipo de enfermedades producen?

Son patógenos infecciosos de un tamaño mucho más pequeño que los virus y que son

distintos de estos, de las bacterias y de todas las células vivas, porque no contienen

material genético, sino que su naturaleza es únicamente proteica; sin embargo, poseen

algunas características de los patógenos víricos o microbianos.

Los priones son partículas proteicas infecciosas transmisibles que aparecen cuando una

proteína se transforma en una forma anómala, son proteínas mal plegada capaces de

transmitir su forma mal plegada a otras variedades de la misma proteína. Produce las

encefalopatías espongiformes transmisibles, que son un grupo de desórdenes

neurodegenerativos progresivos tales como el kuru, la tembladera, la enfermedad de

Creutzfeldt-Jakob y la encefalopatía espongiforme bovina.

2.- ¿Por qué se producen? ¿Cuál es el origen de estas proteínas infecciosas?

La proteína priónica (PrP) es una glicoproteína rica en hélices - alfa presente de forma

natural en muchas células, que es su forma nativa (PrPc) cumple diversas funciones aún

no de todo esclarecidas, tales como metabolismo del cobre, defensa antioxidante,

transducción de señales y migración celular, etc; pero que puede adoptar una forma

patogénica (PrPSc) como consecuencia de la alteración de su estructura

secundaria que provoca la aparición de hojas - beta plegada, con el consiguiente

incorrecto plegamiento de su estructura terciaria. Los priones se caracterizan por

solamente estár conformados por aminoácidos, sin material genético. En comparación

con los otros agentes infecciosos mencionados que son autónomos de su huésped,

estos se originan únicamente dentro de un organismo vivo.

Los cambios en aminoácidos de la estructura polipeptídica de la PrPC como el paso de

metionina a cisteína y de leucina por prolina, puede ser la causa de la aparición de

resistencia a degradación proteolítica y al calor, entre otras propiedades que que

provocarán su actividad patológica.

3.- ¿La PrP es una agente causal de encefalopatías ¿Cuáles? ¿Dónde se localizan

la proteína y que ocurre cuando esta cambia a nivel de las células cerebrales?

La PrP produce encefalopatías como:

• Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (1 por millón)

• Insomnio mortal
• Prionopatía variable sensible a proteasas
• Kuru
• Enfermedad de Gerstmann-Sträussler-Scheinker

La PrPC se encuentra en todas las células del organismo, pero en el sistema nervioso

y en especial el encéfalo, se observa una alta concentración sobre todo en la superficie

exterior de las neuronas. Por lo tanto, la mayoría de las enfermedades por priones

afectan de forma predominante o exclusiva al sistema nervioso.

4.- ¿Es peligroso consumir carne de una “vaca loca”?

Sí, el consumo de carne de bovinos infectados con el prión causante de la enfermedad,

estos patógenos pueden llegar al tejido cerebral, propagándose y produciendo una

reacción en cadena sobre otras proteínas. Los nuevos priones actúan como moldes

para transformar a las proteínas sanas en nuevos priones.

Los primeros síntomas son pérdidad de memoria, depresión, delirios y alucinaciones.

Luego viene ataxia (rigidez de los miembros y pérdida del control de movimientos). La

enfermedad en estados avanzados produce bloqueo de la sinapsis neuronal,

degenerando en demencia y las víctimas suelen fallecer un año después.

5.- ¿Al cocinar o procesar la carne no se inactivan estos priones?

No siempre, debido a que la mayoría los priones son resistentes a pocedimientos con

calor, salazón y embutido, adicionalmente son capaces de soportar la digestión humana.

De modo que, si una pieza de carne está infectada hay posibilidades de infección.

A pesar de lo dicho existen métodos que pueden eliminar prácticamente el 100% de

priones o inactivarlos, como la esterilización por calor húmedo mediante el uso de

autoclaves, que es uno de los más efectivos, hipoclorito sódico (20 ppm 1h), hidróxido

sódico 2N, autoclave (tª>134º), pero su uso está más enfocado en la esterilización de

material de laboratorio u otros instrumentos.

6.- ¿Cómo se clasifican las enfermedades causadas por los priones?

❖ Enfermedades por priones esporádicas (85 – 90%)

Las enfermedades por priones esporádicas son las más frecuentes de todas las

enfermedades por priones humanas. Hay tres tipos de enfermedad por priones

esporádica:
 • Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (1 por millón)
• Insomnio mortal
• Prionopatía variable sensible a proteasas

En las enfermedades por priones esporádicas se desconoce cómo se forma el primer

prión. Se sospecha que se produce un error en los procesos de una célula

(metabolismo celular) y que dicho error provoca que la PrPC cambie espontáneamente

su forma.

❖ Enfermedades por priones familiares (10 – 15%)

Las enfermedades por priones familiares implican una mutación en el gen de la PrPC,

que puede ser hereditaria. La mutación hace que las PrPC sean más propensas a

convertirse en priones. Se heredan con un carácter autosómico dominante, es decir

que solo hace falta un gen para que la enfermedad se manifieste.

Ejemplos:

• Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob familiar

• Insomnio familiar mortal
• Enfermedad de Gerstmann-Sträussler-Scheinker

❖ Enfermedades por priones contraídas (1 – 3%)

Las enfermedades por priones contraídas son muy poco frecuentes. Estas

enfermedades se producen

• Si se come carne de ternera infectada por priones, como en la variante de

la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (también conocida como la versión
humana de la «enfermedad de las vacas locas»)
• Si se trasplanta un órgano o tejido contaminado con priones

• Si una sustancia contaminada con priones (como una hormona) se

administra por inyección

• Si se realiza una cirugía cerebral con instrumentos contaminados con

priones
 • Si se recibe una transfusión de sangre contaminada con priones (poco
frecuente)

• Mediante las prácticas caníbales, como en el caso del kuru en nativos de

Papúa Nueva Guinea

7.- ¿Se pueden detectar las enfermedades causadas por los priones?

Aún no existe un test diagnóstico para las enfermedades causadas por priones.

La dificultad para el diagnóstico radica en que no se detectan anomalías sistémicas

durante el transcurso de estas patologías, ni tampoco indicadores de infección,

adicionalmente las pruebas de hematología, bioquímica e inmunología son normales.

En la actualidad, el diagnóstico premortem de las enfermedades por priones se realiza

mediante diagnóstico clínico y la detección de la proteína 14-3-3 en líquído

cefalorraquídeo y proteína Tau, dando lugar a un diagnóstico de "probable", mientras

que para obtener un diagnóstico de "definitivo", es necesario que utilizando métodos

invasivos se cumplan al menos dos de los siguientes criterios "transmisión a animales,

presencia de PrP, o mutaciones en el gen que codifica para la proteína priónica" siendo

necesario la confirmación histopatológica para pasar de "probable" a "definitivo"; por lo

cual es recomendable realizar la necropsia en aquellos casos de sospecha de

enfermedades por priones.

8.- ¿Se pueden tratar las enfermedades causadas por los priones?

Año 2013: Investigadores del Scripps Research Institute de Estados Unidos obtuvieron

el primer tratamiento efectivo contra los priones (PrP), mediante la utilización de dos

fármacos ya comercializados, mostrando resultados favorables al menos en cultivos

celulares, por ende este primer tratamiento efectivo contra los priones es un paso más

de la medicina para abordar este tipo de enfermedades neurodegenerativas.

Año 2020: Un grupo de investigadoes de Harvard y el MIT informaron de los resultados

de estudios preclínicos de una terapia antisentido contra la enfermedad priónica.

En este nuevo trabajo han utilizado un conjunto ampliado de oligonucleótidos antisentido

dirigidos a proteínas priónicas. Esto ha ayudado a que los autores hayan sentado las

bases para el desarrollo clínico a gran escala.

Sin embargo hasta el día de hoy aún no existe ningún tratamiento farmacológico 100%

efectivo y seguro disponible que ayude a combatir la progresión de estas enfermedades.

La única opción disponible es el tratamiento sintomático, para mitigar los efectos que

producen los priones, como el uso de inhibidores selectivos de la recaptación de

serotonina, antipsicóticos y benzodiacepinas para tratar la depresión, psicosis,

movimientos involuntarios y agitación subsecuentes al progreso de las mismas.

9.- ¿Cuál es el resultado actual de las encefalopatías espongiformes

transmisibles?

Hoy en día al no disponer con un tratamiento efectivo para la recuperación de los

pacientes, el resultado final es indefectiblemente la muerte, en un tiempo de entre 4

meses a dos años según la enfermedad y su evolución.

10.- El plegamiento anómalo de las proteínas puede deberse ¿a qué factores?

¿Qué enfermedades se asocian a la acumulación de proteínas mal plegadas en

el espacio intra o extracelular?

a) El plegamiento anómalo pude ser ocasionado por:

✓ Una mutación o conjunto de mutaciones espontáneas que produzcan el cambio

estructural de proteína natina (PrPc) a prión (PrpSc)

✓ El envejecimiento celular (mayor producción de radicales libres, reducción y

alteración en la síntesis de proteínas, envejecimiento mitocondrial, etc)

✓ Hipoxia

✓ Stress oxidativo del RER

✓ Privación a la glucosa
b) Algunas enfermedades asociadas a acúmulos de proteínas mal plegadas son:

✓ Alzheimer

✓ Amiloidosis

✓ Esclerosis lateral amiotrófica

✓ Parkinson
 ✓ Enfermedad de Hungtinton

✓ Enfermedad de Kennedy

11.- Los amiloides son proteínas insolubles ¿cómo se relacionan con

la enfermedad de Alzheimer?

No se conoce completamente cuáles son las causas del Alzheimer ni por qué se produce

la enfermedad. En los cerebros de personas afectas de demencia por enfermedad de

Alzheimer se han identificado depósitos anormales de dos proteínas que forman

agregados e inclusiones, desestructurando la arquitectura cerebral. Estas proteínas se

denominan beta-amiloide y proteína tau.

La proteína beta-amiloide se desnaturaliza y se apelmaza, formando agregados

insolubles entre las células cerebrales, debido a que el hombre carece de las enzimas

celulares necesarias para degradarlas se explica su acumulación. Estos agregados,

solamente visibles al microscopio, se denominan placas seniles o placas de amiloide. El

proceso de desnaturalización es irreversible, aún no se sabe qué es lo que hace que la

proteína beta-amiloide se desnaturalice. Lo que sí se sabe es que este proceso no es

rápido, se tardarían más de 10 años en acumular la cantidad de proteína desnaturalizada

suficiente para demenciar a una persona.

Otro aspecto interesante es que no hay una correlación directa entre cantidad total de

proteínas agregadas y síntomas que padece el paciente. Hay personas afectas de EA

con una carga lesionar relativamente pequeña y otras personas con un funcionamiento

muy aceptable y que al autopsiar su cerebro se encuentra que tienen grandes acúmulos

de proteína beta-amiloide. Por tanto, los agregados de proteína tau y beta-amiloide son

suficientes para causar demencia por EA, pero pueden existir mecanismos de defensa

o de compensación cerebral que minimizan el impacto que estos depósitos tienen sobre

el rendimiento en nuestras actividades diarias.

12.- ¿Es posible prevenir la amiloidosis hereditaria?

No existe un verdadero método de prevención para la todos los tipos de amiloidosis, por

lo que un diagnóstico precoz es muy importante para empezar el tratamiento cuanto

antes.

Se han descrito enfermedades causadas por una mutación del gen de la transtiretina, lo

que provoca la formación de una proteína mutante que se pliega de forma anómala y se

deposita en los tejidos, dando lugar a las formas de amiloidosis hereditaria, entre ellas

la enfermedad de Andrade

Es posible prevenir algunos de los casos de polineuropatía amiloide familiar

mediante asesoramiento genético, mediante la utilización de sondas de DNA para

detectar el gen de la transtiretina antes de que se produzca la enfermedad clínica y

antes de la edad de reproducción. Estas pruebas han de limitarse a aquellos

individuos que cuenten con parientes afectados.

13.- Los virus provocan muchas infecciones, en los seres humanos como

hepatitis, encefalitis y el “resfriado común” ¿Cuál es un rasgo común de todos

estos virus?

Los patógenos causantes de las tres enfermedades citadas poseen una gran

heterogeneidad: Tanto la encefalitis como la hepatitis puede tener causa infecciosa

(viral, bacteriana, etc.), inmunitaria (por autoanticuerpos, hepatitis autoinmune) o tóxica

(por ejemplo por alcohol, sustancia tóxicas o fármacos), la encefalitis tiene origen

bacteriano o viral y el resfriado común es causado por diversas familias de virus. La

mitad de los casos están producidos por rinovirus, menos de un 10% por coronavirus y

ocasionalmente por virus de la influenza A o B, virus de la parainfluenza, virus

respiratorio sincitial, adenovirus o enterovirus.

Los virus constan de un genoma de DNA o de RNA, pero no de ambos; no se pueden

replicar de manera autónoma, por lo que deben usar el DNA, el RNA y la maquinaria

de sintetizadora de proteínas propia de la célula infectada para producir nuevas copias

víricas

14.- Explique cómo durante las infecciones los virus toman el control de la

maquinaria de traducción de las proteínas celulares con el objeto de favorecer

las síntesis de proteínas víricas.

15.- ¿Por qué los fármacos son relativamente ineficaces contra la enfermedad

vírica? ¿Se tiene ya tratamientos antivirales?

Faltan más estudio sobre el comportamiento del SARS-CoV-2 para lograr producir

fármacos específicos para inhibir los procesos metabólicos implicados en la replicación

del material genético del virus.

Para combatir el coronavirus se están administrando de manera extensiva antivirales

efectivos frente a otros virus como Ébola, Marburg o MERS.

Nos referimos a compuestos como REMDESIVIR, OSELTAMIVIR o RITONAVIR, que

se están probando en los hospitales para tratar la pandemia.

 RESOLUCIÓN DE LA PRACTICA N° 5

ENFERMEDAD DEL COLÁGENO

INTRODUCCIÓN

El colágeno es la proteína más abundante en el organismo humano. Se han

descrito más de 15 tipos de colágeno, que están distribuidos característicamente
en los diferentes tejidos, por ejemplo, el colágeno tipo I es encontrado en la piel,
tendones, huesos y arterias. Cada tipo de colágeno contiene 3 cadenas
polipeptídicas, que según el caso pueden ser codificadas por uno, dos o tres genes
de colágeno. En el caso del colágeno tipo I, contiene dos cadenas alfa-1(I) y una
cadena alfa-2(I), que son codificadas por dos genes, COL 1A1 y COL 1A2,
respectivamente. Los fibroblastos producen principalmente dos tipos de colágeno,
el tipo I y el tipo III; el de tipo III contiene 3 cadenas idénticas llamadas alfa-1(III).

La biosíntesis del colágeno es muy compleja, las cadenas individuales

precursoras son sintetizadas en los ribosomas unidos a membrana, cada cadena
tiene una secuencia iniciadora (secuencia líder) localizada en el extremo N terminal
y que sirve para su inserción en la superficie de la membrana. Durante la
transferencia de la cadena en crecimiento, al lumen del retículo endoplásmico, se
retira la secuencia líder, ciertos residuos de prolina y lisina del dominio triple helicoidal
son hidroxilados y algunos residuos de hidroxilisina son glicosilados. El ensamblaje
de las 3 cadenas en el RE rugoso es mediatizado por la formación de puentes
disulfuro en el dominio propeptídico C terminal de cada cadena y la formación de
la triple hélice ocurre desde el lado C-terminal de la molécula. La molécula es
secretada de los fibroblastos como procolágeno (Figura 5.1.). En el procesamiento
del procolágeno, proteasas especializadas remueven las extensiones
propeptídicas N C terminal. La molécula resultante, llamada. tropocolágeno, se
ensambla para formar las fibras. Las fibras de colágeno maduras, se establecen
por la formación de uniones entre residuos de lisina.
 estructura del procolageno
COOH
SS
NH2
SS
SS SS

SS
SS SS
SS SS

Tropocolageno
colageno

Amino-terminal Carboxyl-terminal
propeptido propeptido (puentes disulfuro)

Figura 5.1. Estructura de la molécula de procolágeno.

La porción central (entre D y F) corresponde a la triple hélice, B y G

representan los extremos N y C terminal del propéptido, respectivamente.

CASO CLINICO

El paciente es un varón de 22 años que fue atendido por antecedentes de

fácil aparición de hematomas y sangrado frecuente desde la niñez. Su padre se había
visto afectado de manera similar y había muerto a la edad de 34 años a causa
de una hemorragia. El trastorno subyacente de su padre permaneció sin diagnosticar.
Todos los demás familiares cercanos conocidos no se ven afectados. El paciente
nació con un céfalo hematoma inusualmente grande (un quiste sanguíneo del cuero
cabelludo). Se reparó una hernia inguinal (cerca de la ingle) a las 8 semanas de
edad. Después de los 4 años, se notó piel frágil, fácil formación de hematomas y
ampollas hemorrágicas en la mucosa oral. Los traumatismos menores produjeron
hematomas musculares dolorosos.

A los 22 años, la piel del paciente era fina y translúcida, lo que sugería un
defecto de colágeno. Se obtuvo una biopsia de la piel de la nalga del paciente para
iniciar los cultivos. Las proteínas sintetizadas por los fibroblastos del paciente en un
medio que contenía 3H-glicina y 3H-prolina fueron recogidas suavemente, y
tratadas con pepsina, se analizaron usando electroforesis en gel de poliacrilamida-
SDS.

El paciente, estudiante de medicina, tenía una clara comprensión de la grave

condición que había heredado de su padre. Se le recomendó evitar esfuerzos
físicos violentos y deportes con contacto corporal cercano, abstenerse de tomar
medicamentos que interfieran con la coagulación sanguínea y evitar la tos y el
estreñimiento mediante el uso oportuno de antitusivos y laxantes. En la exploración
física llama la atención una discreta hiperlaxitud articular y varias cicatrices
hipertróficas, así como algunos rasgos faciales peculiares (nariz afilada, ausencia
de lóbulo auricular). Ante estos hallazgos y con la sospecha clínica de colagenopatía,
se decide solicitar estudio genético, identificándose la mutación c.2518G>A
(p.Gly840Arg) en heterocigosis en el gen COL3A1, compatible con síndrome de
Ehlers-Danlos tipo IV.

BASES MOLECULARES

El síndrome de Ehlers-Danlos de tipo IV, también conocido como síndrome de

Ehlers-Danlos (SED) de tipo vascular, es una enfermedad hereditaria autosómica
dominante, causado por mutaciones en el gen COL3A1 que codifica para el
procolágeno tipo III, en la que existe un defecto en la síntesis del colágeno tipo III,
que es particularmente importante en la piel, arterias y órganos huecos,
principalmente las paredes vasculares y también del tubo digestivo.

Este trastorno hereditario del tejido conectivo definido por rasgos faciales
característicos (acrogeria) en la mayoría de pacientes, piel fina y translúcida, a través
de la cual se ven fácilmente las venas, magullaciones marcadas y, a veces, la
apariencia senil de las manos y la piel en el tronco y en la parte baja de la espalda,
moretones fáciles y graves complicaciones arteriales, digestivas y uterinas, que
rara vez se observan en las otras formas de SED. La prevalencia estimada de las
formas de SED varía entre 1/10 000 y 1/25 000, y el SED de tipo IV representa
aproximadamente entre un 5 % y un 10 % de los casos. Los problemas
clínicos surgen a causa de una rotura arterial, la perforación intestinal o la ruptura del
útero durante el embarazo o el parto. El tratamiento quirúrgico es difícil debido a la
fragilidad tisular.

El defecto básico del síndrome de Ehlers-Danlos tipo IV parece estar causado

por cambios en la estructura primaria de las cadenas de tipo III, derivados de
mutaciones puntuales que sustituyen los residuos de glicina y que, por lo tanto,
alteran la triple hélice del colágeno, y también de la eliminación de algunos
exones, que da lugar a un acotamiento del polipéptido y puede redundar en una
secreción ineficiente, en la disminución de la estabilidad térmica del colágeno y en
una formación anormal de las fibrillas de colágeno de tipo II. En algunas ocasiones
el colágeno tipo III se acumula en el retículo endoplasmático rugoso, se modifica en
exceso y se degrada muy lentamente.

El diagnóstico se basa en los signos clínicos, en las imágenes obtenidas por

técnicas no invasivas y en la identificación de una mutación en el gen COL3A1. En
la infancia, los diagnósticos diferenciales principales son los trastornos de la
coagulación y el síndrome de Silverman; en la edad adulta, el diagnóstico
diferencial incluye otros síndromes de Ehlers-Danlos, el síndrome de Marfan y el
síndrome de Loeys-Dietz. En las familias en las que se sabe la existencia de la
mutación se puede considerar el diagnóstico prenatal. Sin embargo, la
cordocentesis y la amniocentesis tienen un riesgo elevado para las mujeres
embarazadas con esta enfermedad. A falta de un tratamiento específico para el
SED de tipo IV, la intervención médica debe centrarse en el tratamiento sintomático
y las medidas profilácticas. Las complicaciones arteriales, digestivas o uterinas
requieren la hospitalización inmediata y la observación en una unidad de cuidados
intensivos. Las técnicas invasivas de obtención de imagen están contraindicadas.
Normalmente se recomienda un enfoque conservador en el cuidado de las
complicaciones vasculares en un paciente que sufre de SED de tipo IV.

En los pacientes afectados por este síndrome es imprescindible un adecuado

consejo genético y una vigilancia periódica de los grandes vasos.
BIBLIOGRAFIA
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INTERROGANTES

1.- Escriba el nombre del gen o genes que codifican para el colágeno tipo III.

El gen COL3A1 se encuentra en el brazo largo (q) del cromosoma 2 en 2q32.2, entre las

posiciones 188,974,372 y 189,012,745, posee 51 exones y una longitud de

aproximadamente 40 kpb (40 000 pares de bases).

El colágeno de tipo III es un homotrímero, es decir una proteína compuesta por tres

cadenas polipeptídicas idénticas (monómeros) denominadas cadenas alfa 1 de colágeno

tipo III. El colágeno de tipo III es uno de los colágenos fibrilares cuyas proteínas tienen

un dominio de triple hélice largo e inflexible. Se encuentra en casi todos los tejidos en

los que aparece el tipo I siendo excepciones, los huesos, los tendones y la córnea.

Se generan dos transcripciones a partir del gen utilizando diferentes sitios de

poliadenilación. Aunque se han detectado transcripciones empalmadas alternativamente

para este gen, son el resultado de mutaciones; estas mutaciones alteran el empalme del

ARN, lo que a menudo conduce a la exclusión de un exón o al uso de sitios de empalme

crípticos. La proteína defectuosa resultante es la causa de una enfermedad rara y grave,

el tipo vascular del síndrome de Ehlers-Danlos (vEDS) o Síndrome de Ehlers-Danlos

tipo IV.
2.- El resultado obtenido al ser analizadas las proteínas de los fibroblastos
cultivados del paciente mediante electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS
y detectadas mediante electroforesis se muestra en la Figura 5.2.

MWS C P
300 1 (III) Prot. 300Kd
3
1 (III) Prot. 240Kd
3
200

100 Prot. 98Kd

Prot. 85Kd

Figura 5.2. Electroforesis del procolágeno del paciente (P) y de un control (C)
mediante electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS. A la izquierda
(MWS) se muestra la electroforesis de proteínas estándares como
marcadores de peso molecular (en Kdaltons).

a) ¿Por qué se usó glicina y prolina radioactiva en este experimento?

Se utilizaron glicina y prolina radioactivas en razón de que la estructura del colágeno es

muy rica en estos aminoácidos, ambos se encuentran formando la espiral de triple banda.

Los tropocolágenos se unen entre sí por medio de enlaces entre algunos aminoácidos

específicos (como por ejemplo la lisina), llamados "crosslinkings" o entrecruzamientos,

que favorecen la consolidación de las fibrillas de colágeno.

❖ GLICINA

La glicina se halla en cada tercera posición de la cadena polipeptídica, los residuos de

glicina son parte de la repetición gli-X-Y: donde X es prolina y Y es hidroxiprolina o

hidroxilisina.
 ❖ PROLINA

Es gracias a la prolina que se facilita la forma de espiral en las cadenas alfa. La

hidroxiprolina constituye alrededor de un 10 a 12 % de todos los residuos aminoacídicos

del colágeno, dependiendo dicho porcentaje del tipo de colágeno.

b) ¿Cuál es el fundamento para la separación de las proteínas mediante la

electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS?

La electroforésis es una técnica para la separación de moléculas según la movilidad de

éstas en un campo eléctrico. Al utilizar este procedimiento las conformaciones

poliméricas son separadas en sus monómeros e identificadas con base en su peso

molecular.

Se emplean dos fuerzas opuestas: el campo eléctrico que va a provocar la movilidad de

la proteína basada en su carga, y un soporte sólido (gel), que va a ofrecer resistencia al

movimiento de la proteína con base en su interacción debido al tamaño; al lograr que

ambas fuerzas resultantes posean la misma magnitud, pero direcciones opuestas estas

se anulan mutuamente, consiguiendo que el movimiento sea exclusivamente

proporcional a su peso molecular, ya que con el SDS todas las proteínas adoptan carga

negativa (se desplazan al ánodo).

❖ El Dodecil sulfato de sodio (SDS): Es un detergente aniónico que actúa

rompiendo enlaces no covalentes en las proteínas (especificamente estructuras

secundarias y terciarias no enlazadas con disulfuro), a las reviste con una carga

negativa (sustancialmente mayor que la proteína) que se correlaciona con su

longitud, permitiendo que los pesos moleculares sean estimados. Como

consecuencia la movilidad electroforética de la proteína depende exclusivamente

de su masa molecular.
c) Teniendo en cuenta que el colágeno tipo III tiene un PM cercano a 300 Kd y

que las dos cadenas del colágeno del tipo I bandean a 98Kd (alfa 1(I) ) y a 85 Kd

(alfa 2(I) ), destaque los resultados más importantes que se obtuvieron en este

experimento.

Se pudo observar que las bandas inferiores correspondientes a los colágenos de tipo I

que pesan 98Kd (alfa 1(I)) y 85 Kd (alfa 2(I)) se hallan en las mismas posiciones en la

muestra del paciente y del control, por lo que se concluye que estos tipos de colágeno

no esán alterados en el síndrome de Ehler – Danlos vascular; sin embargo las bandas

superiores de 300 y 240 Kd (correspondientes al colágeno tipo 3) si variaron, según a

qué muestra pertenecía. Demostrando que existe una alteración en este tipo de colágeno

traducida en una disminución del tamalo de la proteína por una deleción en el gen que lo

codifica, disgregación de las cadenas polipeptídicas que la conforman o errores en su

procesamiento postraduccional.

3.- Las dos bandas superiores del colágeno del paciente, fueron nuevamente

corridas en electroforesis, pero en presencia de BME (beta mercaptoetanol)

se obtuvieron los resultados mostrados en la Figura 5.3.

Figura 5.3. Electroforesis de las dos bandas de mayor peso del colágeno del

paciente, en presencia de mercaptoetanol (BME)

a) ¿Qué hace en el experimento el mercaptoetanol?

Este compuesto actúa como agente reductor de enlaces disulfuro. Facilita así la

desnaturalización completa y el desplegado de las moléculas de proteína. Además, se

separarán las subunidades de la proteína si es que habían puentes disulfuro que las

mantenían unidas. Gracias al mercaptoetanol las cadenas polipeptídicas de colágeno se

disgregan. Esto permite el corrimiento de cadenas monolineales.

Al tratar las muestras con mercaptoetanol, el resultado de la electroforesis mostrará las

subunidades componentes de las proteínas.

b) ¿Cuál es su interpretación de los resultados mostrados en la Figura 5.3?

Debido al efecto desnaturalizante del mercaptoetanol, se separan las subunidades del

colágeno tipo 3, sus tres cadenas se unen mediante puentes disulfuro, al adicionar dicho

compuesto se reducen (rompen) estos puentes, cada cadena individual al adquirir un

menor peso molecular, migrando más que sus formas poliméricas en consecuencia, esto

explicaría por qué se asientan en zonas más inferiores en el análisis electroforético.

En el paciente hay proteínas de peso molecular 300Kd y 240Kd, lo que significa que son

secuencias diferentes o con perdida del material por pérdida de algún exón en el gen

Col3 A1

4.- La banda de 300 Kd del control y la de 240 Kd del paciente fueron tratadas

con bromuro de cianógeno (CNBr) y los péptidos resultantes se separaron

mediante electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS. Los resultados que se

observan en la Figura 5.4. son en ausencia (-BME) y en presencia (+BME) de

beta mercaptoetanol.
 Figura 5.4. Electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS de la banda de 300Kd del
control y de 240 Kd del paciente, luego de ser tratadas con Bromuro de
cianógeno (CB). La separación de los péptidos se hizo en ausencia (-
BME) y en presencia (-BME) de beta mercaptoetanol. En la parte superior
de la Figura se incluye un diagrama con los sitios de corte del bromuro de
cianógeno sobre el péptido alfa (III) y los números se usan para designar
cada péptido resultante.

a) ¿Qué enlaces peptídicos son cortados por el bromuro de cianógeno?

El bromuro de cianógeno hidroliza o corta los enlaces peptídicos en el extremo carboxilo

de los residuos de metionina. Esta reacción se usa para reducir el tamaño de los

segmentos polipeptídicos para la identificación y secuenciación.

b) ¿Por qué no aparecen los péptidos 1, 2 y 7 en la electroforesis?

Lo más probable es que los péptidos 1,2 y 7 sean fragmentos muy pequeños, y por ende

su migración más rápida, de tal forma que estas fracciones deben haber escapado del
cuadro de electroforesis durante su corrida, saliendo hacia el buffer recipiente del

proceso.

c) ¿Por qué hay una sola banda para los péptidos 3 y 6?

Esto es debido a que ambos tienen un peso molecular coincidente o muy similar.

d) ¿Qué significado tiene que el péptido de mayor PM no se presente cuando se

realiza la electroforesis en presencia de beta mercaptoetanol?

Significa que este péptido posee una conformación polimérica unida mediante puentes

disulfuro, que al ser reducidos, se presentan como formas monoméricas.

En ausencia de beta-mercaptoetanol se observa una banda que corresponde a CB93 y

que se ubica al inicio de la corrida electroforética ya que están juntas las tres cadenas y

tienen un mayor peso molecular: Sin embargo, en presencia de beta-mercaptoetanol la

banda se ubica más adelante (CB9) y está presente tanto en el control como el paciente

por la reducción que sufrió por el mercaptoetanol, ello también indicaría que en el lado

carboxilo terminal no habría perdida de la proteina.

e) ¿Cuál es su interpretación a los resultados obtenidos en la Figura 5.4.?

Las bandas 3 y 6 no aparecen en el paciente, debido a que el colágeno en el extremo

amino terminal de su sector codificante ha sufrido una deleción a nivel del gen, evitando

así su síntesis; los péptidos 1 y 7 por su reducido tamaño escaparon hacia el buffer del

recipiente. Todo ello se puede observar cuando los péptidos cortados con bromuro de

cianógeno y son tratados con y sin beta-mercaptoetanol tanto en el control como en el

paciente.

5.- Con los datos obtenidos indique cuál es la alteración en el colágeno del

paciente? Tenga en cuenta los resultados de los 3 experimentos.

Se ha determinado que el gen COL1A3 presenta una mutación de tipo deleción, que ha

afectado su sector amino terminal. Revisando todos los resultados se obtiene como

conclusión que el lugar donde ocurrió la disminución del tamaño de la proteína es en el

lado amino terminal

6.- El RNA total se retiró de un cultivo de fibroblastos del paciente, se analizó

mediante electroforesis en geles de agarosa y se transfirió (blotting) a membranas

de nylon para luego ser hibridizado a una prueba de cDNA para procolágeno tipo

III, radioactiva. Practicada la autorradiografia, se obtuvo la imagen que se muestra

esquemáticamente en la Figura 5.5., en donde también se incluye los resultados

obtenidos con un control.

6.1.- Cómo se denomina frecuentemente este análisis?

Es denominado northern blot, hibridación northern o ensayo northern y es una técnica

de detección de moléculas de ácido ribonucleico (ARN) de una secuencia dada dentro

de una mezcla compleja (por ejemplo, un ARN mensajero para un péptido dado en una

muestra de ARN total). Para ello, se toma la mezcla de ARN y se somete a una

electroforesis en gel a fin de separar los fragmentos de acuerdo con su tamaño. Tras

esto, se transfiere el contenido del gel, ya resuelto, a una membrana cargada

positivamente en la que se efectúa la hibridación de una sonda molecular marcada

radiactiva o químicamente.

Este análisis implica que después de que se ha realizado la electroforesis se efectúa la

transferencia a filtros de nitrocelulosa se denomina northern-bloting

6.2.- Se puede observar en el control dos principales transcriptos, uno de 5.3

y el otro de 4.7 kb. Entre tanto, en la canaleta del paciente aparece una nueva

banda de 4.1 kb. ¿Cómo se explica esto?

✓ Como se realizó el estudio en RNA mensajero, transcrito a partir de ADN con el

gen del colágeno que ha sufrido deleción.

7.- El DNA del paciente, de su madre y de varios controles fue cortado con enzimas

de restricción, transferido a membranas de nylon e hibridizado con cDNA de

procolágeno tipo III radioactivo. Se usaron varias enzimas de restricción (Bam Hl,

Hind III, Eco R1) por separado y en forma combinada. ¿Qué resultados cree Ud.

que se encontraron?
La explicación de ambos experimentos es que las enzimas de restricción cortan al ADN

en zonas específicas, produciendo en cada caso 3 porciones de diferente tamaño y por

ende peso molecular variado, los cuales al realizar la electroforesis se puede comparar

las muestras de un paciente y un control, determinando que no existe variación en la

integridad de los fragmentos 2 y 3, pero si en las porciones número 1, analizando este

fenómeno se puede concluir que ha ocurrido una deleción en un sector codificante del

gen COL3A1, provocando así que la proteína resulte con un tamaño menor al normal.

8.- El colágeno se encuentra por todo el organismo, pero ¿a qué se debe su

variedad de tipos y organización? ¿Cuál es el tipo de colágeno más frecuente? El

colágeno puede ser como un gel, ¿Dónde?

✓ El colágeno debe su variedad según la función que va a determinar en el órgano

en el que se encuentra; algunos de los colágenos más abundantes forman

fibrillas, otros, extensas redes o desempeñan funciones más especializadas. 28

colágenos y 42 genes.

✓ El colágeno de tipo I es, con diferencia, el colágeno más abundante en el cuerpo,

posee una composición de aminoácidos inusual, con un 33% de glicina y un 10%

de prolina. 10% 4H Prolina

✓ El colágeno actúa como un gel en los cartílagos donde absorbe los impactos

producidos al mover las articulaciones, en la matriz extracelular formando un

armazón que hace de sostén a los tejidos y que resiste las fuerzas de tensión

mecánica y el humor vítreo del ojo cuyo en donde su principal cometido es otorgar

resistencia a los tejidos a la hora de realizar presión intermitente.

9.- ¿Dónde se sintetizan el colágeno? ¿Cuáles son los pasos? ¿Qué sucede si hay

carencia de ácido ascórbico? Mencione algunos ejemplos de colagenopatías

❖ El colágeno es sintetizado en los fibroblastos del tejido conectivo, osteoblastos

del hueso y en los condroblastos del cartílago, cuyo contenido se segrega a la

matriz extracelular.

❖ Los pasos para la síntesis de colágeno son:

➢ Formación de procadenas alfa

➢ Hidroxilación

➢ Glucosilación

➢ Ensamblaje y secreción

➢ Escisión extracelular del procolágeno

➢ Formación de fibrillas de colágeno

➢ Formación de enlaces transversales

❖ En carencia de vitamina C o ácido ascórbico las enzimas encargadas de la

hidroxilación no funcionan y por ende o se forman enlaces puente de H entre

cadenas de colágeno, resultando en una triple hélice inestable.

❖ Son una serie de trastornos inflamatorios crónicos, de etiología desconocida y

patogenia autonimune como por ejemplo: el Lupus Eritematoso Sistémico, la

 https://meet.google.com/qgg-yzaz-fghdermatomiositis, la esclerodermia, el

Síndrome de Ehlers-Danlos (SED), laOsteogénesis imperfecta, etc.

10.- Un nuevo paciente, ingresado recientemente al hospital ha contraído difteria.

Los antecedentes familiares indican que el paciente nunca había sido vacunando

contra este patógeno. La síntesis de proteínas en las células del paciente es

inhibida por:

La exotoxina de la bacteria Corynebacterium diphtheriae al ingresar al citoplasma celular

inhibe la síntesis de proteínas, mediante la inhibición del factor de elongación EF2, con

lo que se inhibe la actividad de este factor, que es requerido para el paso de

translocación de la síntesis de proteínas. Su factor de virulencia esencial es su toxina,

cuya producción depende de la presencia de un bacteriófago lisogénico que porta el gen

tox y que se integra en el cromosoma bacteriano.

La toxina afecta a todo el organismo, pero su acción más relevante se produce en el

corazón (miocarditis), los nervios (desmielinización) y el riñón (necrosis tubular).

11.- Una joven madre lleva a su primera hija a la consulta para empezar un

programa de inmunización en inyección que protegerá al bebe frente a la difteria,

la tos ferina y el tétanos. La mujer quiere asegurar que su hija este bien cuidada

pero no ve la necesidad de inmunizarla frente a la difteria dado que nunca ha

sabido de ningún niño que haya tenido la enfermedad, ni la gravedad de la

enfermedad. ¿Cómo le explica a la madre la importancia de proteger a su hija

contra ésta, con frecuencia, enfermedad mortal?

La llamada vacuna triple o vacuna Tdap puede proteger a los adolescentes y a los

adultos contra el tétano, la difteria y la tosferina. Una dosis de Tdap se aplica

rutinariamente a los 11 o 12 años de edad. Las personas que no recibieron la vacuna

Tdap a esta edad deben aplicársela tan pronto como sea posible.

El médico tratante debería explicarle de manera sencilla y comprensible a la madre que

la diftería:

❖ La difteria es causada por una bacteria llamada Corynebacterium diphtheriae

solía ser una enfermedad frecuente en niños pequeños y muy peligrosa antes de

la invención de los antibióticos. La difteria es mortal en 5 - 10% de los casos, con

una tasa de mortalidad más alta en niños pequeños.

❖ Esta bacteria produce una toxina que ataca la maquinaria encargada de la

síntesis proteica, pudiendo llegar a producir efectos tan terribles como: Bloqueo

de las vías respiratorias, daño al músculo cardiaco (miocarditis), daño a los

nervios (polineuropatía), entre otras complicaciones.

❖ Como la toxina se une de forma covalente (fuertemente) al factor de elongación

EF2, una vez enlazados es practicamente imposible separarlos y por ende

rescatar a las células afectadas.

❖ Explicarle los beneficios de la prevención para la salud frente a esta enfermedad

y en general.
12.- Las mutaciones genéticas, se pueden simular en situaciones de laboratorio.

El tRNA cargado con cisteína puede tratarse por medios químicos para que el

aminoácido cambie su identidad a alanina. Si parte de este tRNA cargado se añade

a un extracto sintetizador de proteínas que contiene todos los componentes

normales requeridos para la traducción ¿Cuál será el resultado más probable

después de añadir un mRNA que tiene Cys y Ala en el marco de lectura normal?

El mRNA es un polinucleótido conformado por una secuencia complementaria al DNA,

este contiene los codones para Cys y para Ala; según la pregunta si el aminoácido unido

al tRNA (cisteína), por una reacción química pierde el grupo mercapto se convertiría en

alanina, de tal forma que al realizarse la traducción de forma equivoca se introduciría

alanina en lugar de cisteína. Dado el supuesto anterior se estructuraría una proteína con

deficiencia de residuos de cisteína que no formaría puentes disulfuro; con una alteración

en su estructura terciaria y cuaternaria y provocando como principal consecuencia la

falta de funcionalidad de la proteína resultante; pero que se mantendría sin cambios en

el marco de lectura, debido a que estos se dan por mutaciones en el material genético,

por deleción o por inserción de nucleótidos en múltiplos diferentes a tres.

13.- Se está diseñando un medicamento que bloquee la traducción eucariótica

¿Cuál sería un sitio de acción adecuado para el medicamento?

✓ Varios quimioterápicos poseen su diana en la actividad de la peptidil transferasa,

como elemento crucial en la síntesis proteica.

✓ El tRNA iniciador para metionina, debido a que este siempre es el aminoácido

inicial en el proceso de traducción eucariótica.

✓ El casquete o caperuza del mRNA, el cual es necesario para impulsar la

traducción al intervenir en la unión adecuada de IF para permitir que el tRNA

iniciador cargado y los ribosomas se unan al mRNA.

❖ LA CICLOHEXIMIDA: es un inhibidor de la síntesis proteica en organismos

eucariotas, producido por la bacteria Streptomyces griseus. Actúa interfiriendo la

actividad peptidil transferasa del ribosoma 60S, bloqueando la elongación

traduccional. Tiene un uso extendido en la investigación biomédica para inhibir la

síntesis de proteínas en células eucariotas in vitro, pero no es apto para el uso

humano debido a sus efectos tóxicos y teratogénicos

14.- ¿Cuál es el mecanismo de acción de la azitromicina?

La Azitromicina penetra la pared celular y se fija a la subunidad ribosomal 50S,

inhibiendo la síntesis de polipéptidos bacterianos. El sitio de acción parece ser el mismo

de los otros macrólidos, la clindamicina, la lincomicina y el cloranfenicol.

Azitromicina se concentra en las células fagocíticas, tales como los leucocitos

polimorfonucleares, los monocitos, los macrófagos y los fibroblastos, donde es

indispensable para su actividad contra patógenos intracelulares. Usualmente funciona

como un bacteriostático, aunque a concentraciones altas puede tener acción bactericida

contra algunos gérmenes como S. pneumoniae, S. pyogenes y H. influenzae.

15.- Indicar que modificaciones postraduccionales se observa en la maduración

de proteínas.

La modificación postraduccional de una proteína es un cambio químico ocurrido en esta

después de su síntesis por los ribosomas. Es uno de los pasos finales de la síntesis de

proteínas y, por lo tanto, de la expresión génica. Muchas proteínas no podrían ejercer

sus funciones si no sufrieran estos cambios.

 ❖ Maduración por transformación de las cadenas laterales de algunos aminoácidos:

✓ Unión de sustituyente a los aminoácidos: acetilación, carboxilación,

fosforilación, hidroxilación, metilación

✓ Incorporación de carbohidratos

✓ Modificación con lípidos: acilación, prenilación

✓ Formación de puentes disulfuro

❖ Maduración por escisión de las proteínas (procesamiento proteolítico)

✓ Activación de proenzimas proteolíticas

✓ Activación de precursores de hormonas peptídicas

❖ Modificaciones que enlazan proteínas

✓ Sumoilación. Adición de la proteína miniatura (small ubiquitin-related modifier)

a proteínas diana.

✓ Ubiquitinación: Adición de la proteína ubiquitina a proteínas diana.

16.- Un paciente con mieloma múltiple se ha sometido a varios tratamientos que

no han funcionado y la enfermedad ha seguido avanzando. El paciente visita al

oncólogo, que quiere iniciar un tratamiento con bortezomib, que actúa inhibiendo

el proteosoma ¿Qué proteínas intracelulares no se degradarán por la acción de

este fármaco?

✓ El bortezomib pertenece al grupo de inhibidores proteosómicos, que tienen una

efectiva actividad antitumoral en cultivos celulares, induciendo la apoptosis por la

disrupción de la degradación reguladora de proteínas claves para ciclo celular.

✓ El Bortezomib es el primer inhibidor proteosómico en alcanzar el uso clínico como

agente quimioterapéutico, por ejemplo en el tratamiento del mieloma múltiple.

✓ El proteosoma normalmente no degrada proteínas que han sido

poliubiquitinizadas. Estas proteínas se acumularán y causarán un efecto adverso

✓ selectivo sobre las células cancerosas (células del mieloma). Las proteínas con

secuencia PEST son rápidamente degradadas por proteasas intracelulares

inespecíficas. En realidad, las cadenas ligeras de inmunoglobulinas son las

proteínas amiloides en esta enfermedad, pero el fármaco no influye directamente

sobre estas molécula.