Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
GUIA DE PRÁCTICA
Profesores Participantes:
Elena Arbaiza P.
Fanny Lazo M.
Carmen Pantigoso
Edith Rodríguez Q.
Gustavo Sandoval P.
Julio Solís S.
Giovanna Sotil C.
Dan Vivas R.
Patricia Woll T.
Armando Yarlequé Ch.
2019
Práá cticás de Biologíáá Moleculár – Semestre 2019-II
INDICE
PRACTICAS:
1. EXTRACCIÓN DE ADN
2. CARACTERIZACIÓN DEL ADN
3. ANÁLISIS BIOINFORMATICO DE SECUENCIAS
NUCLEOTIDICAS
4. ÁNALISIS BIOINFORMATICO DE SECUENCIAS PEPTIDICAS
5. AMPLIFICACION DE ADN MEDIANTE PCR
6. ÁNALISIS ELECTROFORETICO DEL ADN
7. DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE PROTEINAS
8. SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS POR CROMATOGRAFIA DE
FILTRACIÓN
9. SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS POR CROMATOGRAFIA DE
INTERCAMBIO IÓNICO
10. ANÁLISIS ELECTROFORETICO DE PROTEÍNAS
11. SEMINARIO : Mecanismo de Reparación del ADN
12. SEMINARIO : Estructura y Función Viral
13. SEMINARIO :Mecanismos de Señalización en la Apoptosis y
Cáncer
Práá cticás de Biologíáá Moleculár – Semestre 2019-II
PRACTICA N° 1
EXTRACCION DE ADN
1. MARCO TEÓRICO
Las características fisiológicas y bioquímicas de todo ser vivo están contenidas en sus respectivos
genomas. Los genomas de bacterias, hongos, plantas, animales y algunos virus están compuestos por
moléculas de ácido desoxirribonucleico: ADN, es una estructura química cuyas unidades
monomericas los nucleótidos se organizan de manera lineal generándose secuencias de información.
Las moléculas de ADN son de alto peso molecular, de modo que un peso molecular de un millón
corresponde aproximadamente a 1.5 kb.
La forma extremadamente alargada del dúplex de ADN junto a su rigidez lo hace muy susceptible
del daño mecánico fuera de protección de la célula, las fuerzas hidrodinámicas que se generan por
manipulaciones como la agitación y pipeteo rompen el ADN en pedazos relativamente pequeños,
por lo que el aislamiento de una molécula intacta de ADN requiere una manipulación cuidadosa.
Es conveniente entonces emplear métodos que permitan en una primera etapa, la separación de los
numerosos componentes celulares y luego aislarlo de las proteínas que principalmente en células
eucarióticas son sus acompañantes.
Con tal motivo, el método de extracción de ADN que utiliza cloroformo:alcohol isoamílico es
el más practico e idóneo pues no solo permitirá mantener la estructura de esta macromolécula sino
que su obtención será observable mediante la aparición de fibras típicas al adicionarse etanol.
Teniendo en cuenta la practicidad del método, es necesario indicar que el procedimiento
requiere una manipulación apropiada del material en estudio y además la inhibición de las nucleasas
que pueden degradarlo rápidamente. Esto se consigue, en el primer caso, mediante un mezclado
suave del extracto y en el segundo, agregando agentes quelantes que bloqueen la actividad de estas
enzimas.
Como se sabe el ADN es una doble hebra helicoidal constituida por bases nitrogenadas
(ATGC), la pentosa denominada desoxirribosa y una molécula de ácido fosfórico. Estos componentes
pueden ser reconocidos utilizando reactivos químicos específicos con la ayuda de la
espectrofotometría.
Para ello se requiere efectuar una hidrólisis ácida en la macromolécula o someterlo a la acción
enzimática de las nucleasas de acuerdo con los requerimientos analíticos que se establezcan. Aunque
no es un requisito indispensable para los ensayos antes propuestos, es conveniente averiguar
previamente si el ADN que vamos a examinar se encuentra en estado nativo o denaturado. Además es
conveniente acercarse al conocimiento de su grado de pureza determinándose para ello su probable
contaminación con las proteínas.
Se puede deducir entonces que el análisis de ADN es un proceso secuenciado que depende
fundamentalmente del modo en que fue extraído del contenido celular.
2. OBJETIVO
- Extraer ADN a partir de un tejido animal y vegetal.
- Analizar los espectros de absorción de bases nitrogenadas
3. MATERIALES
Materiales por mesa de trabajo: los marcados en negrita (5- alumnos por
mesa.)
4. PROCEDIMIENTO
4- Separar la fase acuosa superior con ayuda de una pipeta (aprox. 6ml) y colocarla en un
beaker pequeño, adicionar 2 volúmenes de etanol frío e introducir la varilla de vidrio
realizando con ella movimientos circulares para permitir la adhesión de fibras de ADN a
la varilla.
5 PROBLEMAS:
1- Una muestra de ADN purificado de E. coli contiene 13.1% de la base adenina. Cuáles son los
porcentajes de los otras bases?
2- El ADN del bacteriófago M13 tiene la siguiente composición de bases: 23% A, 36% T, 21% G,
20% C. ¿Qué puede deducir del ADN de este fago?
3- Calcular la longitud de un duplex de ADN cuyo peso molecular es de 3x10 7. Cuál es el volumen
ocupado por una molécula de ese ADN. Cuantas vueltas helicoidales contiene ese ADN.
4- El peso molecular del ADN del bacteriofago T4 de doble cadena es 1.3x10 8 a) cuantos
aminoácidos puede ser codificado por ADN de T4 b) Cuantas proteínas diferentes de peso molecular
55,000 puede ser codificado por ADN T4.
5- El ARN ribosomal 23s de E. coli tiene un peso molecular de 1.1x106. Aproximadamente 0.3% del
ADN total de E. coli hibridiza con el ARNr 23s. El peso molecular de ADN de E. coli es 2.2x109
(cromosoma). Cuantas copias del gen de RNAr tiene el cromosoma de E. coli?