PRÁCTICA Nº 2: AISLAMIENTO Y CUANTIFICACIÓN DE DNA GENÓMICO

Nombre y apellidos: Andrea París Cayón

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1. El proceso de extracción de DNA comprende tres fases. Completa el siguiente esquema,
indicando cuales son las fases e indicando que pasos del protocolo de extracción se incluyen
dentro de cada fase:

Fase: Protocolo:
Lisis celular 1. Poner 1 g de hígado en un homogenizador y añadir 3 ml de tampón
de homogenización.
2. Homogeneizar en hielo y dejar 10 minutos en hielo.
3. Tomar 300 µl del homogeneizado, ponerlos en un eppendorf, añadir
20 µl de SDS y agitar suavemente.
4. Añadir 150 µl de TE.
5. Añadir 50 µl de acetato sódico 3 M.
6. Mezclar invirtiendo el tubo.
Fase: Protocolo:
Purificación 7. Añadir 1 volumen de SEVAG.
8. Agitar durante dos minutos por inversión.
9. Centrifugar 10 minutos a 13 000 rpm.
10. Separar la fase acuosa (superior) a un eppendorf limpio.
11. Añadir 1 volumen de SEVAG.
12. Agitar invirtiendo el tubo durante 5 minutos.
13. Centrifugar a 13000 rpm durante 10 minutos.
14. Transferir la fase acuosa a un eppendorf limpio.
Fase: Protocolo:
Precipitación ADN 15. Añadir 2 volúmenes de etanol 90%.
16. Mezclar invirtiendo el tubo.
17. Centrifugar 15 minutos a 13 000 rpm.
18. Eliminar el sobrenadante con cuidado de no aspirar el sedimento.
19. Añadir 1 ml de etanol al 70 %.
20. Centrifugar 5 minutos a 13000 rpm.
21. Eliminar el sobrenadante con cuidado de no aspirar el sedimento.
22. Dejar evaporar las últimas trazas de etanol en el Speedvac.
23. Añadir 500 µl de TE.
24. Tomar una alícuota de 10 µl y diluir 1/100 con TE.
25. Medir la absorbancia a 260 nm y 280 nm (usar como blanco TE).

2. Indica cual es el papel de los siguientes reactivos utilizados en el proceso de extracción:

-SDS (sodio dedecil sulfato): detergente aniónico que actúa solubiliza las proteínas y de
componentes de tejidos y membranas para así evitar que parte del DNA se quede anclado en los
restos celulares
-Etanol: Rompe la capa hidratante que se forma alrededor del DNA en disolución generada por
la carga negativa que le otorga los grupos fosfato, para así queden expuestos los grupos fosfatos
y se propicie su unión con cationes y así precipiten.
-SEVAG (CIA): cloroformo/alcohol isoamílico (24:1): El cloroformo se encarga de eliminar los
restos de fenol, de desnaturalizar las nucleasas y de estabilizar la fase acuosa. Mientras que el
alcohol reduce formación de espuma y facilita la separación de las fases.

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3. Calcula la concentración y pureza del DNA obtenido en el proceso de extracción.
-Absorbancias:
𝐴260𝑛𝑚 = 0,050
𝐴280𝑛𝑚 =0,0807
-Concentración:
1µ 𝐴260 ---------------50 µg/ml
0,050 𝐴260 --------x
x=0,050*50 µg/ml*100=250 µg/ml
-Pureza:
𝐴260 / 𝐴280 =0,050/0,0807 = 0,616µg/ml
Esta relación nos permite conocer si el DNA ha sido contaminado por compuestos aromáticos,
ya que absorben a una longitud de onda de 280 nm.
En una muestra de DNA pura la relación será mayor a 1,8.
En caso de presentan una cantidad considerable de ARN, la relación superará los 2,1.
Y, sin embargo, se considerará contaminada por proteínas o fenoles si da valores inferiores a
1,6.
Por lo tanto, nuestra muestra está contaminada, y hubiese sido necesario realizar a la muestra
tratamientos adicionales para eliminar las impurezas.

4. Bibliografía:

http://sgpwe.izt.uam.mx/files/users/uami/pacopp/5-
EXTRACCION_Y_PURIFICACION_DE_ACIDOS_NUCLEICOS.pdf

http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/710/extraccion.pdf
http://riubu.ubu.es/bitstream/10259.1/32/4/Palacios_Santamaria.pdf
http://bibmed.ucla.edu.ve/edocs_bmucla/MaterialDidactico/Micro/BioCelular/Practica/extra
ccion_adn.pdf
http://redbiobancos.es/Pages/Docs/PNT_Acidos_Nucleicos.pdf
https://www.ins.gov.co/conocenos/sig/SIG/MEN-R03.3120-003.pdf