UNIVERSIDAD CATÓLICA DE SANTA

MARÍA

FACULTAD DE ARQUITECTURA E INGENIERÍA CIVIL Y

DEL AMBIENTE ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA
AMBIENTAL

Tema:
EXTRACCIÓN E IDENTIFICACIÓN DEL ADN
HECHO POR:
- LEON QUISPE, KHATLEEN KRIXIE

AREQUIPA – PERÚ
2021
 PRACTICA # 11

EXTRACCIÓN E IDENTIFICACIÓN DEL ADN

I. OBJETIVOS
1) Conocer las propiedades fisicoquímicas del DNA.
2) Aprender los métodos utilizados para la extracción y purificación del
DNA de tejidos animales.
3) Estudiar los efectos del incremento de la temperatura sobre la
conformación “natica del DNA.
4) Observar las alteraciones que se producen en la Absorvancia (D.O)
del DNA en la región UV, cuando éste se desnaturaliza.

II. MARCO TEÓRICO

Los ácidos desoxiribonucleidos (DNA) son componentes complejos de
elevado peso molecular, formado por estructuras más sencillas
denominadas nucleótidos.
Estas unidades fundamentales del DNA están constituidas por:
a) Una base nitrogenada: PURINAS (ADENINA Y GUANINA)
PIRIMIDINAS (CITOSINA Y TIMINA)
b) Un monosacárido de 5 átomos de carbono (DESOXIRIBOSA).
c) Ácido fosfórico.
De la combinación de estas sustancias resulta pues, un NUCLEÓTIDO
representado muy esquemáticamente así:
Dentro del nucleótido la combinación de la pentosa (Desoxiribosa en el
DNA y Ribosa en el RNA) con una base nitrogenada, constituye el
NUCLEOSIDO.
Los nucleótidos fundamentales de los DNAs son:
1. Los que poseen como base nitrogenada una PURINA:

a) Desoxidenosina - Monofosfato (dAMP) o Desoxiadenilato

b) Desoxiguanosina - Monofosfato (dGMP) o Desoxiguanilato

2. Los que poseen como base nitrogenada una PIRIMIDINA:

a) Desoxicitidina – Monofosfato (dCMP) o Desoxicitidilato

b) Desoxitimidina – Monofosfato (dTMP) o Desoxitimidilato

En el DNA:

1. Estos 4 nucleótidos se organizan en cadenas polinucleotidicas:

2. Dos cadenas polinucleotidicas antiparalelas, muy largas y delgadas
enrolladas en espiral a lo largo de un eje común, forman un DOBLE
HELICE, según el modelo de Watson y Crick.
3. Las dos cadenas son complementarias de tal modo que enfrente de
una base púrica se encuentra una base pirimidinica.
4. El estudiante debe tener presente que la secuencia variable de los
cuatro nucleotidos a lo largo de las cadenas polinucleotidicas del DNA,
constituye el fundamento de la identidad genética de cada organismo, lo
cual puede conservarse y transmitirse fielmente a su descendencia.
5. Para cumplir estas funciones el DNA tiene la capacidad de replicarse
y de dirigir la síntesis de proteínas, de acuerdo al dogma central de la
Biología Molecular:

Replicación

Todos los tejidos animales cuyas células tengan núcleo, son una fuente
potencial de DNA: Sin embargo en la práctica, la obtención de DNA de
diversos tejidos es dificultosa por las siguientes razones:

1. El tejido posee gran actividad de desoxiribonucleasa (DNasa) difícil

de inhibir y lo suficientemente fuerte como para destruir al DNA durante las
etapas extractivas (ejemplo el páncreas).

2. La alta proporción de otros constituyentes celulares (DNA, proteínas,

polisacáridos, lípidos), en relación al DNA, que pueden interferir con su
extracción y purificación (ejemplo: huevos de aves, de peces, etc.).

3. Si hay una fuerte unión entre el DNA y las proteínas, la extracción de

hace difícil (ejemplo: espermatozoides de mamíferos)
 Sin duda la mejor fuente para obtener DNA es el timo. Las células del timo
tienen una alta relación núcleo/citosol y tiene una baja actividad DNásica.
Otras fuentes posibles son el bazo, eritrocitos de aves (pollo, pato, etc.) o
peces (salmón, carpa, etc.).

En la presente práctica se extraerá, se purificara y se identificara los

componentes estructurales de DNA del timo.

III. PARTE EXPERIMENTAL

A) Extracción y purificación del DNA

Procedimiento:

Observe cuidadosamente cada una de las etapas del procedimiento a seguir:

1. Homogeneizar en una licuadora 2.0 g de timo de ternera en 25 ml de solución

salina 0.15 M conteniendo EDTA 0.1 M, a pH 8.0.
2. Transferir el homogeneizado anterior a una probeta de 100 ml con tapa
esmerilada y añadir 2 ml del detergente aniónico Lauril Sulfato al 25% Mezclar.
3. Colocar en baño maría a 60° C, durante 10 minutos.
4. Añadir 6.3 ml de NaCl 5M. Mezclar.
5. Añadir la solución de cloroformo – alcohol isoamílico (24:1 v/v) en in volumen
igual al obtenido en la etapa 4.
6. Centrifugar a 10000 rpm durante 10 minutos y luego separar el sobrenadante
con todo cuidado para evitar la desnaturalización.
7. Al sobrenadante de la etapa 6 añadir dos volúmenes de alcohol etílico al 95%,
para precipitar los ácidos nucleicos. Mezclar con varilla de vidrio, tratando de
enrollar los ácidos nucleicos.
8. Colocar la varilla de vidrio con los ácidos nucleicos, enrollados en un tubo de
prueba y disolverlos en 20 ml de solución salina – citrato (0.015 M 0.0015 M
respectivamente). Dejar en reposo por 30 minutos.
9. Añadir 2 ml de solución de acetato 3.0 M conteniendo EDTA 0.001 M a pH 7.0.
10. Mezclar con varilla de vidrio, añadiendo simultáneamente goa a gota 0.54
volúmenes de isopropanol, para precipitar selectivamente al DNA. Seguir
mezclando con la varilla de vidrio enrollando el DNA.

11. Disolver el DNA obteniendo en 20 ml de solución salina citrato (0.015 M –

0.0015 M).

Resultados:

1. En el espacio siguiente anote todas sus observaciones:

B) Identificación de Desoxibiribosa (Reacción de Dische)

Procedimiento:

1. Preparar dos tubos de prueba de acuerdo al siguiente cuadro:

X C

Solución de DNA obtenida del timo 2.0 ml ---

Solución salina citrato (0.015 M- ---- 2.0 ml

0.0015M)

Reactivo de Difenilamina 4.0 ml 4.0 ml

1. Mezclar bien el contenido de cada tubo y colocarlos en baño maría hirviente
por 10 minutos. Enfriarlos luego con agua corriente. Observar el color
producido en cada tubo.

Resultados:

1. En el espacio siguiente anote sus observaciones:

C) Identificación del fosfato

Procedimiento:

- Proceder primero a la Hidrolisis Acida del DNA.

1. Preparar 2 tubos de prueba de acuerdo al siguiente cuadro:

X C

Solución de DNA obtenida del timo 0.5 ml ---

Solución salina citrato (0.015 M- ---- 0.5 ml

0.0015M)

Ácido Perclórico 7.5 N 0.5 ml 0.5 ml

2. Después de colocar en cada tubo un embudo pequeño con su perla de vidrio,
dejar los tubos en baño maría hirviente por 30 minutos. Enfriar luego en agua
corriente.

- Proceder a identificar el fosfato inorgánico.

1. Preparar dos tubos de prueba de acuerdo al siguiente cuadro:

X C

Contenido del tubo X anterior 0.5 ml

Contenido del tubo C anterior ----- 0.5 ml

Agua destilada 3.5 ml 3.5 ml

Reactivo de Molibdato de Amonio 0.5 ml 0.5 ml.

Reactivo “Reductor” 0.5 ml 0.5 ml

2. Mezclar el contenido de cada tubo. Dejar en reposo 5 minutos. Observar el

color producido en cada tubo.
Resultados:

2. En el espacio siguiente anote todas sus observaciones:

D) Desnaturalización del DNA y Efecto Hipercrómico.

Procedimiento:

1. Colocar en un tubo de prueba 5 ml de la solución de DNA obtenida del timo y

calentarla a ebullición en baño maría hirviente por 15 minutos.
2. Enfriar y medir la obsorvancia de la solución en el espectrofotómetro a
longitudes de onda que van desde 240 a 300 nm.
3. Medir de la misma forma, la absorbancia de uns solución de DNA que no ha
sido calentada (DNA nativo).
Un experimento de este tipo dio los siguientes resultados:

Longitud de onda D.O (DNA nativo) D.O (DNA desnatur.)

300 0.005 0.035

290 0.013 0.138

280 0.265 0.340

270 0.358 0.533

265 0.420 0.588

 262 0.450 0.612

261 0.452 0.618

260 0.454 0.620

259 0.452 0.612

258 0.450 0.610

254 0.440 0.590

250 0.410 0.530

240 0.290 0.330

Resultados:

1. Construya una gráfica con los resultados anteriores, en papel milimetrado,

colocando en el eje de las ordenadas la Absorvancia y en el eje de abscisas
la longitud de inda. En el espacio siguiente haga un comentario de los
resultado obtenidos: