CICLOS FORMATIVOS: RAMA SANITARIA/SOCIOCOMUNITARIA/ACTIVIDADES FÍSICAS E DEPORTIVAS

TEMA 4:
HIBRIDACIÓN
DE ÁCIDOS
NUCLEICOS

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1. CONCEPTO DE HIBRIDACIÓN Y SU APLICACIÓN EN BIOLOGÍA MOLECULAR

La hibridación de ácidos nucleicos consiste en la unión de dos moléculas monocatenarias de ácidos

nucleicos, por la complementariedad de su secuencia de bases nitrogenadas, originando una molécula
híbrida bicatenaria.

Basándose en esta propiedad se han desarrollado múltiples metodologías en biología molecular,

denominadas de forma genérica técnicas de hibridación.

Las técnicas de hibridación permiten detectar secuencias concretas de ácidos nucleicos o dianas (ADN o
ARN) mediante el empleo de sondas marcadas.

Para entender esto, es necesario conocer los conceptos de “sonda” y “secuencia diana”.

 Sonda: cada de nucleótidos cuya secuencia de bases nitrogenadas es complementaria a la

secuencia diana.
 Secuencia diana: secuencia concreta de bases nitrogenadas que se pretende detectar en la
muestra problema.

Tras un proceso de hibridación adecuado se formará una estructura bicatenaria híbrida, constituida por
la sonda y la secuencia diana, que podrá ser detectada gracias al marcaje que se habrá incorporado a la
sonda.

2. BASES TEÓRICAS DE LA HIBRIDACIÓN

El proceso de hibridación sonda/ secuencia diana se basa en los fenómenos de desnaturalización/
renaturalización de las moléculas bicatenarias del ADN.

2.1. DESNATURALIZACIÓN

La desnaturalización es una propiedad del ADN consistente en la separación de dos cadenas de

una molécula bicatenaria por ruptura de los puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas
complementarias.
La desnaturalización se consigue aumentando la temperatura o aumentando el pH (pH
alcalino). Su comportamiento se representa en la curva de fusión del ADN.

Curva de fusión del ADN

La curva de fusión es una curva de tipo sigmoideo que se obtiene al medir la absorbancia a 260
nm de una solución de una molécula bicatenaria de ADN en función de la temperatura.
En la curva de fusión de una molécula bicatenaria de ADN se distinguen tres zonas:

o Primera zona (zona A): es un tramo recto sin pendiente debido a que la absorbancia a
260 nm tiene un valor constante aunque aumente la temperatura. Este valor
corresponde al valor basal de absorbancia de la molécula bicatenaria y depende
únicamente de la concentración de la molécula de ADN en solución. La temperatura
en esta zona no alcanza un valor suficiente para romper puentes de hidrógeno y, por
tanto, el porcentaje de desnaturalización es 0%, es decir, todo el ADN está en forma
de doble hélice bicatenaria.

o Segunda zona (zona B): en este tramo se observa un aumento de la absorbancia a

medida que aumenta la temperatura , primero de manera lenta (curva cóncava) ,
después de forma rápida (recta con pendiente elevada) y finalmente de manera lenta

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nuevamente (curva convexa) hasta alcanzar un valor de absorbancia máximo. En este

rango de temperatura es donde se produce la desnaturalización progresiva de la
molécula de ADN, de manera que al alcanzarse el valor máximo de absorbancia la
desnaturalización es del 100%. El aumento de absorbancia a medida que la molécula
se desnaturaliza se conoce como efecto hipercrómico.

o Tercera zona (zona C): la gráfica en esta zona corresponde a una recta de pendiente
prácticamente nula, debido a que la absorbancia se mantiene en el valor máximo
aunque la temperatura siga aumentando. En esta fase, el ADN se mantiene
desnaturalizado al 100%.

Temperatura de fusión
La temperatura de fusión (Tm) de una molécula bicatenaria de ADN es la temperatura a la cual la
desnaturalización es del 50%.
Para moléculas pequeñas, de menos de 500pb, la Tm aumenta con la longitud. Pero para moléculas
de más de 500 pb, el factor que más influye en la Tm es la proporción de pares GC (bases unidas por
tres puentes de hidrógeno). En consecuencia, cuanto mayor sea la proporción de pares GC en una
molécula, mayor será el número de puentes de hidrógeno que hay que romper para
desnaturalizarla, y, por lo tanto, mayor cantidad de energía habrá que suministrar (en forma de
calor) para separar las dos cadenas.

La Tm de las moléculas de gran tamaño está directamente relacionada con el contenido en pares GC:
a mayor porcentaje de pares GC, mayor Tm.

2.2. RENATURALIZACIÓN

La renaturalización es el proceso por el cual las dos cadenas de una molécula de ADN
completamente separadas mediante desnaturalización térmica vuelven a reasociarse, al bajar
lentamente la temperatura, hasta formar la doble hélice original.

Este fenómeno se puede medir por la disminución de la absorbancia a 260 nm.

Cinética de renaturalización

En una solución que contiene ADN totalmente desnaturalizado, para que dos cadenas
complementarias se reasocien tiene que producirse un choque aleatorio entre ambas.

Cuanto mayor sea el número de cadenas en la solución, es decir, cuanto mayor sea la
concentración, mayor será la probabilidad de que dos cadenas complementarias se encuentren y,
por lo tanto, mayor será la velocidad de renaturalización.

Esta es una primera diferencia entre desnaturalización y renaturalización, en la desnaturalización

influye la composición de las bases y no influye la concentración, mientras que en la
renaturalización influye la concentración y no la composición de las bases.

Una vez que las dos cadenas complementarias de una molécula se encuentran, la reasociación se
produce en dos fases:

I. Fase de nucleación: es una fase lenta en la que secuencias cortas de bases

complementarias se aparean por formación de puentes de hidrógeno. La velocidad de la
renaturalización viene marcada por la fase de nucleación.

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II. Fase de “cierre en cremallera”: es una fase rápida en la que se produce el cierre de las
secuencias vecinas originando la doble hélice.

Curvas de renaturalización

La curva de reanturalización o curva de C0t es la representación de la fracción de ADN

renaturalizado frente al logaritmo de C0t.
Esta curva tendrá un comportamiento diferente dependiendo de la complejidad del ADN y por
tanto en función de si el genoma es de un organismo eucariota o procariota.
Curvas de renaturalización de genomas procariotas
Para grandes moléculas y genomas sin secuencias repetidas, como los de organismos procariotas, la
curva de renaturalización es una curva sigmoide en la que también se puede definir un punto medio
C0t1/2.
El valor C0t1/2 se define como el valor de C0t al cual la renaturalización es del 50%.
Este valor está directamente relacionado con la complejidad del ADN que renaturaliza. A mayor
complejidad, mayor C0t1/2.
La velocidad de renaturalización es inversamente proporcional a la complejidad de la molécula.

Curvas de renaturalización de genomas eucariotas

En el caso de grandes moléculas y genomas con secuencias repetidas, como los de organismos
eucariotas, la curva de renaturalización no es sigmoide, sino escalonada, con varios puntos de
inflexión.

Para poder explicar esta curva se debe puntualizar que:

 Los genomas eucariotas contienen tres tipos de secuencias: las altamente repetidas, que se
repiten un número muy elevado de veces a lo largo del genoma, las moderadamente
repetidas, que se repiten varias veces y las secuencias únicas, que aparecen solo una vez.
 Para realizar las curvas de renaturalización de grandes moléculas y genomas completos, el
ADN se fragmenta.

En la curva de renaturalización de genomas eucariotas se observan tres fases o componentes:

 Componente rápido: corresponde a las secuencias altamente repetidas y que se reasocia
rápidamente, porque su concentración en la solución es mucho mayor que el de las demás
secuencias.
 Componente intermedio: corresponde a las secuencias moderadamente repetidas y que
renaturaliza más lentamente que el anterior porque su concentración es menor.
 Componente lento: corresponde a las secuencias únicas, concentración es muy baja y por
lo tanto renaturaliza lentamente.

2.3. HIBRIDACIÓN
El híbrido sonda/ secuencia diana tiene las mismas propiedades que una molécula bicatenaria de ADN
en cuanto a desnaturalización y renaturalización.

Las sondas usadas en las técnicas de hibridación suelen reconocer regiones de ADN o ARN de secuencia
única, por lo que la formación del híbrido sonda/ secuencia diana sigue una cinética de hibridación
similar a la cinética de renaturalización de moléculas bicatenarias de ADN de secuencias únicas.

Curva de fusión de un híbrido

Es una curva de tipo sigmoide y permite definir la correspondiente temperatura de fusión del híbrido. La
Tm de un híbrido puede variar, dependiendo de la composición del solvente en el que se efectúa la
hibridación.

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Factores que influyen en la hibridación

Todos aquellos factores que pueden modificar la Tm de un híbrido influyen en la hibridación.
Estos son: la fuerza iónica de la solución, la presencia de agentes desnaturalizantes y el porcentaje de
bases no complementarias o mismatch.

 Fuerza iónica en la solución: las moléculas de ácidos nucleicos y, en este caso, los híbridos
tienen una carga eléctrica neta negativa por los fosfatos dispuestos en la periferia de la
doble hélice.
Los cationes monovalentes presentes en la solución se disponen rodeando los híbridos y
neutralizando carga negativa. Este fenómeno estabiliza la doble hélice, ya que disminuye la
repulsión electrostática entre las dos cadenas cadenas negativamente.
En consecuencia, cuanto mayor es la concentración de cationes monovalentes en la
solución, más energía en forma de calor hay que aportar al híbrido para desnaturalizarlo.
Esto se refleja en la curva de fusión, que se desplaza hacia la derecha cuando se aumenta
la concentración de cationes monovalentes, aumentando la Tm.

 Agentes desnaturalizantes: algunos agentes desnaturalizantes y solventes orgánicos, como

el dimetilsulfóxido (DMSO) y la formamida, desestabilizan los puentes de hidrógeno entre
las bases complementarias, facilitando su ruptura.
Si se añaden estos compuestos al híbrido en solución, se requiere menos energía para
desnaturalizarlo, por lo que la curva de fusión se desplaza hacia la izquierda y la Tm
disminuye.

 Porcentaje de bases no complementarias: dependiendo de las condiciones en que se

realice la hibridación, una sonda puede unirse tanto a su secuencia diana como a
secuencias parecidas a la diana que tengan algunas bases distintas no complementarias.
Es decir, se pueden formar híbridos imperfectos que mantienen un número reducido de
bases desapareadas y, por lo tanto, contienen un número de puentes de hidrógeno que los
híbridos perfectos. Por ello, el porcentaje de pares de bases no complementarias en el
híbrido o mismatch es otro factor que influye en la Tm: a mayor mismatch, menor Tm.
Este fenómeno justifica el empleo de oligonucleótidos pequeños para detectar mutaciones
puntuales por hibridación.

3. LAS SONDAS

Dado que las sondas son un elemento clave en la realización de técnicas de hibridación,
conviene profundizar en su conocimiento.

3.1. CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LAS SONDAS

Las sondas pueden ser bicatenarias o monocatenarias y su tamaño puede oscilar entre el de
pequeños oligonucleótidos y el de grandes moléculas de miles de nucleótidos.

La elección de unas u otras dependerá de la especificidad y sensibilidad que se pretenda

conseguir y tendrá relación con el tipo de muestra que se vaya a estudiar, la técnica que se
vaya a aplicar y el marcaje empleado:
 Especificidad: capacidad que tiene una sonda para discriminar la secuencia diana con la
que se tiene que hibridar. Las secuencias inferiores a 16 bases tienen una probabilidad muy
elevada de encontrarse repetidas aleatoriamente a lo largo de un genoma, por lo que
sondas con ese tamaño hibridarían inespecíficamente con secuencias diana repartidas al
azar por todo el genoma en estudio, imposibilitando la detección específica de la región de
interés.

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 Sensibilidad: es la probabilidad de detectar cantidades mínimas del híbrido sonda-

secuencia diana y está en relación con el número de moléculas marcadoras que admite la
sonda.

3.2. TIPOS DE SONDAS

Según la naturaleza, las sondas utilizadas en las técnicas de hibridación se pueden clasificar en:
 Sondas ADN
 Sondas ARN
 Sondas químicas sintéticas de ácidos nucleicos

Sondas de ADN: las sondas de ADN son las más utilizadas porque son fáciles de obtener en
grandes cantidades y presentan una gran versatilidad en cuanto a tamaño y métodos de
marcaje. Además, sus cinéticas de desnaturalización y renaturalización son las más estudiadas y
mejor comprendidas.
Según el proceso de obtención, las sondas de ADN pueden ser de:

o Síntesis química: se obtienen por condensación química secuencial de los

desoxinucleótidos concretos que interesa incorporar para obtener una secuencia
determinada.
Actualmente este proceso está automatizado, anclando el primer nucleótido de la
secuencia a una fase sólida y añadiendo nucleótido a nucleótido mediante ciclos de
reacciones químicas.
Estas sondas se caracterizan por ser monocatenarias y tener un tamaño reducido
(< 200 nucleótidos), siendo los más habituales inferiores a 40- 50 nucleótidos.
Ventajas: al ser monocatenarias, no necesitan desnaturalización por calor durante el
proceso de hibridación, y su tamaño reducido les permite una mejor penetración en el
tejido, lo cual resulta ventajoso en las técnicas de hibridación in situ, sobre todo para
detectar ARNm.
Inconvenientes: baja sensibilidad y gran facilidad para hibridar inespecíficamente con
secuencias parecidas a la secuencia diana, por lo que la hibridación tiene que hacerse
en condiciones muy estrictas.

o ADN recombinante: las sondas de ADN recombinante se obtienen por un proceso de

clonación y amplificación por cultivo, que sigue los pasos siguientes:
1. El fragmento de ADN que queremos emplear como sonda se inserta en un
vector, normalmente un plásmido bacteriano.
2. El plásmido recombinante se introduce en una bacteria y se cultivo en un
medio apropiado.
3. Posteriormente se extrae el plásmido amplificado y se emplea entero como
sonda, o bien se separa el fragmento de interés con enzimas de restricción.
Estas sondas se caracterizan por:
- Ser bicatenarias. Esto hace que se requiera desnaturalización por calor como paso
previo a la hibridación con las secuencias diana.
- Tener un gran tamaño (cientos y miles de pares de bases). Gran sensibilidad.
- No suelen hibridar inespecíficamente, por lo que presentan mayor especificidad.

o PCR: consiste en amplificar el fragmento que nos interesa como sonda mediante la
reacción en cadena de la polimerasa. Este método implica conocer las secuencias que
flanquean el fragmento que queremos amplificar.
Las sondas de PCR se caracterizan por ser bicatenarias y tener un tamaño intermedio
(cientos de bases).

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Sondas de ARN
Conocidas también como ribosondas, son menos utilizadas que las sondas de ADN. Son
monocatenarias, por lo que no requieren el paso de desnaturalización antes de la hibridación.
Tienen como ventaja que los híbridos ADN/ ARN son ligeramente más estables que los híbridos
ADN/ ADN, y como inconveniente, que son muy sensibles a cualquier contaminación dada la
omnipresencia de las ARNasas, que las degradan rápidamente.
Según el proceso de obtención, las sondas de ARN pueden ser de síntesis química o de
transcripción.

Sondas químicas sintéticas de ácidos nucleicos

Normalmente las sondas utilizadas en las técnicas de hibridación son moléculas de ADN o ARN,
pero en la actualidad se están empezando a comercializar cono sondas modificaciones químicas
sintéticas de los ácidos nucleicos, tales como las sondas de ácidos nucleicos peptídicos o las
sondas de ácidos nucleicos bloqueados (se obtienen por síntesis química).

3.3 EL MARCAJE DE LAS SONDAS

Las sondas empleadas en técnicas de hibridación deben estar marcadas para poder detectar el
híbrido formado con la secuencia diana.
El marcaje es el procedimiento de marcar la sonda utilizada en las técnicas de hibridación con la
finalidad de poder visualizar los resultados.

Tipos de marcadores
Podemos clasificar los marcadores según:
o Marcadores que posibilitan la detección directa del híbrido: isótopos radiactivos y
fluorocromos.
o Marcadores que requieren métodos indirectos de revelado en varios pasos: haptenos
(digoxigenina y biotina).
- Isótopos radiactivos: son elementos químicos con capacidad de emitir radiaciones.
- Fluorocromos: son compuestos químicos que emiten luz al ser excitados por la luz
ultravioleta.
- Haptenos: son moléculas de pequeño tamaño que, al igual que los fluorocromos,
se pueden acoplar a los nucleótidos y no alteran la especificidad de la sonda,
aunque no pueden ser detectados directamente.

Métodos de marcaje
La mayoría de los métodos de marcaje utilizan reacciones enzimáticas y se basan en la
incorporación a la sonda de nucleótidos marcados. Los más habituales son: desplazamiento de mella,
cebado al azar o cebado aleatorio, marcaje terminal, marcaje por PCR y marcaje de sondas de ARN.

o Desplazamiento de malla (Nick translation): se utiliza para marcar sondas de ADN bicatenario
de gran tamaño, obtenidas normalmente por tecnología de ADN recombinante, pero también
para marcar genomas enteros. Se procede incubando una determinada cantidad de sonda con
una mezcla de reacción que contiene los siguientes elementos:
- ADNasa I
- ADN polimerasa I bacteriana
- Una mezcla de desoxirribonucleótidos trifosfato. De los cuatro tipos posibles de
desoxirribonucleótidos, uno de ellos está marcado, normalmente con un isótopo
radiactivo o con un hapteno.

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Durante la incubación, normalmente a baja temperatura (15ºC), tienen lugar los siguientes
procesos:
1. La ADNasa I a bajas concentraciones y en presencia de cationes magnesio rompe enlaces
fosfodiéster entre dos nucleótidos consecutivos al azar en ambas cadenas de la sonda. Es
decir, produce mellas en sitios al azar en ambas cadenas.
2. La ADN polimerasa I intenta reparar las mellas. Para ello, gracias a su actividad exonucleasa
5´ 3´, va eliminando nucleótidos, uno a uno, desde la mella hacia el extremo 3´de la
cadena. Simultáneamente, gracias a su actividad polimerasa 5´ 3´, va incorporando en el
extremo 3´- OH libre de la mella, sintetizando ADN complementario a la hebra intacta. Los
nucleótidos que incorpora los toma del medio de reacción y uno de ellos está marcado. De
esta manera, la ADN polimerasa I desplaza la mella a lo largo de la cadena de ADN,
sustituyendo ADN sin marcar por ADN marcado.

o Cebado al azar o cebado aleatorio (random priming): Se suele usar para marcar sondas de ADN
bicatenario de gran tamaño o genomas completos con isótopos radiactivos o haptenos.
La sonda se incuba con los siguientes reactivos:
- Una mezcla de todos los oligonucleótidos posibles de 6 bases (hexámeros).
- Fragmento Klenow de la ADN polimerasa I. Este fragmento conserva la actividad
polimerasa 5´ 3´, pero carece de la actividad exonucleasa 5´ 3´.
- Mezcla de desoxirribonucleótidos trifosfato, uno de ellos marcado.
La reacción de marcaje se produce en varias fases:
1. Desnaturalizaicón de la sonda
2. Unión de los hexámeros a las cadenas de la sonda al azar. La concentración de hexámeros,
las condiciones en las que se trabaja y la presencia en la mezcla de todas las posibles
combinaciones de hexámeros garantizan la unión al azar de hexámeros por
complementariedad de bases en múltiples zonas de las cadenas de la sonda.
3. Los hexámeros unidos a la sonda actúan como cebadores para que la ADN polimerasa I
(fragmento Klenow) sintetice cadenas de ADN complementarias a la cadena que actúa de
molde, incorporando los desoxirribonucleótidos que hay en el medio de reacción, uno de
los cuales está marcado.
Algunos kits comerciales de marcaje, basados en este método, utilizan como cebadores
oligonucleótidos de mayor tamaño, hasta 10 bases.

o Marcaje terminal: se utiliza para marcar sondas de ADN bicatenario o monocatenario, de

pequeño y mediano tamaño, tanto radiactivamente, como con fluorocromos o haptenos.
En el marcaje terminal se emplea la enzima desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT), una
ADN polimerasa capaz de incorporar desoxirribonucleótidos al extremo 3´- OH libre de una
molécula de ADN sin necesidad de una cadena molde. Esta enzima es capaz de incorporar todo
tipo de nucleótidos marcados. Para realizar el marcaje, la sonda se incuba con la TdT, un
desoxinucleótido trifosfato marcado y/o didesoxinucleótidos.
Hay dos posibilidades de marcaje:
 Marcaje único en el extremo 3´: consiste en incorporar un único nucleótido marcado
(normalmente con fluorocromo) en el extremo 3´de la sonda. Se consigue añadiendo a
la mezcla un didesoxinucleótido marcado, en lugar de un desoxinucleótido marcado.
Cuando se incorpora un didesoxi se detiene la síntesis, ya que no se pueden formar
nuevos enlaces fosfodiéster.
 Incorporación de una cola de nucleótidos marcados: en este caso la sonda se marca
añadiendo una cola de nucleótidos marcados de longitud variable.

o Marcaje por PCR: el marcaje de sondas PCR se realiza en el mismo proceso de obtención de
sondas por PCR, con marcadores radiactivos o con haptenos, utilizando desoxinucleótidos
marcados en la mezcla de PCR.

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o Marcade de sondas de ARN: el marcaje se puede realizar en el mismo proceso de obtención de

la sonda ARN mediante transcripción con una ARN polimerasa, añadiendo ribonucleótidos
marcados a la mezcla de reacción.

Purificación de la sonda marcada

Una vez marcada la sonda conviene eliminar el exceso de nucleótidos no incorporados

presentes en el medio de reacción.
La purificación de la sonda consiste en la eliminación d ellos nucleótidos libres marcados para evitar
ruido de fondo o interferencias en los resultados de las técnicas de hibridación.
Los dos métodos más usados para la purificación de las sondas son cromatográficos: la cromatografía de
exclusión por tamaño y la cromatografía de adsorción.

 Cromatografía de exclusión por tamaño: se suelen utilizar geles empaquetados en

microcolumnas que se acoplan a tubos colectores de tipo Eppendorf. La mezcla de
reacción se carga en la columna y se centrifuga, de manera que los nucleótidos libres
quedan retenidos en el gel y la sonda marcada purificada se recoge en el tubo
colector.

 Cromatografía de adsorción: se utilizan matrices de lana de vidrio o sílice

empaquetados en microcolumnas que se acoplan a tubos colectores tipo Eppendorf,
similares a las utilizadas en la purificación de ácidos nucleicos.

4. FASES DE LA HIBRIDACIÓN
Todas las técnicas de hibridación se pueden dividir en cuatro fases genéricas: preparación de la
muestra y soporte (prehibridación), hibridación, lavado de poshibridación y detección del híbrido.

4.1. FASE DE PREHIBRIDACIÓN

Es la fase de preparación de la muestra y soporte. Según la técnica, se puede desarrollar en
múltiples pasos, que incluyen digestiones enzimáticas, electroforesis, transferencias, bloqueos
de unciones inespecíficas, etc.

4.2. FASE DE HIBRIDACIÓN

En esta fase se produce la formación del híbrido sonda/secuencia diana, y es importante tener
en cuenta:
 La Tm del híbrido: la mayor eficacia de hibridación se consigue a temperaturas
comprendidas entre Tm -32 y Tm -16ºC, siendo máxima a Tm -25ºC. La hibridación se
suele realizar a temperaturas prefijadas estándar, normalmente 37, 42 o 65 ºC,
dependiendo de las técnicas.
 Que se realice en condiciones relajadas para facilitar la formación y la estabilidad del
híbrido. Esto se consigue con una baja concentración de formamida y una alta
concentración de cationes monovalentes.

4.3. LAVADO DE POSHIBRIDACIÓN

Esta es una fase crítica del proceso de hibridación. El objetivo es mantener los híbridos
sonda/secuencia diana y eliminar los híbridos imperfectos con secuencias parecidas a la diana.
Por lo tanto, de esta fase depende en gran medida la especificidad de la técnica.
El lavado se realiza con un tampón el que se fijan las llamadas condiciones de rigurosidad
(stringency), combinando temperatura de lavado, fuerza iónica y concentración de formamida.
La rigurosidad del lavado de poshibridación se define como Tm -XºC.

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Cuanto menor sea X, mayor será la rigurosidad del lavado y, por lo tanto, se conseguirá mayor
especificidad. Como inconveniente, para valores de X inferiores a 15 empieza a disminuir la
sensibilidad, puesto que se trabaja en zonas de curva de eficiencia de hibridación fuera de la
zona de máximos.
A veces interesa mantener cierto grado de mismatch en la detección de secuencias. En este
caso, el lavado de poshibridación se realiza en condiciones de rigurosidad relajada. Pero lo
habitual es fijar condiciones de elevada rigurosidad en el lavado de poshibridación, permitiendo
que se mantengan estables solo híbridos con bajo o ningún porcentaje de mismatch.

4.4. FASE DE DETECCIÓN DEL HÍBRIDO

La última fase de la hibridación consiste en detectar los híbridos específicos gracias al marcaje
de la sonda. Según cual sea el tipo de marcador utilizado (radiactivo, fluorocromo o hapteno)
variará el método de detección.

 Marcaje radiactivo: normalmente se emplea en técnicas de hibridación sobre soporte.

La detección se realiza mediante autorradiografía colocando una placa de rayos X
sobre el soporte para que la emisión radiactiva del marcador lo impresione. Tras el
revelado de la placa, la positividad de la hibridación se observa como marcas (puntos,
manchas o bandas) oscuras.

 Fluorocromos: normalmente se emplean en técnicas de hibridación in situ. Finalizada

la técnica, las preparaciones se llevan al microscopio de fluorescencia donde, al ser
excitadas con una longitud de onda adecuada, se produce la correspondiente emisión
fluorescente del marcador que permite la visualización.

 Haptenos: se usan en todo tipo de técnicas. La detección se realiza por métodos

inmunohistoquímicos con un anticuerpo antihapteno marcado con un fluorocromo o
una enzima, que cataliza una reacción en la que se produce un producto coloreado. Si
el hapteno utilizado como marcador es la biotina, en la detección se puede sustituir el
anticuerpo por estreptavidina marcada.

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