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Este documento describe dos experimentos relacionados con la cuantificación y caracterización de ácidos nucleicos. El primer experimento explica cómo cuantificar ADN mediante espectrofotometría, midiendo la absorbancia a 260 nm y la proporción 260/280 nm. El segundo experimento demuestra el efecto hipercrómico del ADN, donde la desnaturalización térmica causa un aumento en la absorbancia a 260 nm, permitiendo determinar el punto de fusión del ADN.
Este documento describe dos experimentos relacionados con la cuantificación y caracterización de ácidos nucleicos. El primer experimento explica cómo cuantificar ADN mediante espectrofotometría, midiendo la absorbancia a 260 nm y la proporción 260/280 nm. El segundo experimento demuestra el efecto hipercrómico del ADN, donde la desnaturalización térmica causa un aumento en la absorbancia a 260 nm, permitiendo determinar el punto de fusión del ADN.
Este documento describe dos experimentos relacionados con la cuantificación y caracterización de ácidos nucleicos. El primer experimento explica cómo cuantificar ADN mediante espectrofotometría, midiendo la absorbancia a 260 nm y la proporción 260/280 nm. El segundo experimento demuestra el efecto hipercrómico del ADN, donde la desnaturalización térmica causa un aumento en la absorbancia a 260 nm, permitiendo determinar el punto de fusión del ADN.
Prctica N4: Cuantificacin de cidos Nucleicos y Efecto hipercrmico
del ADN
Despus de haber realizado la extraccin de ADN, y/o ARN para diversas
aplicaciones, se requiere conocer la cantidad y la calidad del cido nucleico obtenido. Generalmente, se realiza mediante la medicin de la cantidad de irradiacin ultravioleta absorbida por las bases o por la intensidad de fluorescencia por bromuro de etidio. El efecto hipercrmico es el incremento de absorbancia en un material. La hipercromicidad del ADN ocurre cuando el dplex se desnaturaliza, dando dos cadenas sencillas que absorben ms en el ultravioleta. Esta caracterstica del ADN es una forma de seguir el proceso de desnaturalizacin de la molcula: a medida que el proceso avanza, se observa un incremento en la absorbancia. Objetivos: 1. Identificar los mtodos de cuantificacin de cidos nucleicos 2. Adquirir conocimiento bsico para el manejo y funcionamiento del espectrofotmetro para realizar la medicin del cido nucleico en estudio 3. Entender y verificar el efecto hipercrmico del ADN Experimento I: Cuantificacin de cidos Nucleicos Objetivos: 1. Realizar la medicin y cuantificacin del ADN por espectrofotometra 2. Conocer la calidad y cantidad del ADN obtenido en la extraccin realizada en clase Teora: Para cuantificar la cantidad de material obtenido despus de una extraccin de cidos nucleicos o determinar la concentracin de ADN de alto peso molecular, plsmidos o productos de PCR, o la sntesis qumica de un oligonucletido se debe tomar una lectura a 260 nm y 280 nm. La lectura a 260nm permitir calcular la concentracin de cidos nucleicos en la muestra. Con este mtodo pueden ser detectarse concentraciones tan bajas como 2.5g/ml. A pH neutro, una solucin de ADN a 1 mg/ml tiene una absorcin mxima a 260nm de 20 cuando se lee en una celda de 1cm (este valor es para ADN con G+C de 50%, sin embargo para muchas aplicaciones no es necesario considerarlo a menos que sea muy extremo). En principio se toma como referencia que una Abs260 igual a1.0 corresponde a: una solucin de dsADN con una concentracin de 50 g /ml, una solucin de ARN con una concentracin 40 ug/ml o una solucin de ssADN con una concentracin de 20 ug/ml (cuando se trata de oligonucletidos). La proporcin de la lectura entre 260 y 280 (DO 260/DO280) proporciona una estimacin de la pureza del cido nucleico. Es as como preparaciones puras de ADN tienen DO 260/DO280 entre 1.65-1.9. Cuando se trata de ARN el valor OD 260/OD280 es muy cercano a 2.0. Si hay contaminacin con protenas o fenol u otras soluciones empleadas durante la extraccin, el valor de la proporcin es menor a 1.6 y no es posible cuantificar de manera precisa el ADN. Si no es posible cuantificarlo por este mtodo por la poca cantidad de ADN obtenido (<250 ng/ml) o el ADN est contaminado con otras sustancias que absorben radiacin ultravioleta, se puede realizar utilizando fluorescencia inducida por luz UV emitida por el bromuro de etidio que se intercala en el ADN, debido a que la cantidad de fluorescencia es proporcional a la cantidad de ADN en la muestra. De esta manera, puede estimarse la cantidad de cido nucleico, comparando la fluorescencia producida por mi muestra en estudio, con una serie de estndares o patrones. Materiales y Reactivos 1. Buffer TE (Tris-HCl 10mM, pH 8; EDTA 1 mM) 2. ADN obtenido con anterioridad 3. Micropipetas y puntas estriles 4. Guantes 5. Espectrofotmetro 6. Cubetas de cuarzo 7. Toallas de papel o servilletas 8. Tubos eppendorf 1.5 ml Procedimiento 1. Preparar 1ml de solucin de ADN diludo 1/100 en buffer TE. 2. Colocar la solucin de ADN en la cubeta de cuarzo y realizar la medicin a 260 nm y a 280 nm 3. Usar TE como solucin blanco si el ADN fue rehidratado con este buffer o agua destilada, si fue esta la solucin de hidratacin 4. Realizar los clculos respectivos considerando:(A260) unidad = dsADN50 g /ml y el factor de dilucin Experimento II: Efecto hipercrmico Objetivos: 1. Verificar el proceso de desnaturalizacin del ADN por incremento de la absorbancia a 260 nm. 2. Identificar y determinar el punto de fusin (Tm) en una curva de desnaturalizacin trmica (fusin) de una molcula de ADN Teora: Las disoluciones de la forma de doble hlice del ADN experimentan cambios significativos en varias de sus propiedades fsicas cuando se someten a: a) pHs extremados, 2) Temperatura, c) disminucin de la constante dielctrica del medio acuoso por incorporacin de alcoholes, cetonas, etc y d) exposicin a la urea, amidas y otros solutos similares. La viscosidad de las disoluciones de ADN disminuye, la absorcin luminosa a 260 nm aumenta, la rotacin ptica se torna ms negativa y la densidad de flotacin aumenta. Este cambio fsico del ADN se denomina desnaturalizacin. Durante la desnaturalizacin no se rompen enlaces covalentes pero la estructura duplo-helicoidal se desenrolla y se separa debido a que se interrumpe cualquiera de las dos fuerzas responsables de mantener la estructura de doble hlice: los puentes de hidrgeno y las interacciones del apilado entre bases sucesivas. El cambio fsico ms fcil de utilizar como medida de la desnaturalizacin es el incremento de la absorcin luminosa observada a 260 nm, el efecto hipercrmico. Las bases purnicas y pirimidnicas (que son aromticas) as como sus correspondientes nucletidos absorben la luz UV a 260 nm, sin embargo el ADN dplex nativo absorbe mucho menos luz a 260 nm de lo que podra predecirse por la suma de la luz absorbida por sus mononucletidos constituyentes. Al desnaturalizar el ADN por calor, se observa que a cierta temperatura la absorbancia aumenta abruptamente en un 25 a 30% (hasta un 40%) segn la muestra. El total de luz absorbida por un ADN completamente desnaturalizado es casi igual al de un nmero equivalente de los correspondientes mononucletidos libres. El porcentaje de incremento de absorcin se halla directamente relacionado con el contenido de pares A-T, cuanto mayor la proporcin de pares A-T, mayor el incremento de absorcin lumnica. Es decir, distintos ADNs aumentan la absorbancia abruptamente a distintas temperaturas dependiendo del nmero de puentes de hidrgeno. El efecto hipercrmico se utiliza para cuantificar la cantidad de ADN que se tiene en forma de doble hebra o de cadena sencilla. Al representar la temperatura frente a la absorcin a 260 nm se observa una curva sigmoidea, con lo que se deduce que las fuerzas que estabilizan la estructura helicoidal son cooperativas, es decir, cuesta mucho romper las primeras interacciones estabilizantes, pero una vez conseguido el resto se rompe muy fcilmente. Hay un umbral mnimo de energa a partir del cual el proceso de desnaturalizacin es muy rpido. El punto de fusin del ADN La desnaturalizacin trmica del ADN recibe el nombre de fusin (melting). Las muestras de distintos tipos de clulas poseen distintos puntos de fusin caractersticos, definidos como Tm o Temperatura del punto medio de su curva de fusin, es decir, es aquella donde el ADN est 50% desnaturalizado. Tm aumenta de modo lineal con el contenido en pares G-C que son ms estables que pares A-T. Cuanto ms pares G-C ms estable la estructura y mayor la energa trmica necesaria para provocar su disrupcin. Materiales y Reactivos: 1. Muestra de ADN 2. Bao de agua caliente 3. Cocinilla 4. Termmetro 5. Espectrofotmetro 6. Papel milimetrado Procedimiento: 1. Diluir la muestra de ADN 1/100 para 1ml de solucin. Medir la absorbancia a 260 nm (medida M1) utilizando TE como blanco. 2. Incubar la solucin de ADN hasta que alcance aproximadamente una temperatura de 90 C (unos 5 min) y valorar la absorbancia (medida M2). 3. Dejar enfriar lentamente hasta la temperatura ambiente, o bien meter inmediatamente el tubo en hielo, y valorar la absorbancia tras unos minutos (medida M3). 4. Con los datos proporcionados en clase de absorbancias a 260 nm a distintas temperaturas de una muestra de ADN realizar la curva de desnaturalizacin trmica para hallar el punto de fusin (Tm) de dicha muestra. Cuestionario 1. Por qu se toman medidas en el espectrofotmetro a 280 nm? 2. Con que tipo de lmpara en el espectrofotmetro espera poder realizar la medicin? 3. Porque se utilizan cubetas de cuarzo para realizar esta medicin? 4. En qu consiste el equipo cuantificador de cidos nucleicos o Nanodrop? 5. Investigue que otros mtodos se utilizan en la actualidad para realizar la cuantificacin de cidos nucleicos y cules son sus ventajas. 6. Por qu ocurre el hipocromismo del ADN? 7. Explique las etapas de desnaturalizacin del ADN. Bibliografa Ausubel F, Brent R, Kingston R, Moore D, Seidman J, Smith J y Struhl K, editores. Current Protocolos in Molecular Biology. Massachusetts General Hospital: Harvard Medical School; 1990. David LG, Dibner MD y Battery JF. Basic methods in molecular biology. Elsiever Science publishing Co. Ind. NY; 1986. Nelson DL y Cox MM. Lehninger Principios de Bioqumica. 4 edicin. Ed. Omega;2005 Mathews CK, Van Holde KE y Ahen KG. Bioqumica. 3 edicin. Ed. Addison Wesley/Pearson Education. Madrid; 2002. Sambrook J, Fritsch EF y Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2da ed. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989.