gradiente de densidad.

Estas bandas aparecen en nuevas posiciones, porque el ADN

desnaturalizado tiene una densidad mayor que el ADN nativo. En la replicación
semiconservativa, las hebras individuales de ADN desnaturalizado deben tener la mitad del
peso molecular de la molécula híbrida nativa. En el caso del modelo conservador
mencionado anteriormente, las hebras de ADN desnaturalizado deberían tener un peso
molecular de una cuarta parte del de la molécula híbrida. Los resultados experimentales
volvieron a favorecer el modelo semiconservador, pero la precisión experimental no fue lo
suficientemente alta como para que los resultados fueran completamente claros. Sin
embargo, en conjunto, la evidencia a favor de la replicación semiconservativa es suficiente
para permitirnos aceptar este modelo.
En este sentido (ver también más adelante) debemos mencionar que el ADN
desnaturalizado puede reformarse a la forma nativa 9 a pesar de que en el ADN
desnaturalizado las dos hebras se hayan separado.
¿Observamos de paso que hay relativamente poco ADN entre la posición de las tres
bandas? lo que indica que el ADN extraído casi siempre tiene las densidades del ADN puro
15 N- 15 N, puro 14 N- 15 N o puro 14 N- 14 N. Esta observación implica que el proceso de

replicación replica una longitud completa de ADN antes de pasar a la siguiente molécula.
Sin embargo, esta espectacular conclusión se aplica sólo a las longitudes relativamente
cortas de ADN que se prepararon para el análisis mediante los métodos disponibles en la
época del experimento de Meselson-Stahl (fig. 2.10). Si las moléculas hubieran sobrevivido
intactas, esas poblaciones celulares no sincronizadas habrían producido algo de ADN de
densidades flotantes intermedias, y esto habría oscurecido la imagen de Tesultant. La
inspección de la figura 2.7(b) aclara el punto.

PROPIEDADES DEL ADN

En el aislamiento del ADN, una dificultad importante es mantener físicamente intacta una
molécula tan larga y rígida. Se ha demostrado 10 “ 12 que las fuerzas de corte que se
producen cuando se agita vigorosamente una solución de ADN son suficientes para
romper la larga y rígida molécula de ADN. Las moléculas primero se rompen cerca de la
mitad, luego en cuartos, y así sucesivamente hasta alcanzar un tamaño lo suficientemente
pequeño como para que la molécula sea relativamente insensible a la rotura por corte.
Es difícil extrapolar el peso molecular del ADN encontrado en solución al peso
molecular real que existe in vivo debido a la gran facilidad de degradación por
cizallamiento durante la extracción o por la acción inadvertida de enzimas hidrolíticas.
Quizás las mejores estimaciones se deriven de trabajos radioautográficos en los que el
ADN está marcado con tritio. Por ejemplo, en £. coli, Cairns 1 pudo detectar moléculas de
ADN de hasta 1,1 mm de longitud. Esto corresponde a un peso molecular de 2,8 x 10 9 .
De manera similar, el ADN del bacteriófago T2 tiene una longitud promedio de 49 //, lo
que correspondería a un peso molecular de 10 8 . Un bacteriófago bastante más pequeño,
llamado A, tiene un ADN de 23 fj. en longitud. Pero incluso en las muestras de ADN
extraídas más cuidadosamente preparadas siempre hay entre un 0,1 y un 0,2 por ciento
de proteína adherida al material. Por lo tanto, existía la posibilidad de que una molécula
de ADN en realidad estuviera formada por longitudes más cortas de ADN unidas por
proteínas o materiales similares a péptidos (ver revisión en
Referencia 13). Sin embargo, la síntesis exitosa in vitro 14 mediante reacciones conocidas
de la forma replicativa circular bicatenaria del ADN rpX 174, capaz de infectar células
huésped, hace probable que tales moléculas de ADN estén compuestas únicamente de
nucleótidos.
Marmur publicó, por ejemplo, un método para aislar ADN casi libre de proteínas y ARN.
15 Las paredes de las células bacterianas se digieren con la enzima lisozima o se rompen

con un detergente. El perclorato de sodio se utiliza para disociar proteínas y ácidos

nucleicos, y la solución se desproteiniza agitándola con una mezcla de cloroformo y alcohol
isoamílico. El ARN se elimina con ribonucleasa o mediante centrifugación en un gradiente
de densidad de cloruro de cesio. En este gradiente, el ARN, que tiene una densidad mucho
mayor que el ADN, se sedimenta en el fondo del tubo de centrífuga. El ADN se puede
precipitar selectivamente con isopropilo. alcohol. El ataque de la desoxirribonucleasa se
puede minimizar si las operaciones se realizan en presencia de agentes quelantes o en
presencia de un detergente como el dodecilsulfato de sodio. Este procedimiento produce
ADN biológicamente activo, como por ejemplo el ADN transformante. Sin embargo, el ADN
obtenido es algo degradado por las fuerzas de corte desarrolladas durante el temblor.
Un procedimiento alternativo para aislar ADN altamente polimerizado de tejidos
animales es el método de extracción con fenol de Kirby, 16 en el que las proteínas se
desnaturalizan en la interfase fenol-agua y los ácidos nucleicos se extraen en la capa
acuosa. El ARN se eliminaría como se mencionó anteriormente y el ADN se precipitaría.
Para el examen en el microscopio electrónico*se pulverizan soluciones de ADN
sobre la rejilla y se secan rápidamente. El ADN nativo claramente produce moléculas
largas y rígidas en forma de varillas, mientras que las moléculas desnaturalizadas por
calor o de otro modo (en espiral aleatoria) forman "charcos".
Casi todos los ADN nativos en solución de una gran variedad de fuentes tienen la
estructura bicatenaria como lo muestra el cambio hipercrómico (ver más abajo) que ocurre
cuando se calienta una solución de ADN. Por otro lado, el ADN desnaturalizado es una
cadena de polielectrolitos flexible y ligeramente enrollada, cuyas propiedades
hidrodinámicas dependen mucho del entorno iónico. De hecho, el ADN desnaturalizado
en solución es bastante similar al ARN de alto peso molecular, que muestra cierta
estructura secundaria, pero de ninguna manera completa. Muy similares también son los
polirribonucleótidos sintéticos monocatenarios elaborados por la enzima polinucleótido -
fosforilasa. 17 Un ejemplo natural de ADN monocatenario enrollado aleatoriamente se
encuentra en el pequeño bacteriófago rpX 174.
En general, la estructura secundaria del ADN nativo depende de su contenido de las
bases guanina y citosina (G + C). Cuanto mayor sea el contenido de G 4-C, más fuertes
serán las fuerzas que mantienen unidas las dos cadenas. Esto es posible porque la
guanina y la citosina pueden formar tres enlaces de hidrógeno cuando se emparejan en
la estructura del ADN, mientras que la adenina y la timina sólo pueden formar dos (ver
figura 2.3).
El cambio hipercrómico es el aumento de la absorbencia que se observa cuando el
ADN bicatenario se desnaturaliza a la forma monocatenaria. En un caso análogo (Fig.
2.11), los dos polirribonucleótidos, el ácido poliadenílico y el ácido polvuridílico, cuando
se mezclan entre sí tienen una absorbencia menor a 260 m/t que la calculada para los
dos polímeros medidos por separado. Esto es así porque estos
 unapter U1MA

Fig. 2.11 Espectros de absorción de cantidades equimolares de ácido poliadenílico y ácido

polvuridílico. La curva superior se refiere a los mononucleótidos obtenidos por hidrólisis
alcalina.

Fig. 2.12 Aumento de la absorción de luz ultravioleta a 260 m// de ADN natural y sintético
tras la digestión con desoxirribonucleasa pancreática.
Los polirribonucleótidos pueden formar pares de bases A U.
Polir/eoxirribonucleótidos.
Se puede esperar que se comporte de manera similar. Otra forma de observar el
desplazamiento hipercrómico es destruyendo la estructura helicoidal bicatenaria
mediante la acción hidrolítica de una nucleasa (fig. 2.12).
A esto se suma el hipercromismo residual, que también está presente en los
polímeros monocatenarios medidos por separado y que sólo se manifiesta cuando el
polímero se descompone en mononucleótidos. Incluso los di y trinucleótidos muestran
hipercromismo residual. Probablemente se debe a una interacción entre bases vecinas
unidas entre sí como oligo o polinucleótidos (ver "apilamiento" en la página 9).
 La estructura nativa del ADN es estable en el rango de pH de 2,7 a 12 y la molécula
se desnaturaliza por debajo o por encima de estos valores de pH. La configuración del ADN
es inestable a temperatura ambiente con una fuerza iónica inferior a 1 0 ~ 4 M. Si la densidad
óptica a 260 mp se lee a 25 °C para el ADN T2 (consulte la curva a en la figura 2.1 3a), se
observará que no hay ningún cambio en la absorbencia cuando dicha solución se calienta
hasta alcanzar una temperatura de aproximadamente 75°C. Si se continúa calentando, la
densidad óptica de la solución de ADN aumenta aproximadamente un 35 por ciento en un
rango de quizás 4°C. Con el tiempo, la absorbencia se estabiliza en un valor característico
de la forma desnaturalizada de ADN. El ADN desnaturalizado puede detectarse mediante
examen al microscopio electrónico o por la gran disminución de la viscosidad de la solución
de ADN.
Para describir cuantitativamente el efecto hipercrómico, podemos definirlo en
términos de una temperatura Tm a la cual el proceso es -ha Si completo. El valor de
Tm es característico de una especie particular de ADN y depende, en una primera
aproximación, del contenido de G + C en ese ADN a un pH y fuerza iónica
específicos. De hecho, Marmur y Doty 18 han deducido una ecuación empírica,
T m = 69,3 + 0,41 (G + C),
donde G + C es el contenido de guanina más citosina como porcentaje molar del
contenido total de bases. El cambio en la absorbencia es característico y
sorprendentemente muy agudo en el ADN, lo que indica que la "fusión" de la estructura de
doble hélice del ADN es un fenómeno cooperativo. En otras palabras, tan pronto como
algunos pares de bases comienzan a separarse, inmediatamente se facilita
correspondientemente la fusión de los pares de bases vecinos. También se deduce que la
conformación original del ADN debe haber sido bastante perfecta y que la mayoría, si no
todas, las bases están en sus pares complementarios Watson-Crick.
Si la solución calentada se enfría rápidamente, se obtiene la curva b (en la
figura 2.13a), de la cual se ve que la densidad óptica no vuelve a su valor original, ni
siquiera a 25°C. De hecho, hay una disminución en la absorbencia, pero es mucho
menor que la disminución que se esperaría si las moléculas de ADN volvieran a su
conformación original de doble hélice altamente ordenada. Las preparaciones de ADN,
que se calentaron y enfriaron rápidamente, todavía se encuentran en forma
aleatoriamente enrollada a 25°C, como puede verse mediante el examen al microscopio
electrónico y la medición de su viscosidad relativa.
Si, por otro lado, la muestra de solución de ADN calentada se enfría extremadamente
lentamente, tardando quizás 3 horas en enfriarse de 91 °C a 48 °C, la absorbencia
de la
 o
ru

(a)

x M.Phlei

• Serratia B E. Co
1/ y Esperma de
salmón a Timo
de ternera o
Neumococo 0
Levadura
o Bacteriófago A
Poli (AT)

(b)
 o

Fig. 2.13 (a) El cambio hipercrómico al calentar el ADN nativo y el ADN enfriado rápida
o lentamente del bacteriófago T2. La muestra a no se calentó; la muestra b se calentó
durante 15 min a 91 °C y se enfrió rápidamente; La muestra c se trató como b, pero
luego se recalentó y enfrió lentamente (1 65 min de 91 °C a 48 °C). Las absorbancias
se midieron en muestras dializadas después de una dilución de 15 veces en tampón
Tris 0,021 M , pH 7,5, que contenía NaCl 0,02 M. (b) Relación del contenido de guanina
+ citosina con la temperatura de desnaturalización ( Tm ) para varios ADN en NaCl 0,1
5 M , citrato 0,01 5 M. [De J. Marmur y P. Doty, Nature, 183, 1427 (1959).]

El ADN vuelve casi a su valor original a 25°C; Esto equivale a decir que la estructura
de doble hélice con su exacto emparejamiento de bases ha sido restaurada en gran
medida, si no completamente. Curiosamente, Marmur, Doty y sus colegas 9 - 19 han
demostrado que, si este calentamiento y enfriamiento lento (este proceso de
"recocido") se lleva a cabo con ADN transformante biológicamente activo de D.
pneumonia, es posible recuperar una cantidad considerable, quizás el 70 por ciento,
de la actividad biológica original. Esta gran cantidad de reactivación de la capacidad
de transformación indica que la estructura exacta de doble hélice se reforma en estas
condiciones, al menos en algunas regiones de la molécula de ADN.
La temperatura óptima para la renaturalización del ADN bacteriano es
aproximadamente 25 ° por debajo de su Tm , a una concentración de Na + 0AM . La
concentración de ADN debe mantenerse baja (aproximadamente 6 µg/ml) para
minimizar la agregación. La renaturalización del ADN es un proceso notable,
considerando la gran longitud de las dos hebras individuales de ADN desnaturalizado
enrolladas aleatoriamente que tienen que encontrar su posición exacta para poder
reformar una doble hélice precisa. La renaturalización funciona mejor con las
moléculas de ADN de fagos más cortas y apenas funciona con el ADN muy largo de
organismos superiores. El ADN de E. coli ocupa una posición intermedia, dependiendo
del grado de fragmentación de la preparación de ADN. La facilidad de renaturalización
está relacionada con la probabilidad de que cualquier parte de una cadena de
nucleótidos monocatenaria encuentre su secuencia complementaria y se registre con
ella. Una vez logrado esto, el resto de las hebras se renaturalizan rápidamente. La
probabilidad de que se inicie esta renaturalización aumenta considerablemente si el
ADN se entrecruza químicamente antes de la desnaturalización o si las hebras
permanecen íntimamente entrelazadas después de la desnaturalización.

MECANISMO DE SÍNTESIS DEL ADN IN VITRO

Durante la replicación del ADN, la secuencia de nucleótidos de la molécula madre
debe reproducirse con precisión en las moléculas hijas, ya que de lo contrario la
información genética contenida en la secuencia se perdería o distorsionaría. Por lo
tanto, es probable que exista un sistema enzimático que pueda sintetizar -
polidesoxirribonucleótidos bicatenarios con emparejamiento de bases Watson-Crick,
pero que también utilice un ADN cebador y reproduzca la secuencia de nucleótidos
presente en ese ADN cebador. en general se cree que se produce una replicación
semiconservativa (véase antes); esto implica que los dos soportes de la imprimación