UD4 HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS PROFESOR: JOSE MANUEL NICOLAU

UD4 HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

INDICE
1. El concepto de hibridación y su aplicación en biología molecular
2. Bases teóricas de la hibridación
3. Tipos y características de las sondas
4. El marcaje de las sondas
5. Fases de la hibridación

1. EL CONCEPTO DE HIBRIDACIÓN Y SU APLICACIÓN EN BIOLOGÍA MOLECULAR

La hibridación es la construcción artificial de ácidos nucleicos bicatenarios, mediante la unión de dos
cadenas monocatenarias complementarias entre sí, pero que proceden de moléculas diferentes. Pueden
hibridar entre sí dos cadenas de ADN, dos cadenas de ARN o una cadena de ADN y otra de ARN.

La hibridación sirve para detectar secuencias de interés (secuencias diana) en el ADN o ARN problema
mediante sondas (fragmentos cuya secuencia de nucleótidos es complementaria a la secuencia diana).

Con la hibridación se forma una estructura bicatenaria híbrida (constituida por la sonda y la secuencia diana)
que será detectada gracias a un marcaje que lleva incorporada la sonda.

Fig. Esquema de una

hibridación con sonda, que
permite detectar una
secuencia de ADN
específica mediante el
empleo de una sonda
marcada.

Existen diferentes técnicas de hibridación que se diferencian por:

 El tipo de ácido nucleico que se pretende detectar.
 El tipo de sonda utilizada.
 El tipo de marcaje de la sonda.
 El medio o soporte (sólido, líquido o in situ) en el que se realiza la hibridación.

2. BASES TEÓRICAS DE LA HIBRIDACIÓN

2.1. Desnaturalización
Es la separación de las dos cadenas de una molécula bicatenaria, por ruptura de los puentes de hidrógeno
entre las bases nitrogenadas complementarias. Se consigue aumentando la temperatura. La
desnaturalización se representa en la curva de fusión (se mide la absorbancia a 260 nm de una solución de
una molécula bicatenaria de ADN en función de la temperatura obteniéndose una curva de tipo sigmoidea).

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Curva de fusión del ADN

Cadena simple

Fig. Curva de
fusión de una
molécula
bicatenaria de
ADN.

Doble cadena

El ADN monocatenario tiene una absorbancia mayor que el ADN bicatenario. En la curva se ven tres zonas:
 Zona A: la temperatura todavia no alcanza un valor suficiente para romper puentes de hidrógeno y, por
tanto, todo el ADN está en forma bicatenaria.
 Zona B: se produce la desnaturalización progresiva de la molécula de ADN a medida que aumenta la
temperatura y se observa un aumento de la absorbancia, hasta alcanzar un valor de absorbancia
máximo en el cual la desnaturalización es del 100%. El aumento de absorbancia a medida que la
molécula se desnaturaliza se conoce como efecto hipercrómico.
 Zona C: el ADN está completamente desnaturalizado. La absorbancia se mantiene en el valor máximo.

Temperatura de fusión (Tm ó Temperature melting)

Es la temperatura a la que se encuentran desnaturalizadas el 50% de las moléculas de ADN inicialmente
bicatenarias. Para moléculas pequeñas, la Tm aumenta con la longitud de la cadena. Para moléculas de
más de 500 pb, el factor más influyente es la proporción de pares GC (bases complementarias unidas por
tres puentes de hidrógeno). A mayor proporción de pares GC en una molécula, mayor número de puentes de
hidrógeno hay que romper para desnaturalizarla y, por tanto, mayor temperatura se deberá aplicar para
separar las dos cadenas. A mayor porcentaje de pares GC, mayor Tm.

2.2. Renaturalización
Es el proceso por el cual las dos cadenas de una molécula de ADN completamente separadas vuelven a
reasociarse, al bajar lentamente la temperatura, hasta formar la doble hélice original. Con la
renaturalización se produce una disminución de la absorbancia a 260 nm.

2.2.1. Cinética de renaturalización

En una solución que contiene ADN totalmente desnaturalizado, para que dos cadenas complementarias se
reasocien, tienen que encontrarse. A mayor concentración de la solución, mayor será la probabilidad de que
dos cadenas complementarias se encuentren y, por tanto, mayor será la velocidad de renaturalización.

Diferencia entre desnaturalización y renaturalización: en la desnaturalización influye la cantidad de pares

GC y NO la concentración. En la renaturalización influye la concentración y NO la cantidad de pares GC.

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2.2.2. Curva de renaturalización

Representa el % de ADN renaturalizado frente al logaritmo del tiempo. Es una curva sigmoidea en la que se
puede definir el valor de tiempo al cual la renaturalización es del 50% (t½).
Esta curva se comporta diferente manera en función de si el genoma es de un organismo procariota o
eucariota, es decir, en función de la complejidad del ADN.

 Curvas de renaturalización de genomas procariotas o virus

Los organismos procariotas o virus no tienen

secuencias repetidas en su genoma, por ello
la curva sólo tiene un punto de inflexión.

El tiempo de renaturalización es proporcional

a la complejidad de la molécula. A mayor
longitud de la molécula, mayor tiempo se
requiere para la renaturalización.

Fig. Ejemplos de curvas de renaturalización de virus y

bacterias. A mayor longitud del genoma, mayor tiempo
se requiere para la renaturalización.

 Curvas de renaturalización de genomas eucariotas

Los organismos eucariotas tienen genomas con secuencias repetidas y la curva de renaturalización es
escalonada, con varios puntos de inflexión.

Los genomas eucariotas contienen

tres tipos de secuencias:
 Secuencias altamente repetidas a
lo largo del genoma.
 Secuencias moderadamente
repetidas a lo largo del genoma.
 Secuencias únicas, que aparecen
solamente una vez a lo largo del
genoma.

Fig. Curva de renaturalización de un organismo eucariota, con forma escalonada, en la que se pone de manifiesto la distinta
velocidad de renaturalización de las secuencias altamente repetidas (A), las secuencias moderadamente repetidas (B) y las
secuencias únicas (C).

Para elaborar la curva de renaturalización de grandes moléculas y de genomas completos, el ADN se

fragmenta. En el tubo habrá un solo fragmento por cada secuencia única (o el mismo número de fragmentos
únicos que genomas completos hayamos puesto); habrán cientos de fragmentos para cada secuencia
moderadamente repetida y, habrán miles de fragmentos para cada secuencia altamente repetida. Por eso,

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en la curva de renaturalización de genomas eucariotas se observan tres componentes (la parte de la curva
correspondiente a cada componente tiene forma sigmoide):
 Componente rápido: corresponde a la renaturalización rápida de las secuencias altamente repetidas,
porque su concentración en la solución es mucho mayor que el de las demás secuencias.
 Componente intermedio: corresponde a la renaturalización un poco más lenta de las secuencias
moderadamente repetidas porque su concentración es menor que las altamente repetidas.
 Componente lento: corresponde a renaturalización de las secuencias únicas, cuya concentración es
muy baja y por lo tanto son las que más lentamente renaturalizan.

Las curvas de renaturalización permiten estimar la complejidad global del genoma, así como la proporción
relativa de cada tipo de secuencias (únicas y repetidas).

2.3. Hibridación
Las sondas suelen ser complementarias de regiones de ADN o de ARN de secuencia única. El híbrido
sonda/secuencia diana tiene las mismas propiedades que una molécula bicatenaria de ADN en cuanto a
desnaturalización y renaturalización, por lo que se puede obtener una curva de fusión de cualquier híbrido
(aumentando la temperatura al mismo tiempo que se mide la absorbancia a 260 nm).

Recordemos que la Tm depende de la proporción de pares GC. Sin embargo, otros factores también pueden
modificar la Tm de un híbrido.

2.3.1. Factores que pueden modificar la Tm de un híbrido

 La fuerza iónica de la solución.
 La presencia de agentes desnaturalizantes.
 El porcentaje de bases no complementarias en el híbrido o mismatch.

 Fuerza iónica de la solución

Los híbridos tienen carga negativa por los grupos fosfato. Los cationes de la solución rodean los híbridos,
neutralizando su carga negativa. Esto estabiliza la doble hélice ya que disminuye la repulsión entre las dos
cadenas cargadas negativamente de una misma
molécula. Por tanto, a mayor concentración de
cationes en la solución, más temperatura hay que
aportar para desnaturalizar el híbrido. La curva de
fusión se desplaza hacia la derecha cuando
aumenta la concentración de cationes en la
solución (la Tm aumenta).

 Agentes desnaturalizantes
Algunos agentes desnaturalizantes y solventes
orgánicos (como el dimetilsulfóxido (DMSO) y la
formamida) facilitan la ruptura de los puentes de
hidrógeno entre las bases complementarias. Desplazamiento de la curva de fusión de un híbrido por aumento de la
concentración de cationes monovalentes o de agentes desnaturalizantes
Si se añaden agentes desnaturalizantes, se requiere menos energía para desnaturalizar el híbrido, por lo
que la Tm disminuye y la curva de fusión se desplaza hacia la izquierda.

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 Porcentaje de bases no complementarias en el híbrido (mismatch)

Una sonda se unirá a su secuencia diana pero también a secuencias parecidas a la diana aunque tengan
algunas bases no complementarias. Es decir, se pueden formar híbridos imperfectos (con algunas bases
desapareadas) y, por tanto, con menos puentes de hidrógeno que los híbridos perfectos.

A mayor porcentaje de pares de bases no complementarias en el híbrido (mismatch), menor Tm.

La influencia del mismatch en la Tm del híbrido es mayor cuanto menor es la longitud de la sonda. Para
sondas de gran tamaño, la Tm del híbrido disminuye 1 ºC por cada 1% de mismatch, pero para sondas
pequeñas, una única base desapareada puede disminuir varios grados la Tm del híbrido. Por ello, se
emplean oligonucleótidos pequeños para detectar mutaciones puntuales por hibridación.

3. TIPOS Y CARACTERÍSTICAS DE LAS SONDAS

3.1. Características generales de las sondas
Las sondas pueden ser bicatenarias o monocatenarias y su tamaño puede oscilar entre pocos y miles de
nucleótidos. La elección de la sonda depende de la especificidad y sensibilidad que se pretenda conseguir:
 Especificidad: capacidad de una sonda para discriminar la secuencia diana con la que tiene que
hibridar. En general, el tamaño mínimo para que una sonda sea específica son 16 bases. Secuencias con
un menor número de bases tienen una gran probabilidad de estar repetidas aleatoriamente a lo largo
del genoma. Por ello, sondas menores a 16 bases hibridarían inespecíficamente con secuencias idénticas
repartidas al azar por todo el genoma.

 Sensibilidad: capacidad de detectar una mínima cantidad del híbrido sonda-diana. Está relacionada con
el número de moléculas marcadoras que admite la sonda.

Según su naturaleza, las sondas utilizadas en las técnicas de hibridación pueden ser:
 Sondas ADN.
 Sondas ARN.
 Sondas químicas sintéticas de ácidos nucleicos.

3.2. Sondas de ADN

Son las más utilizadas. Se pueden obtener a partir de síntesis química, a partir de ADN recombinante o a
partir de PCR.

3.2.1. Sondas de ADN obtenidas a partir de síntesis química

Se obtienen por un proceso automatizado, anclando el primer nucleótido de la secuencia a una fase sólida y
añadiendo nucleótido a nucleótido el resto de la secuencia mediante ciclos de reacciones químicas. Estas
sondas se caracterizan por:
 Ser monocatenarias.
 Tener un tamaño reducido.

Ventajas:
o Su reducido tamaño permite una mejor penetración en el tejido, lo cual es ventajoso en las técnicas
de hibridación in situ, sobre todo para detectar ARNm.

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Inconvenientes:
o Baja sensibilidad. El reducido tamaño limita el número de marcadores que pueden incorporar.
o Facilidad para hibridar inespecíficamente con secuencias parecidas a la diana (baja especificidad).

3.2.2. Sondas de ADN recombinante obtenidas por clonación

Se obtienen por un proceso de clonación y amplificación por cultivo, que se puede esquematizar:
1. El fragmento de ADN (que será la sonda) se inserta en un vector, normalmente un plásmido bacteriano.
2. El plásmido recombinante se introduce en una bacteria y se cultiva en un medio apropiado.
3. El plásmido ya amplificado se extrae y se emplea entero como sonda, o bien, el fragmento de interés se
separa del plásmido utilizando enzimas de restricción.

Estas sondas se caracterizan por:

 Ser bicatenarias. Por ello se requiere de una desnaturalización por calor como paso previo a la
hibridación con las secuencias diana.
 Tener un gran tamaño (cientos/miles de pares de bases). Pueden admitir un gran número de
moléculas marcadoras y, por tanto, tienen mayor sensibilidad.
 Una gran especificidad, por su gran tamaño.

3.2.3. Sondas de ADN obtenidas por PCR

Se amplifica mediante PCR el fragmento a utilizar como sonda. Se deben conocer las secuencias que
flanquean el fragmento que será la sonda para diseñar primers que se unan en las regiones adyacentes. Las
sondas obtenidas por PCR se caracterizan por:
 Ser bicatenarias.
 Tener un tamaño intermedio (cientos de bases).

3.3. Sondas de ARN o ribosondas

 Ventaja: los híbridos ADN/ARN son ligeramente más estables que los híbridos ADN/ADN.
 Inconveniente: son muy sensibles a la contaminación, dada la omnipresencia de las ARNasas que las
degradan rápidamente.
Las sondas de ARN son monocatenarias y se obtienen a partir de síntesis química o a partir de transcripción.

3.3.1. Sondas de ARN obtenidas a partir de síntesis química

Se obtienen de la misma manera que las sondas de ADN obtenidas por síntesis química.

3.3.2. Sondas de ARN obtenidas a partir de transcripción

A partir de un vector que contiene el fragmento de interés o a partir de un fragmento de ADN se realiza la
transcripción mediante una ARN polimerasa.

3.4. Sondas químicas sintéticas de ácidos nucleicos

Son las sondas de ácidos nucleicos peptídicos o las sondas de ácidos nucleicos bloqueados.

3.4.1. Sondas de ácidos nucleicos peptídicos o PNA (peptide nucleic acid)

Son oligómeros sintéticos en los que el esqueleto de azúcar-fosfato del ADN y ARN se sustituye por un
esqueleto de unidades de aminoetil-glicina. A cada residuo de aminoetil-glicina se le acopla una base
nitrogenada. Las sondas PNA se utilizan principalmente en técnicas de hibridación in situ.

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Fig. (a) Unidad de aminoetil-glicina. (b) Unidad de aminoetil-glicina con una base nitrogenada acoplada a través de un radical acetilo.
(c) Apareamiento de una cadena de PNA y otra de ADN mediante puentes de hidrógeno entre bases nitrogenadas complementarias.

Las sondas PNA hibridan con cadenas de ADN y ARN mediante puentes de hidrógeno entre las bases
complementarias. Presentan dos características que las diferencian de las sondas ADN y ARN:
 No tienen carga eléctrica, al carecer de grupos fosfato.
 No son degradadas por nucleasas, lo que les confiere gran estabilidad.

Ventajas:
 Los híbridos PNA/ADN o PNA/ARN son más estables (tienen una Tm más elevada) que los ADN/ADN o
ARN/ARN. Al no tener carga eléctrica, no existe repulsión entre cadenas complementarias.
 La fuerza iónica del medio no influye en la estabilidad de los híbridos con sondas PNA, al no tener carga.
 Son muy específicas.
 Hibridan más rápidamente que las sondas de ADN o ARN.

Inconvenientes:
 Su solubilidad es mucho menor que las sondas de ADN o ARN y disminuye drásticamente con la
longitud. Por ello, su tamaño no suele sobrepasar las 30 bases.

3.4.2. Sondas de ácidos nucleicos bloqueados o LNA (del inglés locked nucleic acid)
Son oligómeros sintéticos de ribonucleótidos donde se han modificado químicamente algunas de las ribosas
del esqueleto azúcar-fosfato.

Las sondas LNA tienen mayor sensibilidad y especificidad que las sondas de ARN sin modificar. Al igual que
las sondas PNA, son de pequeño tamaño y se usan principalmente en técnicas de hibridación in situ.

4. EL MARCAJE DE LAS SONDAS

Las sondas deben estar marcadas para poder detectar el híbrido sonda-secuencia diana. El procedimiento
para marcar las sondas depende del tipo de marcador.

4.1. Tipos de marcadores

 Marcadores que posibilitan la detección directa del híbrido.
o Isótopos radiactivos.
o Fluorocromos.
 Marcadores que requieren de métodos indirectos de revelado en varios pasos.
o Haptenos (digoxigenina y biotina).

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4.1.1. Isótopos radiactivos

La sonda se marca introduciéndole nucleótidos que contienen isótopos radiactivos. Se utilizan
principalmente en técnicas de hibridación en filtro, como Southern blot, Northern blot y dot blot.

El híbrido se detecta revelando el marcaje radiactivo mediante autorradiografía. Este tipo de sondas
requieren instalaciones adecuadas para trabajar con material radiactivo y personal entrenado.

4.2.2. Fluorocromos
Los fluorocromos son compuestos químicos (fluoresceína, rodamina, cianinas (Cy3, Cy5, Cy7), la familia
Alexa-flúor...) que emiten luz al ser excitados con luz ultravioleta. Para detectar el híbrido marcado con
fluorocromos se requiere un microscopio de fluorescencia.

Las sondas marcadas con fluorocromos se utilizan mucho en la técnica FISH (hibridación in situ
fluorescente). Emplear a la vez varias sondas marcadas, cada una con un fluorocromo diferente, permite
detectar simultáneamente varias secuencias diana diferentes. Esto es muy útil en estudios de citogenética.

4.2.3. Haptenos
Los haptenos más utilizados son la digoxigenina y la biotina. Son moléculas que se pueden acoplar a los
nucleótidos pero no pueden ser detectadas directamente. Para la detección del híbrido se requiere de
métodos indirectos de revelado basados en la afinidad química de moléculas o en métodos inmunológicos.

Este tipo de sondas se pueden usar en todas las técnicas de hibridación.

4.2. Métodos de marcaje

Los métodos de marcaje más habituales son:
 Desplazamiento de mella (nick translation).
 Cebado al azar o cebado aleatorio (random priming).
 Marcaje terminal.
 Marcaje por PCR.
 Marcaje de sondas de ARN.

4.2.1. Desplazamiento de mella (nick translation)

Se utiliza para marcar sondas de ADN bicatenario de
gran tamaño (obtenidas normalmente por tecnología
de ADN recombinante) o para marcar genomas enteros.

Se incuba la sonda con ADNasa I, ADN polimerasa I y los

cuatro dNTPs, de los cuales, uno de ellos (o varios)
estará marcado con un isótopo radiactivo o bien con un
hapteno. ¿fluorocromo no?

Durante la incubación, tienen lugar los siguientes

procesos:
1. La ADNasa I a bajas concentraciones y en presencia de cationes magnesio rompe enlaces fosfodiéster
(produce mellas) al azar entre dos nucleótidos consecutivos en las cadenas de la sonda.

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2. La ADN polimerasa I intenta reparar las mellas. Con su actividad exonucleasa 5’-3’ va eliminando
nucleótidos, uno a uno, desde la mella hacia el extremo 3’ de la cadena. Simultáneamente, gracias a su
actividad polimerasa 5’-3’, va incorporando desoxirribonucleótidos en el extremo 3’-OH libre de la mella,
sintetizando ADN complementario a la otra hebra. Los nucleótidos que incorpora la ADN polimerasa I los
toma del medio de reacción, y uno o varios de ellos estarán marcados (en la figura es el dGTP).

4.2.2. Cebado al azar o cebado aleatorio (random priming)

También se utiliza para marcar sondas de ADN bicatenario de gran tamaño o genomas completos mediante
isótopos radiactivos o haptenos. En este caso, la sonda se incuba con los siguientes reactivos:
 Una mezcla de todos los oligonucleótidos posibles de 6 bases (hexámeros).
 Fragmento Klenow de la ADN polimerasa I. Este fragmento tiene actividad polimerasa 5’-3’ y actividad
exonucleasa 3’-5´.
 Mezcla de dNTPs, uno de ellos marcado.

El marcaje se produce en varias fases:

1. Desnaturalización de la sonda.

2. Hibridación al azar de los hexámeros por

complementariedad de bases en múltiples
zonas de las cadenas de la sonda.

3. Los hexámeros unidos a la sonda actúan

como cebadores para que la ADN
polimerasa I (fragmento Klenow) sintetice
cadenas de ADN complementarias a la
cadena molde, incorporando los dNTPs
que hay en el medio de reacción, uno de
los cuales está marcado.

Variando la proporción de dNTPs marcados en la mezcla, se puede controlar la densidad del marcaje en la
sonda.

4.2.3. Marcaje terminal

En el marcaje terminal se emplea la enzima desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT), que es una ADN
polimerasa capaz de incorporar desoxinucleótidos al extremo 3’-OH libre de una molécula de ADN (tanto
bicatenaria como monocatenaria) sin necesidad de una cadena molde. Esta enzima es capaz de incorporar
nucleótidos marcados tanto radiactivamente, como con fluorocromos o haptenos.

Hay dos posibilidades de marcaje:

 Marcaje único en el extremo 3’. Se emplea en sondas pequeñas (oligonucleótidos). Consiste en
incorporar un didesoxinucleótido marcado (normalmente con un fluorocromo) en el extremo 3’ de la
sonda. Este didesoxinucleótido marcado debe estar en la mezcla de reacción. Los didesoxinucleótidos no
tienen un –OH libre en el carbono 3’ y, por tanto, cuando se incorporan a una cadena de ADN se detiene
la síntesis, ya que no se puede formar un nuevo enlace fosfodiéster.

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 Incorporación de una cola de nucleótidos

marcados. La sonda se marca añadiendo una cola
de longitud variable de nucleótidos marcados. En
la mezcla de reacción debe haber una proporción
adecuada de desoxinucleótido marcado y de
didesoxinucleótido la cual controlará la longitud
de la cola. Por ejemplo, si la proporción es de 1 didesoxinucleótido por cada 9 desoxinucleótidos
marcados, la mayoria de las sondas incorporarán colas de alrededor de 10 nucleótidos.

4.2.4. Marcaje por PCR

En el mismo proceso de obtención de las sondas por PCR, en la mezcla de reacción se utilizan
desoxinucleótidos marcados bien radiactivamente o bien con haptenos.

4.2.5. Marcaje de sondas de ARN

El marcaje se realiza en el mismo proceso de obtención de la sonda ARN mediante transcripción con una
ARN polimerasa, añadiendo ribonucleótidos marcados a la mezcla de reacción.

4.3. Purificación de la sonda marcada

Una vez marcada la sonda, conviene eliminar el exceso de nucleótidos libres marcados que han quedado en
el medio de reacción para evitar ruido de fondo o interferencias en el resultado de la técnica de hibridación.

El método más usado para la purificación de las sondas es la cromatografía de exclusión por tamaño. Para
ello, se utilizan geles (por ejemplo, de poliacrilamida) empaquetados en microcolumnas que se acoplan a
tubos colectores tipo eppendorf. La mezcla de reacción se carga en la columna y se centrifuga para separar
la sonda marcada (que queda retenida en la columna) de los nucleótidos libres.

5. FASES DE LA HIBRIDACIÓN
Todas las técnicas de hibridación se pueden dividir en cuatro fases:
I. Preparación de la muestra y del soporte (prehibridación).
II. Hibridación.
III. Lavado de poshibridación.
IV. Detección del híbrido.

5.1. Fase de preparación de la muestra y soporte (prehibridación)

Según la técnica, se puede desarrollar en múltiples pasos, que incluyen digestiones enzimáticas,
electroforesis, transferencias, bloqueos de uniones inespecíficas, etc. Los distintos pretratamientos los
desarrollaremos en la unidad didáctica siguiente.

5.2. Fase de hibridación

En esta fase se produce la formación del híbrido sonda/secuencia diana. Es importante tener en cuenta:
 La hibridación se suele realizar a temperaturas estándar prefijadas: normalmente 37 ºC, 42 ºC o 65
ºC, dependiendo de las técnicas.
 Realizar la hibridación en condiciones que faciliten la formación y la estabilidad del híbrido. Son:
o Alta concentración de cationes.
o Baja concentración de formamida.

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Cuando se utilizan sondas de gran tamaño, además de híbridos perfectos se van a formar híbridos
imperfectos con secuencias parecidas a la secuencia diana (con un mismatch inferior al 15%).

El tiempo de incubación de la sonda con la muestra para asegurar una buena hibridación dependerá de la
concentración de la sonda. Según la técnica, puede oscilar entre 30 minutos y 24 horas.

5.3. Lavado de posthibridación

Sirve para mantener los híbridos sonda/secuencia diana y eliminar los híbridos imperfectos con secuencias
parecidas a la diana. De esta fase depende en gran medida la especificidad de la técnica.

En el lavado posthibridación se deben establecer las llamadas condiciones de rigurosidad combinando

temperatura de lavado, fuerza iónica y concentración de formamida. A mayor rigurosidad del lavado,
mayor especificidad. Lo habitual es fijar condiciones de elevada rigurosidad para que se mantengan estables
solo los híbridos con ningún o muy poco porcentaje de mismatch. Esto se consigue:
 Elevando la temperatura del lavado.
 Usando un tampón con baja concentración salina y alta concentración de formamida.

Pero en ocasiones interesa mantener cierto grado de mismatch. En este caso, el lavado de posthibridación se
realiza en condiciones de rigurosidad relajadas:
 Disminuyendo la temperatura del lavado.
 Alta concentración salina.
 Baja concentración de formamida.

5.4. Fase de detección del híbrido

Consiste en detectar los híbridos gracias al marcaje de la sonda. Según sea el tipo de marcador utilizado
(radiactivo, fluorocromo o hapteno) variará el método de detección:
 Marcaje radiactivo. Normalmente se emplea en técnicas de hibridación sobre soporte. La detección se
realiza mediante autorradiografía, colocando una placa de rayos X sobre el soporte para que la emisión
radiactiva del marcador la impresione. Tras el revelado de la placa, la positividad de la hibridación se
observa como marcas (puntos, manchas o bandas) oscuras.
 Fluorocromos. Normalmente se emplean en técnicas de hibridación in situ. Las preparaciones se llevan
al microscopio de fluorescencia donde, al ser excitadas con una longitud de onda adecuada, se produce
la emisión fluorescente del marcador que permite la visualización.
 Haptenos. Se usan en todo tipo de técnicas. La detección se realiza con un anticuerpo antihapteno
marcado con un fluorocromo (visualización con microscopio de fluorescencia) o marcado con una
enzima, que cataliza una reacción en la que se produce un producto coloreado (visualización con
microscopio óptico convencional). Si el hapteno utilizado como marcador es la biotina, en la detección se
puede sustituir el anticuerpo por estreptavidina marcada.

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