REACCION EN CADENA DE POLIMERASA

Técnica de biología molecular que busca la amplificación in vitro de secuencias específicas de ADN. Fue descubierta
en 1985 por Karry Mullis en el laboratorio de Cetus Corporation, California, USA, lo que le representó el premio
Nobel en 1993.

CICLO DE LA PCR
Se parte con un fragmento de doble cadena de ADN de la muestra. Se añade

 Tap Polimerasa:
 Cebadores:
 Nucleótidos:
 Cationes Divalentes Mg++ y Sodio+:
 Buffer: para mantener el pH.
 ADN molde:
1. DESNATURALIZACION
Por medio de la aplicación de calor de 90°C – 11O°C, se produce la separación de las dos cadenas de la molécula
de ADN que se quiere amplificar. Al romperse los enlaces de hidrógeno, cada cadena actúa como molde para
fabricar su complementaria.

2. HIBRIDACION O RENATURALIZACION CON CEBADORES

Se entiende por hibridación a la construcción artificial de ácidos nucleicos bicatenarios a partir de dos
monocatenarios usando la complementariedad de bases. La temperatura se disminuye rápidamente
de 55°C - 65°C, para lograr que los cebadores o primers “reconozcan” sus secuencias complementarias
en las cadenas de ADN correspondientes y se unan con ellas. Es la recuperación del estado de las dos
hebras de ADN.

Factores que afectan el proceso de Hibridación

 Porcentaje de pares G-C vs pares A-T
 Grado de complementariedad entre hebras
 Largo de las hebras de polinucleótidos
 Concentración de sal en la solución de hibridación
 Temperatura de reacción
Astringencia: se refiere a la calidad o
rigurosidad en la unión de las cadenas
de ácidos nucleicos en el proceso de
hibridación. Cualquier hibridación en la
que la complementariedad sea inferior al
70% se considerará como no-homóloga
y, por tanto, ocurre en condiciones de
baja astringencia (temperatura baja y
concentración alta de sales).

3. EXTENSIÓN O AMPLIFICACION CON TAQ POLIMERASA

Para esta etapa, la temperatura se eleva a 72° C, con lo que la taq polimerasa agrega los diferentes
nucleótidos complementarios siguiendo el orden de la cadena que sirve de molde.

Los múltiples ciclos

generan un incremento
exponencial en el número
de copias de ADN. En cada
ciclo se obtienen 4 copias.

1. CORTE CON ENZIMAS DE RESTRICCION

La electroforesis en gel es una técnica utilizada para separar fragmentos de ADN según su tamaño.
Las muestras de ADN se cargan en pozos (ranuras) en un extremo de un gel y se aplica una corriente
eléctrica para arrastrarlas a través del gel.
Los fragmentos de ADN tienen carga negativa, por lo que se mueven hacia el electrodo positivo.
Puesto que todos los fragmentos de ADN tienen la misma cantidad de carga por masa, los fragmentos
pequeños atraviesan el gel más rápido que los grandes.

El Sorthem Blot para ADN

El Northem Blot para ARN no se usan enzimas de restricción porque el mas lábil

PCR en Tiempo Real (CUANTITATIVA)

Los procesos de amplificación y detección se producen de manera simultánea. Además, mediante
detección por fluorescencia se puede medir durante la amplificación la cantidad de ADN sintetizado
en cada momento, ya que la emisión de fluorescencia producida en la reacción es proporcional a la
cantidad de ADN formado.
Para la detección se hace uso de
AGENTES INTERCALANTES
Sybr Green se une al surco menos de la cadena de ADN emitiendo fluorescencia.
SONDAS DE HIBRIDACION
Quencher o Donante 3´(Q) cuando está cerca del fluoroforo o Receptor 5’ (R), este capta la energía de
R, por eso el detector del equipo no lo capta. La Polimerasa tiene actividad endonucleasa, por lo que
degrada la sonda, haciendo separar Q y R, liberándose asi la energía y emite la fluorescencia.
SONDAS HIDROLISIS
Sondas Taq man
Molecular Beacons forma de horquilla con mayor sensibilidad
se basa en la detección y cuantificación de un reportero fluorescente. Puede monitorearse la reacción
de PCR en la fase exponencial.

Las reacciones se caracterizan por el punto en el tiempo (ciclo de PCR) donde la amplificación es
detectada por primera vez: Ct o Cp. El Ct es el tiempo al cual la intensidad de fluorescencia es mayor
que la fluorescencia de fondo (umbral de detección = threshold).
A diferencia de la PCR de punto final (PCR convencional), la PCR en tiempo real permite cuantificar el
nivel de producto obtenido en cualquier momento de la amplificación mediante la señal de
fluorescencia 

50µg/mL de ADN de doble hebra

40µg/mL de ARN
33µg/mL de cebadores

Tengo una absorvancia de 0,8 nm en 50 ul, cuanto ADN tengo.

1 nm ---------------------- 50 ug/ml
0.8 nm -------------------------x
Concentration: 0,8 nm x 50 ug/ml = 40 ug/ml

Cuantos microgramos ug de ADN existen en 50 ul

40 ug -----------------1000 ul
x-------------------------50 ul
x= 40 ug x 50 ul/ 1000 ul = 2 ug Masa

C= M/V
C= 40 ug/1 mL = 40 ug/mL