BIOLOGÍA MOLECULAR

Y CITOGENÉTICA
UNIDAD DIDÁCTICA 4
Hibridación de Ácidos Nucléicos
Daniel Brell Martín
Ldo. Biología y Bioquímica
Ciclo Formativo de Grado Superior en Anatomía Patológica y Citodiagnóstico
EL CONCEPTO DE HIBRIDACIÓN Y SU APLICACIÓN
EN BIOLOGÍA MOLECULAR
 INTRODUCCIÓN
 Hibridación → unión de dos moléculas monocatenarias de ácidos nucleicos por complementaridad
de bases dando lugar a una molécula híbrida bicatenaria.
 Permite la construcción artificial de ácidos nucleicos bicatenarios del tipo:
 ADN – ADN.
 ARN – ARN.
 ADN – ARN.
 En Biología Molecular, se utiliza para detectar secuencias concretas de ácidos nucleicos en base de
ADN o ARN (secuencias diana) mediante el empleo de sondas o fragmentos complementarios con los
que se marcan para poder visualizarlos posteriormente.
EL CONCEPTO DE HIBRIDACIÓN Y SU APLICACIÓN
EN BIOLOGÍA MOLECULAR
 INTRODUCCIÓN
 Secuencia diana → secuencia concreta de bases nitrogenadas que se pretende detectar en un estudio
molecular concreto.
 Sonda → cadena de nucleótidos cuya secuencia de bases nitrogenadas es complementaria a la secuencia
diana.
 Técnicas de hibridación → metodología de laboratorio consistente en la creación de sondas artificiales y
complementarias a un ácido nucleico o secuencia diana que se desea marcar.
Existen distintas técnicas de hibridación en función de:
 El tipo de ácido nucleico que se pretende detectar.
 El tipo de sonda que se va a utilizar.
 El tipo de marcaje de la sonda.
 El medio o soporte en el que se realiza la hibridación.
 BASES TEÓRICAS DE LA HIBRIDACIÓN
 Fundamento → la hibridación sonda – secuncia diana se basa en los fenómenos de desnaturalización /
renaturalización de las moléculas bicatenarias de ADN.
 DESNATURALIZACIÓN
 Es una de las propiedades del ADN consistente en la separación de las dos cadenas que conforman la
molécula bicatenaria por ruptura de los puentes de H entre las bases nitrogenadas complementarias.
 Tiene lugar cuando la tª o el pH aumentan.
 Curva de fusión del ADN → permite la representación del fenómeno de desnaturalización de la
molécula bicatenaria en solución a través de su absorbancia a 260 nm y en
función de la tª. Se distinguen 3 zonas en la curva de fusión del ADN:
 Primera zona (A): tramo recto sin pendiente, con valor cte. aunque se eleve la tª. Corresponde al valor basal de
absorbancia de la molécula bicatenaria y depende únicamente de la [ADN] en solución. Se caracteriza por
presentar un porcentaje de desnaturalización del 0%.
 Segunda zona (B): aumenta la absorbancia a medida que aumenta la tª, en forma de curva sigmoidea, hasta
alcanzar un valor de absorbancia máximo con una desnaturalización del 100%.
 Efecto hipercrómico → fenómeno por el cual aumenta la absorbancia del ADN a medida que éste se desnaturaliza.
 Tercera zona (C): recta de pendiente prácticamente nula, con una absrobancia máxima cte aunque la tª aumente,
y en la que el ADN se mantiene desnaturalizado al 100%
BASES TEÓRICAS DE LA HIBRIDACIÓN

Curva de fusión de una molécula bicatenaria de ADN.

 BASES TEÓRICAS DE LA HIBRIDACIÓN
 DESNATURALIZACIÓN
 Temperatura de fusión (Tm) → aquel valor de tª al cual la absorbancia es la mitad entre el valor
basal y el valor máximo y se caracteriza por presentar un 50%
de desnaturalización del ADN en la curva de fusión.
 Para moléculas pequeñas → Tm aumenta con la longitud.
 Para moléculas con más de 500pb
% pb pirimidínicas unidas (G-C).
 A mayor % de pb GC mayor será Tm.
 La Tm de cualquier molécula estará comprendida entre:
Tm poli-AT (0% pb GC) / Tm poli-GC (100% pb GC)
 La curva de fusión de cualquier molécula de ADN estará
comprendida entre: Cf poli-AT / Cf poli-GC
Gráfica que relaciona la Tm de moléculas de ADN de gran
tamaño con el contenido en pares GC.
 BASES TEÓRICAS DE LA HIBRIDACIÓN

Comparación de las curvas

de fusión de una molécula
de ADN poli-AT y una
molécula poli-GC.
 BASES TEÓRICAS DE LA HIBRIDACIÓN
 RENATURALIZACIÓN
 Es otra de las propiedades del ADN consistente en la reasociación de las dos cadenas previamente
separadas al disminuir progresivamente la tª hasta dar lugar a la doble hélice original.
 Puede medirse por la disminución de A260 nm.
 La renaturalización es un proceso más complejo que sigue una cinética distinta.
 Cinética de renaturalización
 Debe producirse un choque aleatorio entre las dos cadenas en solución que pretenden reasociarse.
 Cuanto mayor sea la [ ADNmc], mayor será la probabilidad de que dos cadenas complementarias se
encuentren, aumentando por tanto la velocidad de renaturalización.
 1ª Diferencia entre Desnaturalización vs Renaturalización: % pb GC vs [ADNmc].
 Una vez que las dos cadenas complementarias de una molécula se encuentran, la reasociación se produce en dos
fases:
 1. Primera fase o fase de nucleación → fase lenta en la que secuencias cortas de bases complementarias se
aparean por formación de puentes H-H.
 2. Segunda fase o fase de «cierre en cremallera» → fase rápida en la que se produce el cierre de las
secuencias vecinas originando la doble hélice.
 BASES TEÓRICAS DE LA HIBRIDACIÓN
 RENATURALIZACIÓN
 Cinética de renaturalización
 La velocidad de la renaturalización viene marcada por la fase de nucleación y puede definirse con la
siguiente fórmula:

 Donde:
 C = concentración de ADN monocatenario en un tiempo t determinado.
 C0 = concentración inicial a t=0.
 k = constante de reasociación.
 BASES TEÓRICAS DE LA HIBRIDACIÓN
 RENATURALIZACIÓN
 Curvas de renaturalización (Curva Cot) → se obtienen al representar el porcentaje de ADN
renaturalizado frente al logaritmo de C0t.
 El comportamiento de la curva estará determinado por la complejidad del ADN (Procariota Vs Eucariota).

Curvas de renaturalización de genomas procariotas

➢ La curva de renaturalización se representa como
una función sigmoide.

➢ Existe un valor C0t1/2 (50% ADN renaturalizado)

que aumenta a mayor complejidad del ADN.

➢ 2ª Diferencia entre Desnaturalización vs

Renaturalización:
V. renaturalización (C0t1/2) / complejidad

Ejemplos de curvas de renaturalización de virus y bacterias, en

las que se pone de manifiesto que a mayor complejidad (mayor
longitud) del genoma, menor velocidad de renaturalización.
 BASES TEÓRICAS DE LA HIBRIDACIÓN
 RENATURALIZACIÓN
 Cinética de renaturalización
 Curvas de renaturalización de genomas eucariotas
 La curva de renaturalización no es sigmoide, sino escalonada, con varios puntos de inflexión.
Es preciso puntualizar algunos
aspectos de la curva
➢ Los genomas eucariotas contiene 3 tipos
de secuencias:
➢ Secuencias altamente repetidas
(↓ C0t1/2).
➢ Secuencias moderadamente
repetidas ( C0t1/2 intermedia).
➢ Secuencias únicas (↑ C0t1/2).

Curva de renaturalización de un organismo eucariota, con forma escalonada, en la que se

pone de manifiesto la distinta velocidad de renaturalización de las distintas secuencias
 BASES TEÓRICAS DE LA HIBRIDACIÓN
 HIBRIDACIÓN
 El hibrido sonda – secuencia diana formado tiene las mismas propiedades fisicoquímicas respecto a su
desnaturalización / renaturalización que una molécula bicatenaria de ADN.
 Las sondas suelen reconocer regiones de ADN o ARN de secuencia única → ↑ C0t1/2.
 La curva de fusión de un híbrido se corresponde con una función sigmoide en la que Tm dependerá
de la proporción de pb G-C.
 Factores que influyen en la hibridación
 Fuerza iónica de la solución → cuanto mayor es la [cationes monovalentes] en la solución más calor
(E) hay que aportar para desnaturalizar el híbrido.
 Presencia de agentes desnaturalizantes → favorecen la ruptura de los puentes de H-H
intracatenarios y, por tanto, se requiere menos calor (E)
para desnaturalizar el híbrido (Ej: DMSO, formamida…)
 Porcentaje de bases no complementarias → híbridos imperfectos formados contienen menos
puentes de H-H (mismatch), por lo que a mayor
mismatch menor será Tm en la curva de fusión.
 BASES TEÓRICAS DE LA HIBRIDACIÓN

Desplazamiento de la curva de
fusión de un híbrido por aumento de
la concentración de cationes
monovalentes o de agentes
desnaturalizantes en el medio en que
está disuelto.
 TIPOS Y CARACTERÍSTICAS DE LAS SONDAS
 CARACTERÍSTICAS
 Pueden ser monocatenarias o bicatenarias, con un tamaño variable (desde 50 pb a +1000 pb).
 La elección de las sondas se llevará a cabo en función de la especificidad y sensibilidad que se pretenda
conseguir en relación al ensayo realizado.
 Especificidad → capacidad de la sonda para discriminar la secuencia diana con la que debe hibridar.
Tamaño mínimo de la sonda para ser específica → 16 pb.
 Sensibilidad → probabilidad de detectar cantidades mínimas de secuencia sonda hibridada con secuencia
diana
Está en relación con el nº de moléculas marcadoras que admite la sonda.

 Según su naturaleza distinguimos las siguientes sondas:

 Sondas ADN.
 Sondas ARN.
 Sondas químicas sintéticas de ácidos nucleicos.
 TIPOS Y CARACTERÍSTICAS DE LAS SONDAS
 SONDAS DE ADN
 Constituyen las sondas más utilizadas en el campo de la BM debido a:
 Disponibles en grandes cantidades y de fácil obtención.
 Versatilidad en cuanto a tamaño y método de marcaje.
 Según el proceso de obtención llevado a cabo distinguimos entre:
 Sondas de ADN de síntesis química
 Obtenidas por condensación química secuencial de desoxinucleótidos concretos para obtener una secuencia
completa.
 Ventajas:
 Al ser monocatenarias no requieren desnaturalización por calor durante el proceso de hibridación.
 Su tamaño reducido (< 200 nucleótidos) facilita su incorporación en el tejido (especialmente, en
técnicas de hibridación in situ).
 Inconvenientes:
 Presentan baja sensibilidad (su tamaño limita el n.º de moléculas marcadoras que pueden incorporar).
 Gran facilidad para hibridar inespecíficamente.
 TIPOS Y CARACTERÍSTICAS DE LAS SONDAS
 SONDAS DE ADN
 Sondas de ADN recombinante
 Obtenidas a través de un proceso de clonación y amplificación por cultivo.
 Ventajas:
 Gran sensibilidad (admiten un mayor n.º de moléculas marcadoras).
 Alta especificidad (elevada probabilidad de hibridar con la secuencia diana).
 Inconvenientes:
 Al ser bicatenarias, requieren una desnaturalización por calor previa a la hibridación con la secuencia
diana.
 Sondas de ADN PCR
 Requiere la amplificación del fragmento sonda mediante PCR y, por tanto, conocer las secuencias que lo flanquean.
 Ventajas:
 Tamaño intermedio (admiten un mayor rango de moléculas marcadoras y tienen buena especificidad).
 Inconvenientes:
 Son bicatenarias (requieren una desnaturalización por calor previa a la hibridación con la secuencia diana).
 TIPOS Y CARACTERÍSTICAS DE LAS SONDAS
 SONDAS DE ARN (ribosondas)
 Son menos utilizadas en el campo de la BM.
 Ventajas:
 Siempre son monocatenarias (no requieren desnaturalización previa).
 Los híbridos ADN/ARN son ligeramente más estables que los híbridos ADN/ADN.
 Inconvenientes:
 Son sensibles a cualquier contaminación (especialmente, a la degradación por ARNasas).
 Según el proceso de obtención llevado a cabo distinguimos entre:
 TIPOS Y CARACTERÍSTICAS DE LAS SONDAS
 SONDAS DE ARN (ribosondas)
 Sondas de ARN de síntesis química
 Obtenidas por condensación química secuencial de ribonucleótidos concretos para obtener una secuencia
completa.
 Ventajas:
 Al ser monocatenarias no requieren desnaturalización por calor durante el proceso de hibridación.
 Su tamaño reducido (< 200 nucleótidos) facilita su incorporación en el tejido (especialmente, en técnicas de
hibridación in situ).
 Inconvenientes:
 Presentan baja sensibilidad (su tamaño limita el n.º de moléculas marcadoras que pueden incorporar).
 Gran facilidad para hibridar inespecíficamente.

 Sondas de ARN por Transcripción

 Obtenidas por transcripción de un vector que contiene el fragmento de interés o un ADNc mediante una
ARN polimerasa.
 Ventajas:
 Al ser monocatenarias no requieren desnaturalización por calor durante el proceso de hibridación.
 Tamaño intermedio (buena especificidad y capacidad de incorporación de moléculas marcadoras).
 TIPOS Y CARACTERÍSTICAS DE LAS SONDAS
 SONDAS QUÍMICAS SINTÉTICAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS
 Aunque las sondas utilizadas en Biología Molecular suelen ser de ADN o ARN, actualmente se
pueden encontrar modificaciones químicas de ácidos nucleicos que actúan como sondas en
determinados ensayos, tales como:
 Sondas de ácidos nucleicos peptídicos (PNA) → oligómeros sintéticos cuyo esqueleto químico
está compuesto por unidades de aminoetil-glicina unidas entre sí por enlaces amida, acoplándose
a cada unidad una base nitrogenada acetilada a través del grupo carbonilo del radical acetilo.
 Se utilizan principalmente en técnicas de hibridación in situ.
 Su composición química les confiere dos características especiales que los diferencian de las sondas
de ADN o ARN:
 No poseen carga eléctrica, al carecer de grupos fosfato.
 Gran estabilidad (no son degradadas por nucleasas ni por proteasas).
 Ventajas:
 Alta velocidad de hibridación (superior a las de ADN o ARN).
 Los híbridos resultantes PNA/ADN o PNA/ARN son más estables que los formados a través de
sondas de ADN o ARN (Tm más elevada y no repulsión por cargas eléctricas).
 TIPOS Y CARACTERÍSTICAS DE LAS SONDAS
 SONDAS QUÍMICAS SINTÉTICAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS
 Sondas de ácidos nucleicos peptídicos (PNA)
 Ventajas:
 No resultan afectados en gran medida por la fuerza iónica del medio.
 Alta especificidad (gran capacidad para discriminar bases no complementarias).

 Inconvenientes:
 Menor solubilidad que las sondas ADN o ARN, la cual disminuye enormemente con el tamaño
de la molécula (≠ más de 30 bases).
 Solo pueden obtenerse por síntesis química.
 TIPOS Y CARACTERÍSTICAS DE LAS SONDAS
SONDAS QUÍMICAS SINTÉTICAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS

(a) Unidad de aminoetil-glicina. (b) Unidad de aminoetil-glicina con una base nitrogenada acoplada a través de
un radical acetilo. (c) Apareamiento de una cadena de PNA y otra de ADN mediante puentes de hidrógeno entre
bases nitrogenadas complementarias.
 TIPOS Y CARACTERÍSTICAS DE LAS SONDAS
 SONDAS QUÍMICAS SINTÉTICAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS
 Sondas de ácidos nucleicos bloqueados (LNA) → oligómeros sintéticos de ribonucleótidos en
los que algunas de las ribosas del esqueleto azúcar-fosfato se han modificado químicamente por
la formación de un puente de oxígeno entre el C 2’ y el C 4’.
 Se utilizan principalmente en técnicas de hibridación in situ.
 Ventajas:
 Mayor sensibilidad y especificidad que las sondas de ARN sin modificar.

 Inconvenientes:
 Solo pueden obtenerse por síntesis química.
 EL MARCAJE DE LAS SONDAS
 Las sondas utilizadas en Biología Molecular para llevar a cabo técnicas de hibridación deben estar marcadas
para poder detectar el híbrido formado una vez unida a la secuencia diana.
 Marcaje → procedimiento de marcar la sonda utilizada en un determinado ensayo de hibridación para
poder visualizar los resultados obtenidos.
 TIPOS DE MARCADORES → condicionan el método de detección usado con el híbrido.
 Marcadores que posibilitan la detección directa del híbrido resultante.
 Isótopos radiactivos → elementos químicos capaces de emitir radiaciones.
 Los más comunes son el 32P y el 3H.
 El marcaje de la sonda se lleva a cabo utilizando nucleótidos radiactivos que portan alguno de estos
isótopos.
 Este tipo de marcaje se utiliza principalmente en técnicas de hibridación en filtro (Southern blot,
Northern blot y dot blot).
 La detección del híbrido resultante se realiza por revelado mediante autorradiografía con película de
rayos X.
 Ventajas:
 Gran sensibilidad.
 Inconvenientes:
 El uso de este tipo de sondas requiere unas instalaciones especiales y personal cualificado.
 El uso de material radiactivo supone un riesgo a tener en cuenta respecto a la manipulación.
 EL MARCAJE DE LAS SONDAS
 Marcadores que posibilitan la detección directa del híbrido resultante.
 Fluorocromos → compuestos químicos que emiten luz al ser excitados por luz ultravioleta.
 Este tipo de marcaje se utiliza principalmente en la técnica FISH (hibridación in situ
fluorescente).
 Ventajas:
 El uso de varias sondas marcadas con distintos fluorocromos permite la detección
simultánea de varias secuencias diana.
 Inconvenientes:
 El uso de este tipo de sondas requiere un microscopio de fluorecencia.
 Marcadores que requieren métodos indirectos de revelado en varios pasos.
 Haptenos → moléculas de pequeño tamaño que, una vez unidos a los nucleótidos, requieren métodos
indirectos de revelado basados en la afinidad química de las moléculas o mediante
ensayos inmunológicos.
 Los haptenos más utilizados son la digoxigenina y la biotina.
 Este tipo de marcaje puede utilizarse en cualquier técnica de hibridación.
 La sensibilidad de las sondas marcadas por haptenos es menor que las sondas marcadas por
isótopos radiactivos.
 EL MARCAJE DE LAS SONDAS
 MÉTODOS DE MARCAJE → La mayoría de los métodos de marcaje se basan en reacciones
enzimáticas que favorecen la incorporación de nucleótidos
marcados a la sonda.
 Algunos de los métodos de marcaje más habituales son:
 Desplazamiento de mella → permite el marcaje de sondas de ADN bicatenario de gran tamaño e incluso
genomas completos.
 Se comienza incubando (a baja tª ≈ 15 ºC) una determinada
cantidad de sonda (≈ 1 g) con una mezcla de reacción
[ADNasa I + ADNpol I bacteriana + mezcla de
desoxirribonucleótidos trifosfato (de los cuales, uno estará
normal/ marcado con un isótopo radiactivo o con un
hapteno)].
 Distinguimos los siguientes eventos:
1. La ADNasa I rompe enlaces fosfodiéster entre dos
nucleótidos consecutivos al azar en ambas cadenas de
la sonda (nick = mellas).
2. La ADNpol I elimina nucleótidos uno a uno gracias a
su actividad exonucleasa 5’ → 3’, sintetizando
simultáneamente ADN complementario a la hebra Esquema del marcaje de sondas mediante el
intacta gracias a su actividad polimerasa 5’ → 3’. método de desplazamiento de mella.
 EL MARCAJE DE LAS SONDAS
 MÉTODOS DE MARCAJE
 Algunos de los métodos de marcaje más habituales son:
 Cebado al azar o cebado aleatorio (randompriming) →
permiten también el marcaje con isótopos radiactivos o
haptenos de sondas de ADN bicatenario de gran tamaño o
genomas completos.
 La sonda se incuba con una mezcla de reacción
[Fragmento Klenow de una ADNasa I (con actividad
polimerasa 5’ → 3’ pero no exonucleasa) + mezcla de
desoxirribonucleótidos trifosfato (de los cuales, uno
estará normal/ marcado con un isótopo radiactivo o con
un hapteno)].
 Distinguimos los siguientes eventos:
1. Desnaturalización de la sonda.
2. Unión de los hexámeros a las cadenas de la sonda
al azar.
3. Los hexámeros unidos a la sonda actúan como
cebadores para que la ADNpol. I sintetice cadenas
de ADN complementarias a la cadena que actúa de
molde, incorporando desoxirribonucleótidos del Esquema del marcaje de sondas mediante el
medio de reacción, uno de los cuales está
marcado. método de cebado aleatorio (random priming).
 EL MARCAJE DE LAS SONDAS
 MÉTODOS DE MARCAJE
 Algunos de los métodos de marcaje más habituales son:
 Marcaje terminal → se utiliza para marcar ADN de pequeño o mediano tamaño, monocatenario o
bicatenario, de forma radiactiva o mediante fluorocromos o haptenos.

 La enzima desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT, una polimerasa de ADN), permite la

incorporación de desoxinucleótidos al extremo libre 3’-OH de una molécula de ADN
monocatenaria o bicatenaria sin necesidad de una cadena molde preexistente.
 Para llevar a cabo el marcaje, la sonda e incuba con la TdT, un desoxinucleótido trifosfato
marcado, y/o didesoxinucleótidos.
 Distinguimos 2 tipos de marcaje dentro de este tipo:
1. Marcaje único en el extremo 3’: se emplea en sondas pequeñas (oligonucleótidos)
cuando interesa mantener un tamaño reducido. Se incorpora un único nucleótido
marcado (normal/, con un fluorocromo) en el extremo 3’ de la sonda.
2. Incorporación de una cola de nucleótidos marcados: la sonda se marca añadiendo
una cola de nucleótidos marcados de longitud variable.
 EL MARCAJE DE LAS SONDAS
 MÉTODOS DE MARCAJE

Esquema del marcaje

terminal de sondas
mediante la TdT.

 Marcaje por PCR → el marcaje se lleva a cabo en el mismo proceso de obtención de las sondas por
PCR, utilizando desoxinucleótidos marcados radiactivamente o con haptenos en la mezcla de
reacción.
 Marcaje de sondas de ARN → el marcaje se realiza en el mismo proceso de obtención de la sonda
ARN por transcripción mediante una ARN pol. añadiendo ribonucleótidos marcados a la mezcla de
reacción.
 EL MARCAJE DE LAS SONDAS
 PURIFICACIÓN DE LA SONDA → eliminación de los nucleótidos libres marcados
presentes en el medio de reacción.
 Los dos métodos más usados para la purificación de sondas son cromatográficos:
 Cromatografía de exclusión por tamaño → emplea geles empaquetados en microcolumnas
acopladas a tubos colectores tipo eppendorf.
 Una vez cargada la mezcla de reacción en la columna y realizada una centrifugación, los
nucleótidos libres quedarán retenidos en el gel y la sonda marcada purificada se recogerá en el
tubo colector.
 Cromatografía de adsorción → emplea matrices de vidrio o sílice empaquetadas en
microcolumnas acopladas a tubos colectores tipo eppendorf.
 FASES DE LA HIBRIDACIÓN
 Generalmente, las técnicas de hibridación pueden dividirse en 4 fases:
 Fase de prehibridación → fase de preparación de la muestra y soporte.

 Fase de hibridación → formación del híbrido sonda – secuencia diana.

 Deben tenerse en cuenta los siguientes aspectos:
 La Tm del híbrido.
 Alta concentración de cationes monovalentes en el medio de reacción.
 Baja concentración de formamida.
 El tiempo requerido para obtener una hibridación óptima oscila entre los 30 minutos y las 24 horas,
dependiendo de la concentración de la sonda en el medio de reacción.
 FASES DE LA HIBRIDACIÓN
 Generalmente, las técnicas de hibridación pueden dividirse en 4 fases:
 Lavado de posthibridación → fase crítica del proceso de hibridación. En ella se busca eliminar los
híbridos imperfectos con secuencias similares a la secuencia diana formados en la fase anterior.
 Esta fase depende de la especificidad de la técnica de hibridación llevada a cabo.
 El lavado se realiza con un tampón específico que debe cumplir las condiciones de rigurosidad
(stringency; Tm – X ºC), combinando tª, fuerza iónica y concentración de formamida.

 Fase de detección del híbrido → el método de detección variará en función del marcaje:
 Marcaje radiactivo → autorradiografía.
 Fluorocromos → emisión fluorescente emitida a cierta λ observada en microscopio de fluorescencia.
 Haptenos → métodos inmunohistoquímicos con uso de inmunohaptenos marcado con un fluorocromo
(visualización en microscopio de fluorescencia) o con una enzima que cataliza una reacción
que produce color (visualización con microscopio óptico convencional).