Tema 4

HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS
NUCLEICOS
Biología Molecular Computacional
Universidad de Sevilla (US)
16 pag.
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Biología Molecular y Citogenética CFGS Laboratorio Diagnóstico Clínico y Biomédico
IES Profesor Gonzalo Huesa
UNIDAD
DIDÁCTICA HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
4
CONTENIDOS:
1.- Concepto de hibridación. Aplicación en biología molecular.
2.- Desnaturalización del ADN.

2.1 Curva de fusión.
2.2 Temperatura de fusión.
3.- Renaturalización del ADN.

3.1 Velocidad de renaturalización.
3.2 Curvas de renaturalización:
a. de genomas procariotas.
b. de genomas eucariotas.
4.- Propiedades de los híbridos sonda-secuencia diana.

4.1 Factores que influyen en la hibridación:
a. Fuerza iónica.
b. Agentes desnaturalizantes.
c. % de bases no complementarias.
5.- Sondas genéticas:

5.1 Características generales: especificidad y sensibilidad.
5.2 Sondas de ADN. Obtención de las mismas por síntesis química, ADN
recombinante y PCR.
5.3 Sondas de ARN. Obtención por síntesis química y transcripción.
5.4 Sondas químicas sintéticas:
a. Sondas de ácidos nucleicos peptídicos.
b. Sondas de ácidos nucleicos bloqueados.
6.- Marcaje de sondas genéticas.

6.1 Tipos de marcadores: isótopos radiactivos, fluorocromos, haptenos.
6.2 Métodos de marcaje:
a. Desplazamiento de mella.
b. Cebado al azar o aleatorio.
c. Marcaje terminal.
d. Marcaje por PCR.
e. Marcaje de sondas ARN.
7. Métodos para purificación de sondas marcadas: Cromatografía de exclusión

por tamaños y cromatografía de adsorción.
8.- Fases del protocolo general de la técnica de hibridación: prehibridación,

hibridación, lavado posthibridación y detección del híbrido.
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1. CONCEPTO DE HIBRIDACIÓN. APLICACIÓN EN BIOLOGÍA

MOLECULAR:
La hibridación de ácidos nucleicos consiste en la unión de dos moléculas

monocatenarias de ácidos nucleicos, por la complementariedad de su
secuencia de bases nitrogenadas, originando una molécula híbrida bicatenaria.
Las dos cadenas complementarias que se unen proceden de moléculas
diferentes y pueden ser dos cadenas de ADN, dos cadenas de ARN o una
cadena de ADN y otra de ARN.
Las técnicas de hibridación en biología molecular permiten detectar secuencias

concretas de ácidos nucleicos o dianas (ADN o ARN) mediante el empleo de
sondas marcadas.
La secuencia diana es la secuencia concreta de bases nitrogenadas que se
pretende detectar en la muestra problema. La sonda es la cadena de
nucleótidos cuya secuencia de bases nitrogenadas es complementaria a la
secuencia diana.
Tras un proceso de hibridación adecuado se formará una estructura
bicatenaria híbrida, constituida por la sonda y la secuencia diana, que
podrá ser detectada gracias al marcaje que se habrá incorporado a la sonda.
El proceso de hibridación sonda/secuencia diana se basa en los fenómenos de

desnaturalización/renaturalización de las moléculas bicatenarias del ADN.
Existen diferentes técnicas de hibridación en medio líquido, sólido o “in situ”,

que emplean distintos tipos de sondas y marcajes de las mismas.
2.- DESNATURALIZACIÓN DEL ADN.
La desnaturalización es una propiedad del ADN que consiste en la separación

de las dos cadenas de una molécula bicatenaria por ruptura de los puentes de
hidrógeno entre las bases nitrogenadas complementarias.
La desnaturalización se consigue aumentando la temperatura o aumentando el
pH (pH alcalino).
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El comportamiento de una molécula bicatenaria de ADN durante su

desnaturalización por aumento de temperatura se representa en la curva de
fusión del ADN.
2.1 Curva de fusión:
Si se mide la absorbancia a 260 nm de una solución de una molécula

bicatenaria de ADN en función de la temperatura, se obtiene una curva
de tipo sigmoide, llamada curva de fusión.
En la curva de fusión de una molécula bicatenaria de ADN se distinguen tres

zonas:
1ª) Zona A: Es un tramo recto sin pendiente debido a que la absorbancia a 260
nm tiene un valor constante, aunque aumente la temperatura. Este valor
corresponde al valor basal de absorbancía de la molécula bicatenaria y
depende únicamente de la concentración de la molécula de ADN en la
solución.
La temperatura en esta zona no alcanza un valor suficiente para romper
puentes de hidrógeno y, por tanto, el porcentaje de desnaturalización es 0%, es
decir, todo el ADN está en forma de doble hélice bicatenaria.
2ª) Zona B: En este tramo se observa un aumento de la absorbancia a medida

que aumenta la temperatura, primero de manera lenta (curva cóncava),
después de forma rápida (recta con pendiente elevada) y finalmente de manera
lenta nuevamente (curva convexa) hasta alcanzar un valor de absorbancia
máximo.
En este rango de temperaturas es donde se produce la desnaturalización
progresiva de la molécula de ADN, de manera que al alcanzarse el valor
máximo de absorbancia la desnaturalización es del 100%. El aumento de
absorbancia a medida que la molécula se desnaturaliza se conoce
como efecto hipercrómico.
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3ª) Zona C: La gráfica en esta zona corresponde a una recta de pendiente

prácticamente nula, debido a que la absorbancia se mantiene en el valor
máximo aunque la temperatura siga aumentando. En esta fase, el ADN
se mantiene desnaturalizado al 100%.
2.2 Temperatura de fusión:
Se puede definir la temperatura de fusión (Tm del inglés Temperature

melting) de una molécula bicatenaria de ADN como la temperatura a la cual la
desnaturalización es del 50% es decir, el valor de absorbancia es la mitad entre
el valor basal y el valor máximo.
Para moléculas pequeñas, de menos de 500

pb, la Tm aumenta con la longitud pero para
moléculas de gran tamaño (más de 500 pb)
es directamente proporcional al contenido en
pares GC: a mayor porcentaje de pares GC,
mayor Tm ya que mayor será el número de
puentes de hidrógeno que hay que
romper para desnaturalizarla y, por lo tanto,
mayor cantidad de energía habrá que
suministrar en forma de calor para separar las
dos cadenas.
La Tm de cualquier molécula
de ADN estará comprendida
entre la Tm de una molécula
poli-AT (0% de pares GC) y la
Tm de una molécula poli-GC
(100% de pares GC).
De forma análoga, la curva
de fusión de cualquier
molécula de ADN estará
comprendida entre las curvas
de fusión de una molécula
poli-AT y una molécula poli-
GC.
3.- RENATURALIZACIÓN DEL ADN:
La renaturalización es el proceso por el cual las dos cadenas de una molécula

de ADN completamente separadas mediante desnaturalización térmica vuelven
a reasociarse, hasta formar la doble hélice original, al bajar lentamente la
temperatura.
Este fenómeno se puede medir por la disminución de la absorbancia a 260 nm.
La renaturalización es un proceso más complejo que la desnaturalización y
sigue una cinética distinta.
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3.1 Velocidad de renaturalización:
Para que dos cadenas complementarias se reasocien tiene que producirse un

choque aleatorio entre ambas. Cuanto mayor sea el número de cadenas en la
solución, es decir, cuanto mayor sea la concentración, mayor será la
probabilidad de que dos cadenas complementarias se encuentren y, por lo
tanto, mayor será la velocidad de renaturalización.
En la renaturalización influye la concentración, mientras que en la
desnaturalización influye la composición de las bases.
La reasociación de las cadenas durante la renaturalización se produce en dos

fases:
1. Primera fase o fase de nucleación: es una fase lenta en la que secuencias
cortas de bases complementarias se aparean por formación de puentes de
hidrógeno.
2. Segunda fase o fase de «cierre en cremallera»: es una fase rápida en la
que se produce el cierre de las secuencias vecinas originando la doble hélice.
La velocidad de la renaturalización viene determinada por la fase de

nucleación y puede definirse con la siguiente fórmula:
Donde:
- C es la concentración de ADN monocatenario
en un tiempo t determinado.
- C0 es la concentración inicial a t= 0.
- k es la constante de reasociación.
3.2 Curvas de renaturalización:
La curva de renaturalización o curva C0t. se obtiene representando la fracción

de ADN renaturalizado en % frente al logaritmo de C0t.
Esta curva tendrá un comportamiento diferente en función de la complejidad del
ADN.
La complejidad del genoma de un organismo se define como la suma total de
la longitud en pares de nucleótidos de todas las secuencias diferentes
presentes en el genoma.
En organismos procariotas, que prácticamente no tienen secuencias repetidas,

se asume que la complejidad del cromosoma bacteriano coincide con su
tamaño en pares de bases.
Ejemplo: El genoma de una bacteria está constituido por 500 000 pares de
nucleótidos y todas las secuencias que lo componen son únicas.
Complejidad = longitud en pares de nucleótidos = 500 000
Los genomas de organismos eucariotas, en cambio, contienen secuencias

únicas, secuencias altamente repetidas y secuencias moderadamente
repetidas. Para calcular la complejidad de estos genomas se suma una vez la
longitud de cada secuencia repetida, más la longitud de las secuencias únicas.
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Ejemplo: El genoma de un organismo eucariota también está constituido por

500 000 pares de nucleótidos, pero tiene una secuencia de 500 pb que se
repite 100 veces y otra secuencia de 100 pb que se repite 1.000 veces. El resto
del genoma está constituido por secuencias únicas.
Longitud de las secuencias únicas = 500 000 - (500· 100) - (100· 1000) =
350 000 pb.
Complejidad = 500 + 100 + 350 000 = 350 600.
a. Curvas de renaturalización de genomas procariotas:

Para genomas sin secuencias repetidas, como los de organismos procariotas,
la curva de renaturalización es una curva sigmoide en la que también se puede
definir un punto medio Cot1/2,.
El valor Cot1/2 se define como el valor de Cot al cual la renaturalización es del
50%.
Este valor está directamente relacionado con la complejidad del ADN que
renaturaliza por tanto a mayor complejidad, mayor Cot1/2.
La velocidad de renaturalización es inversamente proporcional a la complejidad
de la molécula.
b. Curvas de renaturalización de genomas eucariotas.

En el caso de grandes moléculas y genomas con secuencias repetidas, como
los de organismos eucariotas, la curva de renaturalización no es sigmoide,
sino escalonada, con varios puntos de inflexión.
Esto es debido a que contienen tres tipos de secuencias:
- Secuencias altamente repetidas, que se repiten un número muy elevado de
veces a lo largo del genoma,
- Secuencias moderadamente repetidas, que se repiten varias veces.
- Secuencias únicas, que aparecen solo una vez.
Para realizar las curvas de renaturalización de grandes moléculas y genomas

completos, el ADN se fragmenta.
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Esto implica que en el tubo donde se efectúa el ensayo de renaturalización

habrá un número reducido de fragmentos para cada secuencia única (tantos
como genomas completos hayamos fragmentado), decenas o cientos de
fragmentos para cada secuencia moderadamente repetida y miles de
fragmentos para cada secuencia altamente repetida. Por lo anterior, en la curva
de renaturalización de genomas eucariotas se observan tres fases o
componentes:
1. Componente rápido, que corresponde a las secuencias altamente repetidas
y que reasocia rápidamente, porque su concentración en la solución
es mucho mayor que el de las demás secuencias.
2. Componente intermedio, que corresponde a las secuencias moderadamente
repetidas y que renaturaliza más lentamente que el anterior porque su
concentración es menor.
3. Componente lento, que corresponde a las secuencias únicas, cuya
concentración es muy baja y por lo tanto renaturaliza lentamente.
La parte de la curva correspondiente a cada componente sí tiene forma

sigmoide y pueden estar separados por mesetas (tramos rectos) o solaparse,
según la composición de las moléculas en estudio. Estas curvas permiten
estimar la complejidad global del genoma, así como la proporción relativa y la
complejidad media de cada tipo de secuencias (únicas y repetidas).
4.- PROPIEDADES DE LOS HÍBRIDOS SONDA-SECUENCIA DIANA.
El híbrido sonda/secuencia diana tiene las mismas propiedades que una

molécula bicatenaria de ADN en cuanto a desnaturalización y renaturalización.
Igualmente, se puede obtener una curva de fusión de cualquier híbrido,
aumentando la temperatura y midiendo la absorbancia a 260 nm. Se pueden
comparar las Tm de diferentes híbridos.
La Tm es independiente de la concentración del híbrido en la solución,
dependiendo solo de la proporción de pares GC.
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Sin embargo, la Tm de un híbrido puede variar, según la composición del

solvente en el que se efectúa la hibridación.
4.1 Factores que influyen en la hibridación:
a. Fuerza iónica: cuanto mayor es la concentración de cationes

monovalentes en la solución, más energía en forma de calor hay que aportar al
híbrido para desnaturalizarlo. Esto se refleja en la curva de fusión, que se
desplaza hacia la derecha.
b. Agentes desnaturalizantes: Si se añaden compuestos desnaturalizantes

y solventes orgánicos, como el dimetilsulfóxido (DMSO) y la formamida, al
híbrido en solución, se requiere menos energía para desnaturalizarlo, por lo
que la curva de fusión se desplaza hacia la izquierda y la Tm disminuye.
c. % de bases no complementarias: una sonda puede unirse tanto a su

secuencia diana como a secuencias parecidas a la diana que tengan algunas
bases distintas no complementarias .El porcentaje de pares de bases no
complementarias en el híbrido o mismatch es otro factor que influye en la Tm:
a mayor mismatch, menos puentes de H y por tanto, menor Tm. Para sondas
de gran tamaño, la Tm del híbrido disminuye 1°C por cada 1% de mismatch,
pero para sondas pequeñas, una única base desapareada puede disminuir en
varios grados la Tm del híbrido. Por ese motivo se emplean oligonucleótidos
pequeños como sondas para detectar mutaciones puntuales por hibridación.
5.- SONDAS GENÉTICAS:
5.1 Características generales: especificidad y sensibilidad:

La elección de determinada sonda para una técnica de hibridación dependerá
de especificidad y sensibilidad que se pretenda conseguir.
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La especificidad es la capacidad que tiene una sonda para discriminar la

secuencia diana con la que se tiene que hibridar. Se considera que el tamaño
mínimo de la secuencia de una sonda para que sea específica debe ser de 16
bases.
La sensibilidad es la probabilidad de detectar cantidades mínimas del híbrido
sonda-diana y está en relación con el número de moléculas marcadoras que
admite la sonda.
Las sondas utilizadas en las técnicas de hibridación se pueden clasificar en:

 Sondas ADN.
 Sondas ARN.
 Sondas químicas sintéticas de ácidos nucleicos.
5.2 Sondas de ADN. Obtención de las mismas:
Las sondas de ADN son las más utilizadas porque son fáciles de obtener en
grandes cantidades y sus cinéticas de desnaturalización y renaturalización
son las más estudiadas y mejor comprendidas.
Según el proceso de obtención, las sondas de ADN pueden ser de síntesis
química, de ADN recombinante y de PCR.
a.- Sondas de síntesis química: se obtienen por condensación química

secuencial de los desoxinucleótidos concretos que interesa incorporar para
obtener una secuencia determinada.
Actualmente este proceso está automatizado, anclando el primer nucleótido de
la secuencia a una fase sólida y añadiendo nucleótido a nucleótido.
Son monocatenarias y tienen un tamaño reducido. Sólo se pueden sintetizar
oligonucleótidos relativamente pequeños de unos 40-50 nucleótidos.
Al ser monocatenarias, no requieren desnaturalización por calor durante el
proceso de hibridación. Su tamaño reducido les permite una mejor penetración
en tejidos, lo cual resulta ventajoso en las técnicas de hibridación in situ.
Como inconvenientes está su baja sensibilidad por el reducido tamaño que
limita el número de moléculas marcadoras que pueden incorporar, y son poco
específicas ya que hibridan fácilmente con secuencias parecidas a la
secuencia diana.
b.- Sondas de ADN recombinante: se obtienen por un proceso de clonación

y amplificación por cultivo, que se puede esquematizar de la siguiente manera:
1º. El fragmento de ADN que queremos emplear como sonda se inserta en un
vector, normalmente un plásmido bacteriano.
2º. El plásmido recombinante se introduce en una bacteria y se cultiva en un
medio apropiado.
3º. Posteriormente se extrae el plásmido amplificado y se emplea entero como
sonda, o bien se separa el fragmento de interés con enzimas de restricción.
Estas sondas se caracterizan por ser bicatenarias por lo que requieren

desnaturalización por calor como paso previo a la hibridación con las
secuencias diana.
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Tienen un gran tamaño (cientos o miles de pares de bases). Esto hace que
admitan un gran número de moléculas marcadoras y, por tanto, tienen mayor
sensibilidad que otras sondas. Presentan gran especificidad.
c.- Sondas obtenidas por PCR: La obtención de sondas de ADN mediante

PCR consiste en amplificar el fragmento que nos interesa como sonda
mediante la reacción en cadena de la polimerasa, para lo que debemos
conocer las secuencias contiguas al fragmento que queremos amplificar.
Son bicatenarias y tienen un tamaño intermedio (cientos de bases).
5.3 Sondas de ARN. Obtención por síntesis química y transcripción:
Son menos utilizadas que las sondas de ADN.

Son siempre monocatenarias, por lo que no requieren paso previo de
desnaturalización antes de la hibridación.
Tienen como ventaja que los híbridos ADN/ARN son ligeramente más estables
que los híbridos ADN/ADN, y como inconveniente, que se contaminan con
facilidad dada la omnipresencia de las ARNasas, que las degradan.
Las sondas de ARN pueden ser de síntesis química o de transcripción.
a.- Sondas ARN de síntesis química: Se obtienen por condensación química

secuencial de los ribonucleótidos concretos que interesa. Tienen las mismas
ventajas e inconvenientes que las sondas de síntesis química de ADN.
b.- Sondas ARN de transcripción: El proceso de obtención consiste en

transcribir un vector que contiene el fragmento de interés o un ADN copia
mediante una ARN polimerasa.
Estas sondas suelen ser de tamaño intermedio (cientos de bases).
5.4 Sondas químicas sintéticas:
En la actualidad se están empezando a comercializar como sondas

modificaciones químicas sintéticas de los ácidos nucleicos, tales como las
sondas de ácidos nucleicos peptídicos o las sondas de ácidos nucleicos
bloqueados.
a. Sondas de ácidos nucleicos peptídicos o PNA (del inglés peptide nucleic

acid), son oligómeros sintéticos de menos de 30 bases, en los que el esqueleto
típico de azúcar-fosfato del ADN y el ARN es sustituido por un esqueleto de
poli-aminoetil-glicina.
A cada residuo de aminoetil-glicina se le acopla una base nitrogenada
acetilada. Las sondas PNA hibridan con cadenas de ADN y ARN de secuencia
complementaria mediante puentes de hidrógeno entre bases complementarias.
No tienen carga eléctrica, al carecer de grupos fosfato y no son degradadas
por nucleasas ni por proteasas, lo que les confiere gran estabilidad.
Las principales ventajas de las sondas PNA son:
- Hibridan más rápidamente.
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- Los híbridos resultantes PNA/ADN o PNA/ARN son muy estables. Su Tm es

más elevada debido a su falta de carga eléctrica hace que no exista el efecto
de repulsión entre cadenas complementarias.
- Son muy específicas.
Las sondas PNA se utilizan principalmente en técnicas de hibridación in situ.
b. Sondas de ácidos nucleicos bloqueados: Los ácidos nucleicos

bloqueados o LNA (del inglés locked nucleic acid) son oligómeros sintéticos de
ribonucleótidos, en los que se modifican químicamente algunas de las ribosas
del esqueleto azúcar- fosfato mediante la formación de un puente de oxígeno
entre el carbono 2' y el carbono 4. Al igual que las sondas PNA, se obtienen
solo por síntesis química, son de pequeño tamaño y se usan principalmente en
técnicas de hibridación in situ.
6.- MARCAJE DE SONDAS GENÉTICAS:
El marcaje es el procedimiento de marcar la sonda utilizada en las técnicas de

hibridación con la finalidad de poder visualizar los resultados.
6.1 Tipos de marcadores: isótopos radiactivos, fluorocromos, haptenos.

El tipo de marcador utilizado condiciona el método de detección del híbrido.
Posibilitan la detección directa del híbrido los isótopos radiactivos y
fluorocromos. Los haptenos como digoxigenina y biotina requieren métodos
indirectos de revelado en varios pasos.
Los isótopos radiactivos son elementos químicos con capacidad de emitir

radiaciones. Los más utilizados son el fósforo - 32 (32P) y el tritio (3H).
El marcaje en la sonda se produce introduciendo nucleótidos radiactivos que
contienen alguno de estos isótopos.
El uso de este tipo de sondas requiere instalaciones e infraestructuras
adecuadas para el trabajo con material radiactivo. La detección del híbrido se
realiza revelando el marcaje radiactivo mediante autorradiografía con una
película de rayos X.
Los fluorocromos son compuestos químicos que emiten luz de mayor longitud
de onda al ser excitados por la luz ultravioleta. Se utilizan derivados de la
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fluoresceína y la rodamina, y más modernas son las cianinas (Cy3, Cy5, Cy7),
Alexa-flúor, etc.
Las sondas marcadas con fluorocromos se utilizan principalmente en la técnica
FISH (hibridación in situ fluorescente). El empleo de varias sondas marcadas
con diferentes fluorocromos permite detectar simultáneamente varias
secuencias diana. Esto es muy útil en estudios de citogenética.
Para la detección del híbrido marcado se requiere un microscopio de
fluorescencia.
Los haptenos (digoxigenina y biotina) son moléculas de pequeño tamaño que,

al igual que los fluorocromos, se pueden acoplar a los nucleótidos y no alteran
la especificidad de la sonda. Pero a diferencia de ellos, no pueden ser
detectados directamente por lo que requiere métodos indirectos de revelado
basados en la afinidad química o en métodos inmunológicos.
Este tipo de sondas se puede usar prácticamente en todas las técnicas de
hibridación.
6.2 Métodos de marcaje:

La mayoría de los métodos de marcaje utilizan reacciones enzimáticas y se
basan en la incorporación a la sonda de nucleótidos marcados.
La densidad de marcaje de la sonda viene determinada por la mezcla de

nucleótidos utilizada en la reacción. Se pueden usar todos los nucleótidos
marcados (normalmente con isótopos radiactivos) o solo uno de ellos
(normalmente con un hapteno). Incluso se pueden utilizar diferentes
proporciones de nucleótidos marcados y sin marcar.
Los métodos de marcaje más habituales son:
a. Desplazamiento de mella: Se utiliza para marcar sondas de ADN

bicatenario de gran tamaño, obtenidas normalmente por tecnología de ADN
recombinante y también para marcar genomas enteros.
Se procede incubando una determinada cantidad de sonda con una mezcla de
reacción que contiene los siguientes elementos:
- ADNasa I.
- ADN polimerasa I bacteriana.
- Una mezcla de desoxirribonucleótidos trifosfato, estando uno de los cuatro
posibles marcado con un isótopo radiactivo o con un hapteno.
Durante la incubación, normalmente a baja temperatura (15°C), tienen lugar los

siguientes procesos:
1. La ADNasa I a bajas concentraciones y en presencia de cationes magnesio
rompe enlaces fosfodiéster entre dos nucleótidos consecutivos al azar en
ambas cadenas de la sonda. Es decir, produce mellas (nick en inglés) en sitios
al azar en ambas cadenas.
2. La ADN polimerasa I intenta reparar las mellas. Gracias a su actividad
exonucleasa 5' a 3' va eliminando nucleótidos, uno a uno, desde la mella hacia
el extremo 3' de la cadena. Simultáneamente, gracias a su actividad polimerasa
5' a 3', va incorporando desoxirribonucleótidos en el extremo 3'-OH libre de la
mella, sintetizando ADN complementario a la hebra intacta. Los nucleótidos
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que incorpora los toma del medio de reacción y uno de ellos está marcado, de
esta manera, la ADN polimerasa I desplaza la mella a lo largo de la cadena de
ADN, sustituyendo ADN sin marcar por ADN marcado.
b. Cebado al azar o aleatorio (random priming): la sonda se incuba con los

siguientes reactivos:
- Una mezcla de todos los oligonucleótidos posibles de 6 bases (hasta 10
bases).
- Fragmento Klenow de la ADN polimerasa 1. Este fragmento conserva la
actividad polimerasa 5' a 3', pero carece de la actividad exonucleasa 5' a 3'.
- Mezcla de
desoxirribonucleótidos
trifosfato, uno de ellos
marcado.
El marcaje se produce en
varias fases:
1. Desnaturalización de la
sonda.
2. Unión de los hexámeros a
las cadenas de la sonda al
azar por complementariedad
de bases en múltiples zonas
de las cadenas de la sonda.
3. Los hexámeros unidos a la
sonda actúan como cebadores
para que la ADN polimerasa I
(fragmento Klenow) sintetice
cadenas de ADN
complementarias a la cadena
que actúa de molde,
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incorporando los desoxirribonucleótidos que hay en el medio de reacción, uno

de los cuales está marcado.
c. Marcaje terminal: se utiliza para marcar sondas de ADN bicatenario

o monocatenario, tanto radiactivamente, como con fluorocromos o haptenos .
Se emplea para ello la enzima desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT), una
ADN polimerasa capaz de incorporar desoxinucleótidos al extremo 3'-OH libre
de una molécula de ADN (bicatenaria o monocatenaria) sin necesidad de una
cadena molde. Esta enzima es capaz de incorporar todo tipo de nucleótidos
marcados.
Hay dos posibilidades de marcaje:
Marcaje único en el extremo 3'. Consiste en incorporar un único nucleótido
marcado (normalmente con un fluorocromo) en el extremo 3' de la sonda.
Incorporación de una cola de nucleótidos marcados de longitud variable.
d. Marcaje por PCR: el marcaje de sondas por PCR se realiza en el mismo

proceso de obtención de las sondas por PCR, utilizando desoxinucleótidos
marcados radiactivamente o con haptenos en la mezcla de reacción.
e. Marcaje de sondas ARN: el marcaje se puede realizar en el mismo proceso

de obtención de la sonda ARN mediante transcripción con una ARN
polimerasa, añadiendo ribonucleótidos marcados a la mezcla de reacción .
7. MÉTODOS PARA PURIFICACIÓN DE SONDAS MARCADAS:

CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN POR TAMAÑOS Y CROMATOGRAFÍA
DE ADSORCIÓN:
La purificación de la sonda consiste en la eliminación de los nucleótidos

libres marcados para evitar ruido de fondo o interferencias en los resultados de
las técnicas de hibridación.
Los dos métodos más usados para la purificación de las sondas son
cromatográficos.
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a.- Cromatografía de exclusión por tamaño: se utilizan geles de

poliacrilamida empaquetados en microcolumnas que se acoplan a tubos
colectores tipo eppendorf.
La mezcla de reacción se carga en la columna y se centrifuga, de manera que
los nucleótidos libres quedan retenidos en el gel y la sonda marcada purificada
se recoge en el tubo colector.
b.- Cromatografía de adsorción: Se utilizan matrices de lana de vidrio o sílice

empaquetadas en microcolumnas que se acoplan a tubos colectores tipo
eppendorf, similares a las utilizadas en la purificación de ácidos nucleicos y
basadas en los mismos principios.
8.- FASES DEL PROTOCOLO GENERAL DE LA TÉCNICA DE

HIBRIDACIÓN:
Se consideran cuatro fases: prehibridación, hibridación, lavado posthibridación

y detección del híbrido.
1ª.- Fase de prehibridación:

Es la fase de preparación de la muestra y soporte. Se puede desarrollar en
múltiples pasos, según las técnicas a seguir, que incluyen digestiones
enzimáticas, electroforesis, transferencias, bloqueos de uniones inespecíficas,
etc.
2ª.- Fase de hibridación:

En esta fase se produce la
formación del híbrido
sonda/secuencia diana. La
mayor eficiencia de
hibridación se consigue a
temperaturas comprendidas
entre Tm -32 °C y Tm -16ºC,
siendo máxima a Tm -25 ºC.
La hibridación se suele
realizar a temperaturas
prefijadas estándar,
normalmente 37ºC, 42°C o
65ºC, dependiendo de las
técnicas. Para que estas temperaturas coincidan con Tm -25°C se han
desarrollado experimentalmente fórmulas matemáticas.
El tiempo durante el que se incuba la sonda con la muestra para asegurarse

una buena hibridación va a depender de la concentración de la sonda y, según
la técnica, puede oscilar entre 30 minutos y 24 horas.
3ª.- Lavado de poshibridación:

Se realiza con un tampón para mantener los híbridos sonda/secuencia diana y
eliminar los híbridos imperfectos con secuencias parecidas a la diana. Por lo
tanto, de esta fase depende en gran medida la especificidad de la técnica.
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4ª.- Fase de detección del híbrido:

Según cuál sea el tipo de marcador utilizado (radiactivo, fluorocromo o
hapteno) variará el método de detección:
a.- Marcaje radiactivo: normalmente se emplea en técnicas de hibridación

sobre soporte. La detección se realiza mediante autorradiografía, colocando
una placa de rayos X sobre el soporte para que la emisión radiactiva del
marcador la impresione. Tras el revelado de la placa, la positividad de la
hibridación se observa como marcas (puntos, manchas o bandas) oscuras.
b.- Fluorocromos: Normalmente se emplean en técnicas de hibridación in situ.

Finalizada la técnica, las preparaciones se
llevan al microscopio de fluorescencia
donde, al ser excitadas con una longitud
de onda adecuada, se produce la
correspondiente emisión fluorescente del
marcador que permite la visualización.
c.- Haptenos: se usan en todo tipo de técnicas. La detección se realiza por

métodos inmunohistoquímicos con un anticuerpo antihapteno marcado con un
fluorocromo (visualización con microscopio de fluorescencia) o una enzima,
que cataliza una reacción en la que se produce un producto coloreado
(visualización con microscopio óptico convencional).
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HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS

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1.- Concepto de hibridación. Aplicación en biología molecular.

2.- Desnaturalización del ADN.

3.- Renaturalización del ADN.

4.- Propiedades de los híbridos sonda-secuencia diana.

5.- Sondas genéticas:

6.- Marcaje de sondas genéticas.

7. Métodos para purificación de sondas marcadas: Cromatografía de exclusión

8.- Fases del protocolo general de la técnica de hibridación: prehibridación,

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1. CONCEPTO DE HIBRIDACIÓN. APLICACIÓN EN BIOLOGÍA

La hibridación de ácidos nucleicos consiste en la unión de dos moléculas

Las técnicas de hibridación en biología molecular permiten detectar secuencias

El proceso de hibridación sonda/secuencia diana se basa en los fenómenos de

Existen diferentes técnicas de hibridación en medio líquido, sólido o “in situ”,

2.- DESNATURALIZACIÓN DEL ADN.

La desnaturalización es una propiedad del ADN que consiste en la separación

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El comportamiento de una molécula bicatenaria de ADN durante su

2.1 Curva de fusión:

Si se mide la absorbancia a 260 nm de una solución de una molécula

En la curva de fusión de una molécula bicatenaria de ADN se distinguen tres

2ª) Zona B: En este tramo se observa un aumento de la absorbancia a medida

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3ª) Zona C: La gráfica en esta zona corresponde a una recta de pendiente

2.2 Temperatura de fusión:

Se puede definir la temperatura de fusión (Tm del inglés Temperature

Para moléculas pequeñas, de menos de 500

3.- RENATURALIZACIÓN DEL ADN:

La renaturalización es el proceso por el cual las dos cadenas de una molécula

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3.1 Velocidad de renaturalización:

Para que dos cadenas complementarias se reasocien tiene que producirse un

La reasociación de las cadenas durante la renaturalización se produce en dos

La velocidad de la renaturalización viene determinada por la fase de

3.2 Curvas de renaturalización:

La curva de renaturalización o curva C0t. se obtiene representando la fracción

En organismos procariotas, que prácticamente no tienen secuencias repetidas,

Los genomas de organismos eucariotas, en cambio, contienen secuencias

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Ejemplo: El genoma de un organismo eucariota también está constituido por

a. Curvas de renaturalización de genomas procariotas:

b. Curvas de renaturalización de genomas eucariotas.

Para realizar las curvas de renaturalización de grandes moléculas y genomas

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Esto implica que en el tubo donde se efectúa el ensayo de renaturalización

La parte de la curva correspondiente a cada componente sí tiene forma

4.- PROPIEDADES DE LOS HÍBRIDOS SONDA-SECUENCIA DIANA.

El híbrido sonda/secuencia diana tiene las mismas propiedades que una

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Sin embargo, la Tm de un híbrido puede variar, según la composición del

4.1 Factores que influyen en la hibridación:

a. Fuerza iónica: cuanto mayor es la concentración de cationes

b. Agentes desnaturalizantes: Si se añaden compuestos desnaturalizantes

c. % de bases no complementarias: una sonda puede unirse tanto a su

5.- SONDAS GENÉTICAS:

5.1 Características generales: especificidad y sensibilidad:

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La especificidad es la capacidad que tiene una sonda para discriminar la

Las sondas utilizadas en las técnicas de hibridación se pueden clasificar en:

5.2 Sondas de ADN. Obtención de las mismas:

a.- Sondas de síntesis química: se obtienen por condensación química

b.- Sondas de ADN recombinante: se obtienen por un proceso de clonación