Técnicas de hibridación de ácidos nucleicos

La estructura primaria o secuencia de nucleótidos de los acidos nucleicos es el soporte

fisico de la información Genética y, por ello. el objetivo final de todos los métodos analiti-
cos y de manipulación incluidos en lo que se conoce. hoy como Ingenieria Genetica. El acce-
so a ese nivel estructural se encuentra por el momento restringido exclusivamente a tres
tipos de técnicas: las enzimáticas, las químicas y las de hibridación. Las herramientas mas
perfectas para alcanzar el nivel primario de los ácidos nucleicos, reconocerlo y actuar en
consecuencia son las enzimas, proteínas que han alcanzado a lo largo de la evolución un
nivel de especificidad y eficacia inigualables. y en las que se basan la mayoria de los pro-
cedimientos analíticos y, sobre todo, de manipulación de ácidos nucleicos. Por otro lado,
uno de los procedimientos para analizar la secuencia del DNA se fundamenta en la posibi-
lidad de romper la cadena polinucleotidica por posroones (bases nitrogenadas) mas o menos
especificas mediante unaserie de reacciones químicas: la especificidad de la reacción qui-
nuncatan grande como-la enzimática. es la base para la deducción de datos de secuen-

cia. La tercera via es la hibridación, que explota la capacidad de una estructura polinucleo-

La hibridación es el proceso en que dos hebras polinucleotidicas de distinta proceden-

cia interaccionan para formar una serie de pares de bases y, pOr tanto, una-estructura bica-
tenaria en doble hélice cuya longitud y corrección depende del grado de comp/enzen/an’e-
dad de las dos hebras originales. Se trata de un tipo especial de renaturalización cuyo
mecanismo es complicado y conviene conocerlo, aunque sea superficialmente, para poder
entender el porqué de las condiciones experimentales en que se desarrolla.

Contemplado como la unión de dos largas cadenas polinucleotidicas, es fácil ver su apli-
cación al conocimiento estructural de ambas; por ejemplo, la evaluación del grado de seme-
janza de DNAs genómicos y la proximidad filogenética de las especies biológicas de las que
provienen, o la investigación del numero y disposición de intrones en una secuencia géni-
ca de DNA mediante su hibridación con el mRNA proceSado. Pero visto desde una pers-
pectiva más “asimétrica”, esta técnica permite deteCtar, localizar, identificar o incluso aislar
una determinada molécula mediante el uso de otra conocida y con secuencia complemen-
taria que, previamente marcada, actúa como una sonda que señaliza la situación de la molé-
cula problema incluso cuando ésta se encuentra diluida en una mezcla de gran compleji-

dad. La capacidad de una secuencia de bases para reconocer a otra con suficiente grado de
‘ complementariedad permite acceder al nivel de secuencia, aun sin Cónocerla, para locali-
zar una molécula especifica.

Las hibridaciones del primer tipo se suelen llevar a cabo en disolución. Sin embargo, el
uso de sondas marcadas requiere previamente fijar las posiciones de las moléculas que se
van a investigar. Se necesita llevar a cabo una transferencia de estas moléculas a un sopor-
te sólido, donde quedarán retenidas y fijadas en posiciones relacionables con su situación
original. Este soporte actuará, a partir de aqui, como una “copia” de la mezcla de molécu-
las, y sobre él se realizara la hibridación con la sonda.
En este capitulo se estudian primero los procesos de desnaturalización y renaturalizaw

ción, como base previa para abordar el estudio de la hibridación. Ya dentro de eSta técni-
ca se presentan los métodos de transferencia de ácidos nucleicos a soportes sólidos para, a
continuación, estudiar la reacción de hibridación con la sonda marcada y antiCipar sus

muchas aplicaciones.

4.1. Desnaturalización y renaturalización de estructuras bicatenarias

La estructura bicatenaria, en forma de doble hélice, enormemente extendida entre las

moléculas de ácidos nucleicos, está mantenida fundamentalmente por los enlaces depurar:-
te de hidrógeno, que se establecen entre bases nitrogenadas complementarias a lo largo ( e
longitudes más o menos largas. Esta estructura se presenta, de manera casi universal, en las
grandes moléculas de DNA bicatenario o de doble hebra (dsDNA) y, de manera más res-
tringida pero aun asi frecuente, en las moléculas monocatenarias de los distintos tipos de

' RNA, formando regiones en doble hélice intracatenaria.

La desnaturalr’zacíón es el proceso de rotura o desaparición de esa estructura bicate-

naria. Es un fenómeno que se produce in vivo acompañando a los procesos de replicación
del DNA, donde la doble hélice ha de abrirse en su totalidad, y de transcripción, donde el
alcance de la apertura es mucho más limitado. En ambos casos, la célula posee proteinas y
actividades enzimáticas capaces de realizar la separación de las dos hebras de la doble héli-
ce de manera controlada, reversible, eficaz y en condiciones fisiológicas.

’ Pero. por distintos caminos, la desnaturalización del DNA o del RNA puede también
lograrse in vitro y es algo que resulta ser muy útil para:

- Facilitar su eliminación: en los procedimientos clásicos de preparación de DNA pla 3-

midico (capitulo 2), el DNA cromosómico es precipitado en forma de agregado nucleo-
proteico después de su desnaturalización, debido a que su gran tamaño le impice
recuperar la forma soluble cuando las condiciones desnaturalizantes revierten.

- Permitir su análisis. las moléculas monocatenarias de acidos nucleicos pueden ser

analizadas mediante electroforesis en geles (capitulo 3); su movilidad es función de
su tamaño siempre que en su movimiento a través del gel mantengan esa estructura
en monohebra; la formación de regiones mas o menos grandes con doble hélice intra-

catenaria ("horquillas") altera mucho su velocidad de migración y anula las posibili- .

dades analíticas. Por otro lado, un control fino del proceso permite valorar la resis-
tencia de una molécula bicatenaria a la desnaturalización, lo que puede relacionarse
con ciertos detalles de la propia estructura de la molécula (porcentaje de pares GC y
porcentaje de pares AT).

— Permitir su lectura por ciertas enzimas: algunos procedimientos de análisis y mani:

pulación de ácidos nucleicos se basan en el uso de ciertas actividades enzimáticas

(polimerasas). capaces de catalizar la sintesis de polinucleótidos c .anclo son dirigi-
das por un DNA o un RNA con estructura de monohebra. La enzima tiene que inte-
raccionar y reconocer (leer) una tras otra todas las bases presentes en la hebra direc-
tora. Para conseguir un buen resultado ha de impeclirse al máximo la aparición de
horquillas intracatenarias que afecten o incluso impidan esa lectura.

— Facilitar su reconocimiento por parte de otras moléculas monocatenarias: como se

vera en seguida, los métodos de renaruralización e hibridación se basan en la inte-
ra'cción entre bases nitrogenadas de hebms complementarias. Para conseguir un buen
acoplamiento entre ellas, se requiere que lleguen al momento de la interacción con
el menor grado posible de estructura intracatenaria.

Aunque la enorme acumulación de puentes de hidrógeno a lo largo de una doble hélice

otorga a esta estructura una estabilidad muy considerable, el enlace en si es una unión débil,
que se rompe con relativa facilidad (figura 4.1). No todas las zonas de la estructura bicatenan'a
son igualmente resistentes: un par de bases A=T esta mantenido por dos puentes de hidróge-
no, un par Gac, por tres. Una región de doble hélice con una alta proporción de pares GEC es
más fuerte que una región “rica” en pares A=T. La desnaturalización siempre comienza por los
puntos o zonas más débiles (ricas en pares A-T), donde la estabilidad es menor. Cuando las
condiciones se fuerzan, los puentes de hidrógeno de esa zona empiezan a romperse y se ori-
gina una pequeña región monocatenaria (“burbuja”). donde la doble hélice se abre y las dos
hebras se separan localmente; se ha producido una desnaruralización parcial localizada.
Extremando las condiciones que conducen a esta rotura de enlaces, el proceso se extiende, a
partir de las burbujas iniciales, hasta llegara alcanzar largas longitudes y, en su caso, la totali-
dad de la estructura en forma de doble hélice: es la desnaiuralzz'acz'ón total.

Entre los diStintos agentes desnaluralizantes se pueden señalar los siguientes:

— La temperatura: su elevación produce un aumento de la energia de las moléculas y,

' dado que los puentes de hidrógeno son enlaces débiles, se aumenta la probabilidad

de que se formen pequeñas burbujas en una doble hélice. Conforme se alcanzan

mayores valores de temperatura, las burbujas van creciendo en tamaño y número, y

el alcance de la desnaturalización también, pudiéndose llegar a la separación com-

pleta de las dos hebras. Este proceso recibe el nombre de desnaruralización térmi-

ca y tiene un notable valor analítico: una estructura en doble hélice es tanto más resis-

tente a la desnaturalización cuanto mayor es la proporción de pares GEC que participan

en ella, de manera que el análisis del rango de temperaturas en que se produce la

desnaturalización de una molécula bicatenaria permite determinar el porcentaje de

pares GEC que hay en ella. Puesto que la absorción a 260 nm aumenta con el pro-

ceso (capitulo 3), la curva de A260 uersustemperatura (curva de clcsnarumlización o

curva defusión de un DNA) facilita este analisis (figura 3.1).

- Los valores extremos (lepH: las uniones por puentes de hidrógeno son sensibles a

valores extremos de pH; en medios muy acidos, los átomos que reciben al hidróge-

no del puente resultan protonados y, por tanto, bloqueados para formar dicho enla-
ce; en medios muy alcalinos, los hidrógenos del puente se separan del átomo dona-

;dor; en ambos casos. los puentes de hidrógeno desaparecen.

Procura/os cam/"épicos. son moleculas de pequeno tamano y con alta capacidad para

- formar puentes de hidrógeno, tales como el formaldehído, la formamida ola urea;

se introducen en el interior de la doble hélice y deshacen los enlaces que mantenían

unidas a las bases nitrogenadas complementarias al saturar los centros donadores y
receptores del puente de hidrógeno. Su capacidad desnaturalizante es función de la

r concentración en que se encuentran.

Proteínas con acn‘m’dnr/ ¡Ja/¡casa (catalizan la rotura de puentes de hidrógeno y, por

tanto, la apertura de la doble hélice) yproteínas con alta afinidad de unión al DNA
monocarenarío (sing/e Strand DNA br‘udr‘ng pro/airis, ssDBPs): son componentes
centrales de los sistemas celulares que realizan la desnaturalización parcial o total del
DNA; aislados y purificados, son comerciales en muchos casos y se utilizan para pro-
vocar la desnaturalización controlada en ensayos in vitro
La reconstitución de la estructura en doble hélice a partir de dos hebras complementa-

rias recibe el nombre de re)¡mara/¡zación (figura 4.2). Es un proceso que in UÍL‘O siempre

La reacción bimoiecuiar de renaturalización incluye dos fases o etapas:

- La fase de nuc/eación: supone el encuentro o choque de hebras Simples por
pequeñas zonas complementarias (a); se forman los primeros puentes de H
entre bases y el primer núcleo de renatura/ización; muchos choques son “no
productivos" y, si las condiciones lo permiten, los enlaces de H fermados
pueden deshacerse y las habras separarse para intentar nuevos contactos:
-La fase de cierre: supone la extensión de Ia estructura en dcble hélice.
desde el nucleo inicial y en ambos sentidos (b y c). hacia los dos extremos.

Figura 4.2. Renaturaiización de estructuras bicatenarias.

Sin embargo, el mecanismo clel proceso es mucho mas complejo que en el caso de la sepa-

ración progresiva cle cadenas. La renaturalización se trata de una reacción bimolecular en don-
de dos moléculas han de “encontrarse” e r'niemccionar correctamente. Lo primero supone
que

a concentración de moléculas es un parámetro fundamental en la velocidad cle la renaturali-

zación. Lo segundo plantea problemas practicos: cuando dos hebras polinucleoticlicas chocan,
interaccionarán y quedaran enlazadas a traves (le los primeros puentes de hidrógeno que se
lormen, pero, lo mas probable, es que esa primera unión no sea adecuada y, cuando a partir
(le ese pn'mer núcleo de reiratziraiz'251C1'óiz el proceso se extienda a otras zonas (le las
cadenas,
antes o después se alcancen regiones no complementarias. Ese conato (le cloble hélice no pro-
gresará; el choque inicial fue no fructífero. Y esa molécula, parcialmente en doble hélice. par-
cialmente en hebra simple, no podrá recuperarse para el proceso, salvo que aquellos prime-
ros enlaces que se fommron pudieran deshacerse y las hebms, de nuevo libres, pudieran
intentar
La reacción bimoiecuiar de renaturalización incluye dos fases o etapas:
- La fase de nuc/eación: supone el encuentro o choque de hebras Simples por
pequeñas zonas complementarias (a); se forman los primeros puentes de H
entre bases y el primer núcleo de renatura/ización; muchos choques son “no
productivos" y, si las condiciones lo permiten, los enlaces de H fermados
pueden deshacerse y las habras separarse para intentar nuevos contactos:
-La fase de cierre: supone la extensión de Ia estructura en dcble hélice.
desde el nucleo inicial y en ambos sentidos (b y c). hacia los dos extremos.

Figura 4.2. Renaturaiización de estructuras bicatenarias.

Sin embargo, el mecanismo clel proceso es mucho mas complejo que en el caso de la sepa-

ración progresiva cle cadenas. La renaturalización se trata de una reacción bimolecular en don-
de dos moléculas han de “encontrarse” e r'niemccionar correctamente. Lo primero supone
que

a concentración de moléculas es un parámetro fundamental en la velocidad cle la renaturali-

zación. Lo segundo plantea problemas practicos: cuando dos hebras polinucleoticlicas chocan,
interaccionarán y quedaran enlazadas a traves (le los primeros puentes de hidrógeno que se
lormen, pero, lo mas probable, es que esa primera unión no sea adecuada y, cuando a partir
(le ese pn'mer núcleo de reiratziraiz'251C1'óiz el proceso se extienda a otras zonas (le las
cadenas,
antes o después se alcancen regiones no complementarias. Ese conato (le cloble hélice no pro-
gresará; el choque inicial fue no fructífero. Y esa molécula, parcialmente en doble hélice. par-
cialmente en hebra simple, no podrá recuperarse para el proceso, salvo que aquellos prime-
ros enlaces que se fommron pudieran deshacerse y las hebms, de nuevo libres, pudieran
intentar
88 lngeníer/a Genética. Volumen! '

nuevos choques. En'la practica esro se puede conseguir siempre que la variación de las con-
diciones que fuerzan la renatumlización (disminución de la tempemtura, ncutmlización, etc.)
sea suficientemente lenta y permita que las hebms puedan disponer de múltiples intentos en
la búsqueda de uniones fmczi'fems. De aqui que los medios en que se llevan a cabo las rena-
turalizaciones (e hibridaciones, como se verá) contengan una alta cantidad de agentes desna-
turalizantes (formamida. etc) y que la temperatura a que se incuba la disolución no sea dem:-
siado baja: estas condiciones, en el caso de las hibridaciones, marcan la “severidad”, el “rigor”
' (Sningency) de la reacción y de las etapas de lavado subsiguientes.

Si las condiciones experimentales son adecuadas, dos hebras polinucleotidicas con -

plementarias pueden llegar a reconstituir la doble hélice original. Y en ese caso, la veloc -
dad con que se consigue la rcnaturalización depende exclusivamente de la concentración
de dichas hebras; esto es la base del analisis de la cinética de rerzatura/izacío‘n. En una lar-
ga' molécula Cromosómica de DNA existen secuencias únicas, es decir, secuencias que no
se repiten a lo largo de todo el cromosoma. mezcladas con otras que aparecen en número
superior (en varias c0pias: secuencias repetidas). Si el DNA se fragmenta en trozos de tama-
ño más o menos parecido y no demasiado grande, y luego se desnaturaliza, las secuencias
repetidas apareceran en la disolución en una. concentración mayor que las secuencias úni-
cas, en una proporción igual a la que exiSte entre el número a’e copias de ambas secuen-
cias en el cromosoma original. Esto hará que las hebras que porten la secuencia repetida
renaturalicen mas rápido que las hebras que contienen las secuencias únicas: la determi-
nación de la cinética del proceso permite definir si existen secuencias repetidas y, en ese
caso, el número de copias o grado a’e repetición de las mismas. Este metodo permitió empe-
zar a conocer detalles de los genomas eucarióticos con anterioridad a la explosión de datos
que están arrojando las técnicas actuales de análisis molecular.

4.2.inbridac’ión entre ácidos nucleicos

La hibridación, en terminos generales,’ es la reconstitución de estructuras bicatenarias 'a

partir de moléculas monocatenarias de distinto origen y con secuencias más o menos com-
plementarias. La reacción se lleva a cabo con diferentes moléculas persiguiendo objetivos
distintos (figura 4.5): '

a) Hz‘bn’dación entre DAM: bererólogos: ssDNAs de distintas fuentes reasocian para for-
mar un DNA híbrido, estructurado en doble hélice en aquellas regiones que tengan
secuencia complementaria y formando burbujas en el resto. El análisis estructural
del híbrido permite deducir el porcentaje de doble hélice en la molécula, lo Que, a
su vez, es índice del grado de complementariedad de ambas cadenas. Mediante el
aislamiento de DNA de dos especies biológicas, su desnaturalización y posterior hibri-
dación, se puede estudiar el grado de semejanza de sus genomas y deducir relacio-
nes filogenéticas entre ambas. Hoy en dia, la enorme cantidad de datos de secuen-
cia acumulados permite un abordaje más concreto del estudio de filogenias, basado
en la comparación de secuencias de genes homólogos particulares.

b) Hibridación entre DMA y mRNA: los mensajeros son uanscn'tos a partir de sus genes y,
obviamente, encuentran regiones complementarias en el DNA genómico desnaturali-
Cap/tu/o 4: Técnicas de hibridación de ácidos nucleicos

89
xx

ado. De forma análoga al caso de la renztturalización del DNA, e

ca (la hibridación DNA:mRN/\ permite estudiar una población de mlLNAs y definir su
complq’idad. Por otro lado, la existencia y número de intrones en genes eucariotas pue-
de deducirse del análisis, mediante microscopia electrónica o digestión enzimática. (le
la molécula híbrida formada por el DNA génico y su RNA mensajero.

c) Hibn'dacz’ón preparatim entre una secuencia (¡e DNA y una población de Ill/CVAS‘.
las técnicas actuales, como se verá más adelante, permiten disponer del DNA de un
gen aislado; una hibridación frente a la población completa de mensajeros permite
el aislamiento de aquel mRNA que fue transcrito a partir del gen en cuestión; tras
liberarlo del hibrido, su posterior traducción in vitro producirá la proteina corres-

pondiente, que podrá ser estudiada en detalle. Basándose en la capacidad de la hibri-

dación para reconocer secuencias de nucleótidos, se dispon

ratiuo especifico de secuencia. Este procedimiento es conoc

bíbn‘do (hybrid selection).

91
y ' A ..
k Capitulo 4: Técnicas de hibridación de ácidos nucieicos 91
x.‘
“' actividades provoca la elongación del oligonucleótido que actúa como cobra/oro
\- primary la sintesis de una cadena complementaria a la inicial (que actua como moi-
; ¡(leo temp/ale). De nuevo, la especificidad de secuencia que está en la base dc la
g hibridación permite dirigir la acción de una actividad enzimática :t una región espe-
x cifica de una hebra polinucleotídica. Esta reacción, como se vera. es la base de una
y gran variedad dc metodos analiticos y preparativos (analisis de SCCLlCflCtLl, pri/nor
\’ ¿av/ensiort, PCR, etc.).
yx a) Hibrz‘dación entre una población de DNA (o RNAJy un o/igomzcleótido marcado
g (sonda): de igual manera que en el caso anterior, el oligonucleótido hibridarzi con
y la(s) región(es) complementana(s) que localice en la mezcla de moleculas de la pobla-
, ción en cuestión (previa desnaturalización de todos los componentes). En este caso,
“Y el proceso no va mas alla: si el oligonucleótido se encuentra marcado de alguna manc-
“ ra (por incorporación de isótopos radiactivos, por ejemplo), la molécula con la que
k haya formado hibrido podra ser detectada entre toda la población inicial. El oligo-
a. nucleótido actúa como una sonda capaz de “señalizar” una molécula entre muchas.
e, permitiendo su deleccióny aislamiento. Por otro lado, esta es la base de las tecnicas
k de hibridación in situ sobre cromosomas enteros, responsables del gran desarrollo
experimentado por la citogenética molecular.
a.
k La reacción de hibridación es la base de una serie muy diversa de experimentos que per-
k siguen diferentes objetivos:
y
y 4 El estudio de la complejidad de una población de mensajeros. basado en el analisis
kr ; cinético del proceso. l . ' h
— El establecmuento de relaCtones filogeneticas por análisrs del hibrido.

\" - La determinación del número y posición de intrones de un gen, mediante el estudio

k estructural del hibrido DNA-mRNA.
es — La amplificación de fragmentos especificos de DNA por PCR, tras la hibridación de
\_ i un cebador.
, - La detección y aislamiento de una secuencia determinada a partir de una mezcla com-
p ’ pleja, por formación de un hibrido con una sonda.
k.
x- I Algunos de estos objetivos hoy son alcanzables mediante métodos más eficaces; otros
KV se estudiarán mas adelante. El último de ellos es de un alcance enorme ya que permite la
w í detección, identificación y aislamiento de secuencias nucleotidicas determinadas, incluso a

partir de mezclas de gran complejidad; este abordaje experimental va a ser estudiado a con-
“ tinuación.
\.’ J
x,
x, 4.3. Transferencia de cadenas de ácidos nucleicos a soportes sólidos
É ' Para poder aprovechar la posibilidad que ofrece la hibridación, a saber. la detección de
' Lt una molécula con una secuencia de bases especifica entre las presentes en una mezcla mas
\_ o menos compleja, se requiere previamente la fijación de los componentes de la mezcla en
y. un soporte sólido, con el fin de poder posteriormente relacionar una señal positiva con una
92
92 Ingeniería Genética. Volumen /

de las moléculas de la mezcla. Éstas han de ser fijadas en estado monocatenario para que
puedan formar un hibrido correcto con la sonda.
Los tipos de soportes capaces de retener estructuras monocatenarias más utilizados son:

— Los/iliros de nin-oceluiosa son el soporte clasico; las moleculas de DNA o RNA des-
natumlizadas se unen por fuerzas hidrofóbicas y, posteriormente, se fijan a él median-
te secado a vacio en estufa. Tienen el inconveniente de estropcarsc bastante en el
tratamiento (se hacen muy frágiles tras el secado) y de perder parte de las hebras un:-
das durante la etapa de hibridación.

— Las membranas de naiion, introducidas posteriormente, son dc un material mucho mz" s

’ ' duradero, lo que permite su utilización múltiple en hibridaciones con diSLintas sondas;
además, mediante iluminación con luz ultravioleta de 254 nm, las hebras polinucleoti-
dicas quedan covalentemcnte unidas a él, lo que evita perdidas a lo largo del proceso.

Las moléculas de la mezcla que va a ser explorada pueden encontrarse:

— 'En el interior de las células de un cziln’uo, siguiendo el procedimiento que se des-
cribe a continuación, se puede llevar a cabo el análisis de todas las secuencias de
DNA presentes en cada una de las células de un cultivo bacteriano. El cultivo se siem-
bra, diluido, en placas con medio sólido; tras el crecimiento de colonias aisladas, su
DNA es transferido y fijado a un filtro que se coloca en condiciones de hibridación
con una sonda marcada. La detección del marcaje identificará la colonia con la secuen-
cia buscada.

- En los balas de lisis de un cultivo infectado, como se verá más adelante, los bacte-_
riófagos son herramientas extensamente usadas en ingenieria Genética. La detección
de alguna secuencia particular en una población de fagos se logra mediante infec-
ción y siembra de 'un cultivo bacteriano en medio sólido y a una dilución adecuada.
Las células infectadas dan lugar a balas de lisis (o placas defagos), cuyos ácidos
nucleicos pueden ser transferidos a un soporte sólido de manera análoga a lo que se
hace con colonias aisladas.-

— En el interior de un gel en el que las moléculas de la mezcla han sido previamente

separadas por electroforesis; su transferencia por capilaridad a un soporte sólido, fija-
ción e hibridación en condiciones apropiadas con unasonda en disolución, permi-
tira identificar la banda electroforética donde se encuentra la secuencia en cuestión.

4.3.1. Transferencia del DNA de colonias bacterianas y de ha/os de lisis

Este procedimiento permite el análisis (screening) de un cultivo baCteriano para detec-

tar en él las células que contienen una determinada secuencia de DNA (figura 4.4). Se basa
en la lisis in situ de las colonias bacterianas sobre el filtro que actúa de soporte, y en la fija-
ción del DNA celular al mismo. Permite analizar cientos de miles de colonias a la vez. Es
una etapa esencial en el aislamiento de secuencias clonadas (capitulo 15).

El cultivo se siembra en placas Petri sobre un medio sólido adecuado, tratando de con-
seguir una dilución tal que, cuando las células crezcan den lugar a colonias suficientemen-
94
94 Ingeniería Genética. Volumen l

- Medio de lisis (SDS al 10%); la célula lisa y su DNA queda accesible.

- Disolución desnaturalizante (NaOl-I 0'5 N, NaCl 1'5 M); el DNA se hace monocate-
nario y se fija a la membrana.

- Disolución neutralizante (NaCl 1'5M,Tris-HC1, pH 7'4).

-— Disolución de lavado (solución 2 x SSC: NaCl 0‘3 M, Na-citrato 0’03 M); se eliminan
restos celulares.

Despues, las membranas se secan al aire yen una estufa de vacio con lo que las hebras
de DNA quedan fijadas a ellas. Asi las membranas estan ya listas para su hibridación con la
sonda.

La transferencia de halos de lisis sigue una mecanica totalmente análoga, con la salve-
dad de que no es necesario lisar las células.

4.3.2. Transferencia de DNA o RNA de bandas electrofore'tícas

De esta manera se pueden analizar distintos fragmentos o incluso moléculas de DNA o

RNA, previamente separados por electroforesis en gel, y detectar entre ellos a los que incor-
poran una secuencia determinada. El método fue descrito por primera vez para el caso del
DNA por E. M. Southern en 1975 y, como se verá, es la base de uno de los procedimientos
analíticos mas utilizados; hoy se conoce por el nombre de su autor: transferencia de Southern
(Soul/Jer): blotting). Posteriormente se desarrolló-la tecnica análoga para la transferencia de
moleculas de RNA a un soporte sólido, que es hoy conocida como northern blom'ng. Por
extensión de esta linea de nomenclatura, la transferencia de proteínas separadas por electro-
foresis en gel a un soporte sólido (filtro de nitrocelulosa, membrana hidrofóbica, etc.) recibe
el nombre de western; en este caso, el análisis posterior de las moléculas transferidas se lleva
a cabo mediante reacción con anticuerpos contra la proteina que se' busca. Asi se completa
un conjunto de metodos que permite el estudio de la presencia (Sour/porn), transcripción
(non/Jem) y traducción (¿L'C’SIC’NÜ de una secuencia génica. Existe incluso otro método rela-
cionado denominado south-western que incluye la transferencia de proteinas separadas por
electroforesis y la incubación del filtro con una sonda marcada de DNA; una señal positiva
indica una unión especifica del DNA de la sonda con una de las proteinas del filtro.

Existen tres métodos para transferir las moléCulas presentes en las bandas electroforeti-
cas. desde el gel de agarosa hasta el soporte de nailon o de nitrocelulosa, sin que se modi-
fiquen sus posiciones relativas: ‘

n) Transferencia por capi/arin’nd (sou/born o northern Mor/ing): las moléculas de {ici-

do nucleico son arrastradas desde el gel hasta el soporte sólido en contacto con él,
gracias al flujo capilar originado por la acción absorbente de una pila de papeles
(figura 4.5). El peso colocado sobre ella ayuda al mantenimiento del flujo y, al mis-
mo tiempo, fuerza la salida del liquido del interior del gel que queda al final deshi—_
dratado y reducido a una fina capa de agarosa. En el caso del DNA, los fragmentos
que se van a transferir son previamente desnaturalizados en el propio gel sumer-
giendolo en una disolución adecuada, de forma que cuando alcancen el filtro o mem-

96

95 /ngen¡er/a Genética. Volumen l

purinizados) en el interior del propio gel y antes de proceder a su transferencia que,

de esta manera, se consigue con mucha mayor rapidez y eficacia.

b) Transferencia electroforén'ca (electrorransfer): este método se basa en la mOVilidad

de las moleculas de ácido nucleico en un campo eléctrico para forzar su salida del
gel y su transferencia al soporte sólido. Las membranas de nailon son el soporte mas
efectivo en este caso. El gel. tras su tratamiento en medio desnaturalizante, se colo-
ca en contacto con la membrana, y ambos se colocan entre dos placas de material
poroso antes de someter al conjunto a un campo electrico normal a su superficie. El
tiempo necesario para una transferencia completa depende del tamaño de las mole-
culas que se transfieren, de la dureza (concentración de agarosa) del gel y del volta-
je aplicado. La eliminación del calor producido por el paso de corriente suele con-
seguirse por refrigeración de la cubeta de transferencia. La eficacia es buena incluso
para moléculas relativamente grandes por lo que no suele ser necesario fragmentar-
las previamente por despurinización.

c) Transferencia a vacío: el gel se pone en contacto con el filtro y este se coloca sobre
una placa porosa de una cámara de vacío; desde un depósito superior, la solución
de transferencia fuerza a las moléculas a abandonar el gel y quedar retenidas en el
filtro. De esta manera, fragmentos tanto de DNA como de RNA son transferidos a un

_ soporte sólido rápida y eficientemente. En el mercado existen diferentes aparatos

que permiten este tipo de transferencia. '

4.4. Marcaje e hibridación de sondas a ácidos nucleicos

inmovilizados en soportes

Una vez fijadas las hebras polinucleotidicas al soporte sólido, es necesario utilizar un
método de análisis o “revelado” que permita identificar a la secuencia buscada. Para ello se
utiliza otra hebra- polinucleotidica, de estructura conocida y complementaria a la que se per-
sigue, y que púeda ser localizada posteriormente, es decir, que se encuentre “marcada”.
Esta hebra procede de una molécula denominada sonda, disponible en estado puro y que -
se desnaturaliza justo antes de su adición al filtro al que se han adherido los componentes
de la mezcla original, con el propósito de conseguir su unión específica a la molécula bus-
cada mediante hibridación. I

El procedimiento clásico para marcar una molécula polinucleotídica con vistas a su

empleo como sonda consiste en incorporar en ella algún isótopo radiactivo. Para eso pue-
den utilizarse distintas reacciones enzimáticas (expuestas con detalle en el capitulo 7):

. - La DNA-polimerasa I de Escherichia colz'cataliza la incorporación de dNMPs a una

molécula de dsDNA con muescas, a partir de sus dNTPs precursores (reacciones [7.29]

y [7.30] en el capitulo 7). Esta reacción, conocida como desplazamiento de muesca

. o nick translation, se puede llevar a cabo con uno de los cuatro dN’I'Ps marcado con

el isótopo 32P en la posición a (lor-¿ZPldNTPL lo que lleva a la incorporación de 32P

al interior de la cadena azúcar-fosfato de la molécula. Ésta habrá sido sometida pre-

. viamente a un tratamiento muy suave con DNasa para la producción de muescas en

posiciones aleatorias desus cadenas (véase el capitulo 7, sección 7.1).
97
Capítulo 4: Técnicas de hibridación de ácidos nucleicos 97
rxx
.. Otras actividades de DNA-polimerasa (el fragmento Klenow, las polimerasas de los
fagos T4 o T7) son utilizadas para la incorporación de precursores [aJll’ldNTl’ a termi-
nales 3’retraidos o protuberantes de moleculas de dsDNA, en un proceso de marca} r
de extremos o ent! label/¡ng (reacciones [7431])» [7.33] en el capitulo 7). La desoxinu-
cieotidii terminal-transferasa y la polifA)-polimerasa también se usan para incorpo-

rar nucleótidos con 52P a moléculas de DNA o RNA.

— Mediante incubación con la polinucleótido-quinasa del fago T4 y [y-“PJATI’, los extre-

mos 5 ’OH de un dsDNA resultan fosforilados con restos de fosfato con "3P. Para con-

seguir esos extremos 5 ’con OH libre a partir de un DNA con fosfato en 5’, se utiliza
la fosfatasa alcalina.

La sonda, una vez marcada, se desnaturaliza y añade al medio de hibridación donde se

encuentra el soporte sólido con las moléculas polinucleotidicas fijadas, y se procede a la
incubación adecuada para la hibridación. Tras los posteriores lavados para eliminar el exce-
so de sonda, el filtro se somete a una autorradiografía colocándolo en contacto con una
pelicula de ray/os X; las posiciones ocupadas por la molécula buscada habrán retenido la
sonda por hibridación e impresionarán la película. Tras su revelado, la comparación de

pelicula, filtro y fotografia del gel u original de la placa con colonias permitirá identificar

la banda o colonia en que se localiza la molécula que se persigue. Existen en el mercado

unos equipos de detección‘basados en una pantalla que captura la radiación, detecta los

puntos emisores y transmite el resultado a un software que lo digitaliza; son caros pero
acortan el proceso de “revelado”.

Ultimamente s'e están imponiendo métodos para el marcaje no radiactivo de sondas de

DNA, mediante la incorporación a su molécula de grupos quimicos (biotina, fluoresceína,

digoxigenina, etc.) que pueden ser detectados en ensayos especificos (reacción con anti-
cuerpos, fotometria, ete).

Para llevar a cabo la hibridación con la sonda se siguen distintas vias, todas ellas varian-
tes o matizaciones de una reacción general. Los factores fundamentales del proceso son:

- El medio de bz’bn’dacz'óny la temperatura son los que marcan la estabilidad de los

enlaces de hidrógeno formados. A unatemperatura alta los puentes son muy inesta-
bles, se rompen facilmente y las uniones no fructíferas por regiones no correctas pue-
den revertir; pero la velocidad de hibridación es lenta. El mismo efecto se consigue
con la presencia de agentes desnaturalizantes (por ejemplo, formamida) en el medio.
Unas condiciones medias pueden ser: 68 °C en medio acuoso, o 42 °C en una diso-
lución de formamida al 50%. La fuerza iónica del medio favorece las interacciones al
reducir la repulsión entre restos de fosfato cargados y aumenta la velocidad del pro-
ceso; el medio suele ser la llamada solución salina citrato (SSC: NaCl 0'15 M; Na-
citrato 0'015 M) cinco o seis veces concentrada (5 >< SSC o 6 >< SSC).

El volumen de la reacción y 1a presencia de agentes excluyentes (polímeros) afec-

tan a la velocidad del proceso; si el volumen es pequeño, la concentración de

ambas hebras es mayor y, por tanto, la hibridación es mas rápida. La presencia

de polímeros como el sulfato de dextrano o el polietilenglicol acelera la reacción,

ya que las moléculas de ácido nucleico son excluidas del volumen ocupado por

el polímero, con lo que su concentración efectiva aumenta. Sin embargo, su pre-

98
98 Ingeniería Genética. Volumen l
____________________________________—— _

sencia suele dar mucho fondo, por lo que su uso se suele reservar para casos
extremos.

— El uso cie agentes bloqzzeanles: su presencia bloquea la unión inespecifica de la son-

da al filtro o membrana, lo que aumentara la relación señal/fondo. Agentes clasicos
son la heparina, la leche en polvo desnatada o el reactivo de Denhardt, que contie-
ne l‘icol, polivinilpirrolidona y albúmina de suero bovino. Estos reactivos se suelen
usar junto con DNA fragmentado y desnaturalizado de salmón o levadura y algun

detergente como SDS.

-' La severidad (sm‘ngency) del lavado.- tras la hibridación, el exceso de sonda debe

ser eliminado mediante lavados cuva fuerza o severidad viene definida por la
temperatura y por la concentración de formamida y sal; un lavado poco estricto
o poco severo dejara mucho fondo, a causa de la unión inespecifica de la sonda
al filtro o a hebras con un bajo grado de complementariedad, mientras que un
exceso de lavado podria disminuir la señal. Las condiciones deben ser tan seve-
ras cómo sea posible; en muchos casos se han de fijar empiricamente en experi-

mentos previos.

El experimento se suele realizar en bolsas de plástico herméticamente cerradas (sella-

das al calor) y en un baño de agua con agitación suave, o en tubos cerrados con tapón colo-
cados en un rotor y en el interior de una estufa. El filtro o membrana se coloca en el inte-
rior de la bolsa o del tubo, donde se añade suficiente medio como para empaparlo
perfectamente e incluso cubrirlo algo. El proceso suele incluir tres etapas:
- Pre-bibn’dación: donde el filtro o membrana se incuba en el medio y a la tempera-
tura de hibridación, pero en ausencia de sonda; asi, la mayoria de los centros de
unión inespecifica son anulados por los agentes bloqueantes y las hebras polinucleo-
tidicas fijadas se preparan para lainteracción con la sonda.

— Hibn‘clación: la incubación se repite en idénticas condiciones que antes, pero ahora

en presencia de la sonda marcada, previamente desnaturalizada, con el fin de que
se una especificamente a la secuencia complementaria.

- Lavar/os: su grado de severidad o fuerza es un punto importante para conseguir una

buena relación señal/fondo; en esta fase se elimina la mayoria de la sonda unida ines-
pecificamente, pero se mantiene la mayoria de la sonda unida a la(s) hebra('s) con
secuencia complementaria.

Una vez finalizados los procesos de pre-hibridación, hibridación y lavados, el filtro ha

tratarse adecuadamente para revelar la presencia de la sonda marcada, bien mediante
exposición a una pelicula de rayos X, si el marcaje es radiactivo, bien siguiendo algún
otro camino. Tras el revelado, la(s) señal(es) positiva(s) marcara(n) la presencia de mo-
léculaCs) con secuencia complementaria a la de la sonda. Si la etapa de transferencia y
fijado al soporte se ha realizado adecuadamente, las posiciones relativas de los fragmen-
tos de ácido nucleico se habran conse 'ado y eso permitira correlacionar la señal positi-
va con alguna de las bandas electroforeticas originales o con alguna de las colonias cre-
cidas en medio sólido,

99

4.5. Aplicaciones de la hibridación

La hibridación de sondas marcadas con polinucleótidos inmovilizados sobre soportes

sólidos presenta múltiples aplicaciones analíticas y preparativas, entre las que se pueden

destacar:

-— 1.a detección de secuencias genómz‘cas: la hibridación permite definir la presencia o

ausencia de una secuencia en un DNA gcnómico siempre que se disponga de algu-
na otra secuencia mas o menos homóloga que pueda funcionar como sonda. El pro-
cedimiento supone el aislamiento del DNA total de un cultivo, tejido u organismo
completo, su rotura enzimática y separación de fragmentos mediante electroforesis,
la transferencia de éstos a un soporte sólido, por ejemplo mediante Soul/Jem bloz-
Mag, y la hibridación del filtro con la sonda, previamente marcada; el revelado pos-
terior permite detectar la existencia de la secuencia homóloga a la sonda y el tama-
no del fragmento cromosómico donde se localiza. Éste es el paso inicial para el
posterior aislamiento de secuencias genómicas. Ademas, la posibilidad de detectar
secuencias especificas, incluso en una mezcla de gran complejidad, es la base de pro-
cedimientos analíticos de gran valor en medicina forense (la bue/la genérica) y pre-
ventiva (análisis genético prenatal) que se estudiarán mas adelante. l

— La detección de secuencias en colonias bacterianas: tras un clonaje tipico, se requie-

re aislar aquella colonia bacteriana donde se encuentra la secuencia objeto del expe-
rimento. Una manera de conseguirlo consiste en sembrar el cultivo en medio sólido
y a una dilución adecuada; tras la incubación procedente, cada célula bacteriana
habrá dado lugar a una colonia (un clon). Se toman filtros de esas placas y el DNA
de cada colonia es desnaturalizado y fijado al soporte (colony blom’ng); la hibrida-
ción de estos filtros con una sonda adecuada, permitirá detectar la colonia buscada:
se dispondrá de un clon en el que todas las células son portadoras de la secuencia;
se habríi'logrado el clonaje de la secuencia en cuestión.

— La detección y análisis de mRNAs: la población de mensajeros en un cultivo bacte-

riano o en un tejido u órgano eucariota suele tener una notable complejidad. Su ana-
lisis electroforético produce imagenes difusas en las que resulta muy dificil identifi-
car moléculas especificas de mRNA. Pero la transferencia a un soporte sólido de las
moléculas separadas en gel (northern blom'ng), seguida de su hibridación con una
sonda marcada (procedente, por ejemplo, de un determinado gen), permite definir:
a) si el mensajero esta o no presente (es decir, si el gen en cuestión se expresa en ese
cultivo, tejido u órgano); b) su concentración en la población (el nivel, alto o bajo, de
su expresión); y c) el tamaño que presenta. El estudio de la expresión génica dife—
rencial en tejidos eucariotas tiene una herramienta esencial en este conjunto de meto-
dos. El analisis de operones, el estudio de promotores o de la maduración (sp/1'cing)
de precursores de mensajeros son otros temas que se apoyan en esta técnica.

— La detección de mRNAs en Iisaa’os celulares (dor blot); es un procedimiento menos

sofisticado que el anterior pero que resulta práctico en algunos casos. Sin necesidad
de separar las distintas especies de mRNAs mediante electroforesis, la hibridación
con una sonda adecuada se puede realizar sobre gotas de lisado celular de distintos
origenes, previamente aplicadas sobre un soporte (filtro, membrana). Una señal posi-

100
100 Ingeniería Genética. Volumen /

tiva permite concluir la presencia del mensajero complementario a la sonda. aunque,

evidentemente, el a álisis no puede ir más alla.

4.6. Microchips de DNA

Una modalidad muy particular del proceso de hibridación entre una mezcla de secuen»
cias y un conjunto de sondas es la base de la reciente tecnologia de los denominados micro-
cbtps de DNA (biocbips o DNA microarrays). En esta sofisticada versión de la hibridación
se han incorporado ciertas modificaciones para permitir su aplicación a mezclas muy com-
plejas de secuencias. '

La sonda múltiple es un conjunto de fragmentos de DNA, de secuencia conocida, fija-

dos covalentemente a una superficie sólida, en la que son dispuestos en forma de matriz,
cada uno en una posición determinada. Esta pieza consrituye el microchip. La mezcla de
secuencias a analizar se marca previamente con uno o varios iluoróforos para su posterior
detección, se desnaturaliza "y se pone en contacto con el chip en condiciones que favore-
cen la hibridación. La “lectura” de la superficie del microchip se lleva a cabo con fluorime-
tros por barrido con láser. La detección de señal en una posición particular de la matriz per-
mite concluir la presencia en la muestra de DNA analizada de una secuencia complementaria
al fragmento sonda fijado en esa posición. Delhpatrón de hibridación observado se puede
deducir la complejidad de secuencias de la población estudiada.

El soporte sobre el que se fija el DNA puede ser de diferentes tipos de material; asi se
encuentran chips construidos sobre cristal, membranas de nailon o silicio. la aplicación de

alas técnicas de la microelectrónica al campo de la Ingenieria Genética, en lo que se ha dado

v en llamar nanobíotecnologi'a, ha facilitado el desarrollo de la construcción de esros micro-
chips de DNA. '

En la actualidad existen dos formatos de chips que se diferencian en función de la natu-

raleza de la sonda inmovilizada en su soporte. El que exige una tecnologia menos comple-
ja utiliza un brazo robot dirigido por ordenador para depositar con precisión secuencias
monocatenarias catalogadas de CDNA o DNA genómico sobre un soporte de vidrio. Un
ejemplo de este tipo de microchip es el construido inmovilizando más de 6.000 secuencias
procedentes de marcos abiertos de lectura (ORFs) del genoma de Snccbaromyces cerevi-

isiae. Estas sondas se depositaron en una matriz de 80 x 80 puntos, en una superficie que
no llega a los 4 cmz. Este chip se utilizó para estudiar los perfiles de poblaciones de mRNA
aisladas de cultivos de levadura crecidos en diferentes condiciones. ‘

Otros chips se construyen mediante la inmovilización de oligonucleóticlos que pueden

haber sido sintetizados previamente por tecnologias convencionales. o que se sintetiza ‘1
directamente sobre la superficie del propio soporte en el que quedan fijados. Las técnicas
de fotolitografïa, utilizadas en la construcción de semiconductores, se han aplicado a la sin-_
tesis de oligonucleótidos in situ, en placas de vidrio no más grandes de 1 cm2 que pueden
contener una matrizde un millón de oligonucleótidos distintos. Esto permite trabajar con
sondas complejas con unas 107 moléculas distintas, Los oligonucleótidos sintetizados por
técnicas convencionales también se han llegado a inmovilizar mediante la aplicación de
robots en una densidad de hasta‘SODOO oligonucleótidospor__centimetro cuadrado. Apli-
cando una tecnologia un poco más sofisticada se han desarrollado verdaderos chips elec-

Capítulo 4: Técnicas de hibridación de ácidos nucleícos 101

M

irónicos, y así, utilizando un chip dc silicio de 1 cm2 como soporte, se puede crear una matriz
dc 25 microcleCtrodos donde se deposita el DNA específico mediante la creación de un
potencial positivo. .
Las aplicaciones de los microchips son múltiples pero fundamentalmente se han dise-
nado para el análisis genético. Con estos chips se pueden estudiar los niveles de expresion
génica en diferentes organismos, incluido el hombre, donde encuentra una aplicación exce-
lente para el diagnóstico de enfermedades. La posibilidad de construir chips “por encargo"
abre la via al análisis de mutaciones; la construcción de sondas de oligonucleótidos que se
diferencian exclusivamente en la naturaleza de una base permite detectar diferencias cuan-
titativas en la hibridación y deducir de ello la presencia de alelos específicos. Otras posibles
aplicaciones de los chips se centran en la construcción de mapas genómicos y en la secuen-
ciación de fragmentos de DNA (véase también la sección 4.8: Más sobre el tema).

4.7. Un caso real: “Los puntos cardinales"

Dos biólogos moleculares mantenían una extraña conversación comentando algo sobre
Sortrberns, northern; westerns y soutb-westerns como si intentaran localizar algún recóndi-
to lugar en alguna parte del planeta. Pero la historia de estos sugerentes nombres que nada
tenía que ver con la geografía comenzó alla por el año 1975 cuando un investigador del
Departamento de Zoología de la Universidad de Edimburgo publicó en la prestigiosa revis-
tajournal of Molecular Biology una nueva tecnica que servía para detectar secuencias espe-
cíficas entre distintos fragmentos de DNA previamente separados mediante una electrofore-
sis en un gel de agarosa (1). Este investigador se llamaba Edwin Southern y probablemente

' poco podía imaginarse que su trabajo sería uno de los más citados en el campo de la biolo-

gia molecular durante el último cuarto del siglo xx y que su nombre quedaría ligado a la his-
toria de la Ingeniería Genética por el diseño de esta metodología. Como sucede con todas
las técnicas geniales, se trata de una técnica muy sencilla y, por ello, son muy pocas las varia-
ciones que se han introducido hasta la fecha con respecto al procedimiento original. En esen-
cia, en este trabajo, elanálisis comenzaba por cortar el DNA con enzimas de restricción, que
por aquellos años no podían cbmprarse en el proveedor habitual y que generalmente se
obtenían como regalo de algún buen amigo que las había purificado a partir de extractos de
Escherichia coli'CEcoRI) o Haemophilus aewptíus (HadIl). Los fragmentos de DNA se sepa-
raban por electroforesis en un gel de agarosa y después de ser teñido y visualizado con bro-
muro de etidio. el gel se cortaba con una cuchilla en finas tiras horizontales que eran some-
tidas al proceso de transferencia del DNA previamente desnaturalizado. Este DNA
desnaturalizado pasaba por capilaridad desde el gel a un papel de nitrocelulosa utilizando
un artilugio muy similar al que se ha descrito en este capitulo. Una vez transferido y fijado
el DNA al papel mediante la aplicación de calor se procedía a la hibridación con ácidos nuclei-
cos marcados radiactivamente. Dado que por entonces aún no se habían puesto a punto las
modernas técnicas de marcaje de fragmentos de DNA que ahora conocemos y mucho menos

se disponía de oligonucleótidos sintéticos. en estos primeros experimentos la hibridación se

llevó a cabo utilizando RNA ribosomal mar ado radiacavamente con “P.

Cuando se analiza la técnica de Sourben: en su contexto temporal puede apreciarse que

la idea no surge de la nada, sino del ensamblafe c'e otra serie de procedimientos ya en uso.