FORMATO GUIA PARA PRÁCTICA DE LABORATORIOS DE

BIOQUÍMICA II
Título de la práctica

HEMOSTASIS DE LA GLUCOSA
Fecha
inicio de Fecha fin de práctica Taller No 1
práctica
Proyecto
Bioquimica Nivel 1 No de guía 1
Formativo
MSc. David
Erazo
Número de horas 2 horas 3 grupos-Quito
Docente Dra. Marlene
destinadas a simulación 3 horas 6 grupos-Ambato
López
Dr. Manuel Cruz
Dimensió
n
Modalidad Presencial
procedim
ental
Recursos

Videos
Biblioteca virtual
Equipos
Centrífuga
Baño María / termobloque
Espectrofotómetro
Micropipetas

Materiales/Software
 Torniquete
 Guantes
 Adaptador para tubos-Vacutainer: Se utilizan para tubos al vacío (campana para extracción al vacío)

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  Alcohol Antiséptico
 Torundas
 Agujas: Están numeradas dependiendo de su calibre. Para colección de sangre para hemogramas, se
recomienda una aguja de un diámetro de 0.8 mm (21G) para evitar daño a las células. Las agujas de 0.9 mm a
1.1 mm de diámetro (20G – 19G) se utilizan normalmente para punción venosa en adultos.  Adaptador para
tubos-Vacutainer: Se utilizan para tubos al vacío.
 Tubos recolectores: Los tubos están predeterminados para llenarse con un determinado volumen de sangre por
vacío. El tapón de caucho está codificado por color, de acuerdo a su uso o sus aditivos. Para medición de
glucosa se empleará tubo tapa roja, amarilla y en casos especiales tubo tapa gris
 Puntas azules y amarillas para micropipetas

 Banda Adhesiva
 Tubos de vidrio de 5 mL
 Gradilla

Reactivos/soluciones
 Reactivo de trabajo (GOD, POD)
 Aminofenazona
 Fenol

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  Estándar

Objetivo
General.
Determinar en el suero sanguíneo la glucosa, utilizando estándares establecidos
Específicos.
1.- Establecer la importancia de los carbohidratos en la producción de energía metabólica celular.
2.- Relacionar la alteración del metabolismo de los hidratos de carbono con el desarrollo de la Diabetes Mellitus.

Fundamento teórico

INTRODUCCIÓN

Los carbohidratos son una fuente de energía para la mayoría de organismos vivos. Tejidos como el cerebro necesitan de
glucosa en forma permanente, y su deficiencia o exceso ocasiona graves trastornos. Las concentraciones elevadas y
persistentes de glucosa pueden ocasionar ceguera, falla renal y enfermedad vascular periférica crónica. Una baja
cuantía de glucosa a su vez puede causar convulsiones y aun coma.

METABOLISMO FETAL

Dada su importancia en pediatría nos referiremos brevemente al metabolismo de los carbohidratos en el feto.

La glucosa, el lactato y los aminoácidos son los principales sustratos para el metabolismo y el crecimiento fetal. La
glucosa de la circulación materna se transfiere al feto por difusión facilitada a través de la placenta, por lo que la
concentración de glucosa en el feto es aproximadamente las dos terceras partes de la concentración plasmática de
glucosa en la madre.

Las enzimas gluconeogénicas están presentes en el feto, desde la 10 semana de gestación. La glucosa utilizada por el
feto, está disponible para el metabolismo oxidativo fetal y es una fuente de carbono para almacenar glucógeno y para
la síntesis de otros compuestos orgánicos. En condiciones normales, del 60 al 70% de la glucosa utilizada por el feto es
oxidada a CO2.

La insulina está presente en el páncreas del feto humano, desde la octava semana de gestación. Como la insulina no
atraviesa la placenta, el incremento de los niveles de insulina en el último trimestre de gestación, puede reflejar un
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incremento de la liberación de insulina pancreática fetal. Sin embargo, el páncreas fetal parece ser menos sensible a los
cambios de concentración de glucosa que el páncreas del adulto. La secreción de insulina se aumenta por la
hiperglucemia fetal aguda.

Por su parte el glucagón está presente desde el comienzo del segundo trimestre, aunque en un feto normal y con
concentraciones de glucosa materna normal, no parece tener una función reguladora.

Por otra parte, la síntesis de glucógeno empieza al comienzo de la novena semana de gestación en el embrión
humano, y la mayor cantidad de glucógeno se acumula durante el último trimestre.

Se ha observado que los niveles de glucógeno en pulmón y músculo cardíaco declinan suavemente, cuando el feto se
acerca al término. El almacenamiento de glucógeno cardíaco puede servir como fuente de energía durante períodos de
estrés como por ejemplo en casos de asfixia fetal. Los contenidos de glucógeno hepático y muscular alcanzan al final de
la gestación de 3 a 5 veces los niveles de un adulto y forman un importante pool de reserva de energía para el feto y el
recién nacido. La síntesis de glucógeno hepático se regula en el feto por medio de la glucógeno sintetasa y la glucógeno
fosforilasa.

En el momento del nacimiento, se interrumpe el suministro de glucosa por la placenta y la glucosa sanguínea cae, de
modo que el glucagón comienza a aumentar con un pico máximo en las dos primeras horas de vida estimulando la
glucogenolisis hepática.

También hay cambios en las enzimas fetales. La hexocinasa fetal importante en la glucólisis, tiene una actividad 500
veces más elevada que en los adultos, disminuye en los últimos cinco de gestación llegando a valores de adulto a los 21
días después del nacimiento.

Por su parte la fructocinasa y la galactocinasa no tienen actividad en el hígado fetal con niveles bajos después del
nacimiento y alcanza un pico en el periodo de destete.

La principal forma de obtención de energía de los tejidos fetales es la glucólisis, y corno resultado de ello una alta
producción de lactato (90%) y solo el 10% da origen al acetil Co A. El lactato a su vez es una fuente de producción de la
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glucosa por el mecanismo cíe la gluconeogénesis.

GLUCEMIA Y MECANISMOS DE CONTROL

Una persona adulta de vida sedentaria, consume diariamente 200 a 300 g de glúcidos, 70-100 g de proteína y 60-90 g
de grasa, que corresponden a un requerimiento energético diario de 1600 a 2400 Kcal. Las reservas energéticas se
movilizan entre las comidas y durante la noche para mantener la glucosa sanguínea.

La disponibilidad constante de combustibles en la sangre se denomina Homeostasis calórica, la cual implica que el
nivel sanguíneo de combustible en equivalente de ATP, no cae debajo de cierto límite, independientemente de si la
persona se encuentra en un estado de buena nutrición o en ayuno

La homeostasis de la glucosa se logra mediante dos ajustes:

A) Regulación entre la captación periférica y la producción hepática de glucosa que mantiene niveles entre 70- 110
mg/dl.

B) Regulación hormonal por el mantenimiento de un balance entre liberación y acción de la insulina, por un lado, y
por otro las respuestas opuestas mediadas por el glucagón, catecolaminas, hormona del crecimiento y cortisol.

Hay que considerar que también ciertos fármacos son capaces de presentar entre sus efectos indeseables, alteraciones
de los carbohidratos como ocurre con los diuréticos, beta bloqueadores, simpaticomiméticos, corticoides y hormonas
sexuales.

Dado que la mayor parte de la glucosa es fuente exógena se reconocen dos períodos:

1. Estado post-prandíal en la que la disponibilidad de nutrientes es superior a la demanda, por lo que hay una síntesis
neta de la sustancia de reserva.

2. Estado post-absortivo (6-12 horas) en la que se produce una degradación neta de las sustancias de reserva
(glucógeno).

En el estado post-prandial, la concentración sérica de glucosa es elevada y la relación insulina/glucagón alto, a favor del
numerador.

La glucosa sumada a secretagogos como los ácidos grasos libres, cuerpos cetónicos y aminoácidos (que inducen la
liberación de calcio libre en el interior del acino pancreático), obran como un estimulador de las células beta del
páncreas que producen una pre -prohormona conocida como pre-pro insulina, de la cual se escinde el péptido señal de
23 a.a. para formar la pro insulina, la cual por acción de proteasas llega a constituir la insulina + el péptido C.

Cabe señalar que el incremento del calcio intracelular pancreático, se asocia a una elevación del ATP, promoviéndose la
activación de los canales iónicos de membrana que permiten la liberación de insulina.

Normalmente un páncreas funcional produce y libera diariamente 40 a 50 unidades de insulina, pero tiene cientos de

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unidades almacenadas bajo reserva.

La acción de la insulina involucra varios pasos posteriores a la unión de la hormona con sus receptores formados por 2
subunidades alfa extracelulares y 2 subunidades beta transmembrana y citoplasmática.

La insulina se une a la subunidad alfa y produce fosforilación de residuos de tirosina en las subunidades beta, lo cual
desencadena una cascada de fosforilaciones tanto del mismo receptor como de otras moléculas intracitoplasmáticas,
de las cuales la más importante es el denominado sustrato del receptor insulínico tipo 1 o IRS 1. Si por error metabólico
la fosforilación ocurre sobre residuos de treonina o de serina del receptor, lo que ocurre es una disminución de la
acción insulínica.

Toda esta cadena de eventos, inducen la translocación a la membrana plasmática de transportadores de glucosa (GLUT
4) hasta la activación de las vías metabólicas implicadas en el almacenamiento de las reservas energéticas.

La insulina cumple con cinco grandes efectos fisiológicos:

A. Inhibe la liberación de ácidos grasos del tejido adiposo (lipólisis)

B. Promueve la síntesis de glucógeno
C. Acelera el transporte de glucosa a través de GLUT 4, en el músculo y tejido adiposo
D. Activa la síntesis de triglicéridos en el tejido adiposos (lipogénesis)
E. Inhibe la síntesis de glucosa en el hígado (glucogénesis)

Es común; encontrar en la clínica, el término sensibilidad a la insulina, a la cual definimos como la relación entre el
grado de utilización de la glucosa plasmática y los cambios en la concentración de la hormona.

Una disminución en la acción de la insulina (resistencia a la insulina) puede producirse como consecuencia de una
alteración a nivel de pre o post-receptores, disminución del flujo sanguíneo tisular, alteración del transporte celular de
glucosa o defectos intracelulares del metabolismo (principalmente en el músculo esquelético). La toxicidad de la
glucosa en la hiperglucemia crónica puede alterar la secreción de insulina e inducir la resistencia a la insulina.

La disminución del nivel plasmático de la glucosa en rangos fisiológicos, conlleva la disminución de la secreción de
insulina. Si se producen disminuciones adicionales de la glucemia, se incrementa la secreción de las hormonas
contrarreguladoras: glucagón, adrenalina, cortisol y hormona del crecimiento que tienen efectos antagónicos a la
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insulina en hígado y tejidos periféricos.

Estos efectos típicos de un estado post- absortivo, son de comienzo rápido en el caso del glucagón y adrenalina y más
retrasado si se trata de cortisol y hormona del crecimiento. El glucagón tiene un potente efecto en la gluconeogénesis,
glucogenolisis hepáticas y movilización de reservas lipídicas. Las catecolaminas especialmente adrenalina, potencian la
secreción del glucagón, inhiben la actividad de la glucógeno sintetasa y estimulan la lipólisis, glucogénesis y
gluconeogénesis. Las catecolaminas además tienen un efecto alfa adrenérgico que limita la secreción de insulina y
predomina sobre el efecto beta adrenérgico (liberador de insulina).

Juntos catecolaminas y glucagón, movilizan las reservas energéticas en hígado, tejido adiposo y músculo esquelético,
para producir sustratos como glucosa y ácidos grasos libres para el metabolismo celular durante la hipoglucemia o
estrés.

El cortisol estimula la lipogénesis, la degradación proteica y la gluconeogénesis a tiempo que estimula la liberación de
adrenalina por la médula suprarrenal.

Por su parte la hormona del crecimiento tiene efectos sinérgicos y antagónicos con la insulina. El efecto sinérgico está
dado mediante la somatomedina C con efectos pro-insulínicos, mientras que es antagónico en tanto inhibe el trasporte
y utilización de la glucosa en los tejidos periféricos e incrementa la lipólisis.

¡De lo que hemos señalado, el hígado normal cumple un papel fundamental en la regulación de la glucemia. Un hígado
normal es glucogénico, glucolítico, hipogénico y colesterogénico.

En estado de ayunas el hígado es diferente: glucógenolítico, gluconeogénico, cetogénico y proteolítico.

En palabras simples, el hígado es un estratega de altos kilates pues almacena calorías cuando hay alimento, pero al
mismo tiempo es capaz de movilizar estos depósitos cuando el resto del cuerpo lo necesita.

Bajo estos mecanismos reguladores, la glucosa sanguínea se mantiene siempre bajo estrechos límites fisiológicos en la
sangre, mientras que las concentraciones de cuerpos cetónicos o de ácidos grasos varían en uno o dos órdenes de
magnitud. La proporción de insulina/glucagón variará desde 0.5 en una persona bien alimentada a 0.05 después de un
ayuno de 3 días.

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NOTAS SOBRE ESPECTROFOTOMETRIA

La medida de la absorción de la luz por una sustancia en solución es un método importante en el análisis bioquímico. La
cantidad de luz absorbida es proporcional a la concentración de la sustancia en solución. La absorción varía con la
longitud de onda de la luz, debiendo efectuarse la medida usando luz de longitud de onda de máxima absorción que es
característica de cada sustancia. Las sustancias coloreadas tienen una longitud de onda máxima en la región visible del
espectro. Otras sustancias absorben luz de ostras regiones del espectro (por ejemplo, los ácidos nucleicos absorben luz
ultravioleta) y no son detectados por el ojo humano.
Para conocer la concentración de una sustancia coloreada en solución se podría comparar visualmente la intensidad de
color de dicha solución con una o varias soluciones de concentración conocida. Sin embargo, resulta más preciso utilizar
un aparato, el espectrofotómetro, que mide la cantidad de luz que atraviesa una solución.

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EL ESPECTROFOTÓMETRO

El espectrofotómetro es un aparato que mide la cantidad de luz que pasa a través de una solución. Está
compuesto por las siguientes partes:

FUENTE DE ENERGIA: lampara que emite un haz luminoso que contiene un rango de
Longitudes de onda.

MONOCROMADOR: se llama también selector de longitud de onda. Consiste en una red de difracción que
separa las diferentes radiaciones procedentes de la fuente y selecciona la longitud de onda requerida.

RENDIJA: es un dispositivo que sirve para seleccionar un haz fino de radiación que será el que incida sobre la
muestra, evitando que la atraviese la luz difusa.

COMPARTIMENTO DE MUESTRA: en él se coloca la solución problema, que va a absorber un haz fino de luz
monocromática.

DETECTOR: es un sistema que transforma la energía luminosa que atraviesa la muestra en energía eléctrica.
Posee además un amplificador de la señal eléctrica recibida que posibilita su medición posterior.

MEDIDOR: traslada la energía eléctrica producida en el paso anterior hasta un galvanómetro de aguja donde
figuran dos escalas graduadas; una mide la absorbancia y la otra el tanto por ciento de transmitancia. Cuando
se mide la concentración de una solución se usa la escala de absorbancia. Los espectrofotómetros más
modernos dan una lectura digital y algunos incluso pueden transformarla en concentración.

Procedimiento o metodología

CONDICIONES DEL PACIENTE

Explicar al paciente el procedimiento que se va a realizar y la finalidad del mismo. El paciente debe acercarse en ayunas
en caso que la medición de glucosa sea basal, donde el ayuno debe encontrarse de 8 a 12 horas previo a la toma. Tomar
nota del paciente si está tomando medicamentos, si presenta alguna enfermedad diagnosticada, si ha realizado
ejercicio físico extenuante, consumo de alcohol y/o tabaco previo a la toma, así mismo si mantiene alguna dieta
específica.

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 - Actividad: anotar las condiciones en las que se encuentra el paciente previo a la toma de la muestra (uso de
medicamentos, tiempo de ayuno, consumo de alcohol o cigarrillo, actividad física realizada, patología
diagnosticada)

TIPO DE MUESTRA

Suero, plasma, orina

- Actividad: identificar el tipo de muestra correcta para el análisis (identificar la muestra idónea según el
requerimiento del pedido de examen

PRETRATAMIENTO DE LA MUESTRA

Una vez obtenida la muestra de sangre con su correcta homogenización, el tubo debe colocarse en posición vertical y
dejar que se forme el coágulo respectivo (el tiempo de formación del coágulo dependerá del tipo de tubo empleado),
usualmente de 5 a 10 minutos. El tubo deberá ser centrifugado a una velocidad de 3500 r.p.m durante 10 minutos. En
el caso de emplear tubos sin gel separador, el suero deberá separarse del paquete globular con el fin de evitar el
consumo de glucosa por parte de las células.

Nota: Los tubos con aditivos deben ser rápida y completamente mezclados

- Actividad: colocar los tubos dentro de la centrífuga (los tubos deberán colocarse según las indicaciones
brindadas por el técnico o docente) y programar el equipo a la velocidad y tiempo indicadas en el apartado de
pretratamiento de la muestra.

CRITERIOS DE RECHAZO DE UNA MUESTRA

Las muestras pueden ser rechazadas por el profesional en caso que se encuentre hemolizada, ictérica o lipémica. Los
valores de rechazo se encuentran en el inserto del reactivo a emplear.

- Actividad: reconocer signos de hemólisis (suero con coloración rojiza intensa), ictericia (sueros de color amarillo
intenso), lipemia (suero de apariencia lechosa), anotar el aspecto de la muestra y si esta se acepta o se rechaza
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MATERIAL PARA GENERAR LA REACCIÓN

Se emplean tubos de vidrio de 5 mL. De preferencia se emplean contenedores transparentes para observar la
coloración de reacción ya que la glucosa al reaccionar con el reactivo, se genera una coloración rosa, la cual será más
intensa o más tenue dependiendo la concentración de glucosa de la muestra.

- Actividad: seleccionar el material donde se realizará la reacción. Verificar que el material se encuentre limpio.
Ubicar una gradilla cerca para colocar el material en el que se realizará el proceso.

REACTIVOS PARA MEDICIÓN DE GLUCOSA

En el mercado existen varias presentaciones para la medición de glucosa las mismas que se diferencian por la casa
comercial de fábrica, tipo de reacción que emplean y metodología de medición. Los reactivos contienen la información
respectiva sobre el significado clínico, metodología, reactivos (almacenamiento y estabilidad), interferencias,
advertencias, datos de desempeño, calibración y control de calidad, valores esperados, procedimiento del ensayo,
parámetros para el ensayo.

- Actividad: revisar el inserto de la prueba y leer la información detenidamente. Identificar las limitaciones del
método e interferencias.

La metodología empleada es la de Tinder, donde la Glucosa en la muestra se oxida para producir ácido glucónico y
peróxido de hidrógeno en presencia de glucosa oxidasa. La enzima peroxidasa cataliza el acoplamiento oxidativo de la
4-aminoantipirina con fenol para producir un complejo coloreado de quinonemina, con una absorbancia proporcional a
la concentración de glucosa en la muestra.

REACCIÓN

Reactivos

1. Reactivo R1
 Tampón fosfato 250 mmol/l
 Glucosa oxidasa > 25 U/ml
 Peroxidasa > 2 U/ml
 Fenol 5 mmol/l
 4-aminoantipirina 0.5 mmol/l

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 2. Estándar
 Espécimen de concentración conocida (la concentración del estándar se puede visualizar en el frasco
contenedor del mismo)

Técnica y procedimientos

1. En tres tubos de ensayo rotulados como blanco, estándar y muestra, pipetear:

2. Incubar 5-10min a 37C

3. Leer en el equipo semiautomático Rayto

4. Analizar los resultados

Resultados
Actividad 2
Realice el informe de la práctica

Actividad 3
Evidencie la práctica con fotografías

Referencias bibliográficas

Rodwell, V., Bender, D., Botham, K., Kennelly, P., & Weil, A. (2018). Harper Bioquímica Ilustrada (31.a ed.). México D.F.:
12
 Mc Graw Hill.
D’Ocon Navaza C, García-Saavedra MJ, Vicente García JC (1999): Fundamentos y Técnicas de Análisis Bioquímico,
Análisis de Muestras Biológicas. Editorial Paraninfo, Madrid.
Mejoría Continúa de la Calidad. Guía para los laboratorios clínicos de América Latina. Editores: M.L. Castillo de Sánchez
y M.E.Fonseca Yerena, en colaboración con COLABIOCLI. Editorial Médica Panamericana.
Resultado de aprendizaje

Al término de la práctica y una vez cumplidas todas las experiencias de enseñanza aprendizaje, el estudiante será capaz de
establecer la importancia de los carbohidratos en la producción de energía metabólica celular.
Pensamiento crítico, juicio clínico, toma de decisiones y manejo de información.

Disposiciones generales
-Llegar puntual al laboratorio, se recomienda llegar a la Universidad 10min antes de la clase para el control previo de
temperatura y saturación
-Traer mandil blanco, zapatos cerrados, pantalón largo, guantes, gafas
-Traer la guía práctica impresa
-Mantener la mesa de trabajo limpia
-Está prohibido ingerir alimentos o bebidas en cualquier área del laboratorio
-Uso obligatorio de mascarilla

Bioseguridad
-Utilizar equipo de protección personal
-Seguir las reglas de acuerdo al manual de bioseguridad
Qué hacer en caso de emergencia
-Comunicarse inmediatamente con el Docente a cargo del laboratorio y/o las técnicas
Actividades de refuerzo académico
PREGUNTAS
1.- Consultar que significa la hipoglucemia fisiológica y patológica.
2.- Consultar que significa la hiperglucemia fisiológica y patológica.
3.- Alteraciones de los carbohidratos que afectan la boca y estructura bucal.
4.- Cuáles son los valores normales de glucemia en el ayuno y estado postprandial.

Observaciones
 Los estudiantes deben llevar para la práctica: Torniquete, guantes estériles, torundas de algodón
 El material es individual

Elaborado por
MSc. David Erazo
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Dra. Marlene López

Validado por

COORDINADOR
COMITÉ CURRICULAR DECANO DE LA FACULTAD
DE CARRERA

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