UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA- UMA

ESCUELA ACADÉMICA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

INFORME DE LA TÉCNICA DE KIRBY- BAUER PARA REALIZAR EL

ANTIBIOGRAMA

CURSO: MICROBIOLOGÍA

ALUMNAS:

 CASTAÑEDA DÁVILA, GRECIA

 DÍAZ LIMA, YESSICA

 LEÓN IZQUIERDO, LOURDES

DOCENTE: Mg. MALLQUI BRITO, ETHEL VANIA

CARRERA: FARMACIA Y BIOQUÍMICA

CICLO: 3

2020
 INTRODUCCIÓN

Actualmente nos ubicamos en el cuarto periodo del desarrollo histórico de la

microbiología, una era donde los estudios de los microorganismos están siendo
estudiados en toda su complejidad. La pared bacteriana está formada por mureina, que
son cadenas de peptidoglucanos, ella es esencial para la supervivencia de muchas
bacterias y su resistencia contra los antibióticos quienes pueden llegar a matarlas al
romper un paso en el proceso de la síntesis de sus peptidoglucanos. Las bacterias Gram
positivas, están formadas por mureina; una capa gruesa que rodea a toda la bacteria,
ácido teicoico, ácido lipoteicoico, ácido teicurónico, proteína, fosfolípidos, membrana
citoplasmática y el espacio periplasmico, exponente a rompimientos antimicrobianos. Las
bacterias Gram negativas son de una estructura más compleja, están formadas dos
membranas donde entre ellas se encuentra la cadena de peptidoglucanos, proteínas
periféricas e integrales, fosfolípidos y de Lípidos A, porinas periféricas, las lipoproteínas y
lipopolisacáridos. La resistencia de las bacterias frente a los antibióticos es el principal
obstáculo para una terapia eficaz, ya que no sólo evita que el paciente se esté curando,
sino que las consecuencias son peores, aparecen cepas más resistentes y las susceptibles
se van desapareciendo. Razón por la cual, la importancia de la sensibilidad de las bacterias
frente a los antibióticos sea indispensable para dar un uso adecuado de los antibióticos,
preservar la eficacia del grupo valioso de agentes terapéuticos e identificar el fármaco más
adecuado en casos de intolerancia al mismo. Saber su Gram es esencial para emplear la
técnica de Kirby-Bauer para realizar el Antibiograma, ya que esto determina el tipo de
pared celular que se verá afectada. Existen diversos métodos para determinar la
sensibilidad bacteriana a los antibióticos y cada uno tiene sus métodos, son múltiples
variantes, pero la técnica Kirby-Bauer es la variante más usada para medir el efecto de
antibióticos sobre una población bacteriana en fase logarítmica, es decir, la respuesta in
vitro de la bacteria frente a un determinado antibiótico. Consiste en utilizar una sola
concentración de antibiótico y medir el tamaño de la zona de inhibición, además no debe
existir ningún efecto inhibidor sobre la actividad antibacteriana de los antibióticos o
quimioterapéuticos. En este informe mostraremos las condiciones estrictas, la presencia
de antibióticos en bacterias específicas y todos los materiales de laboratorio de
microbiología necesarios para realizar el análisis, en la que los principales son el Agar
Müller-Hinton en bacterias anaeróbicas de rápido crecimiento, la estufa y los discos-placa,
quienes son los más importantes en el laboratorio para determinar al médico un resultado
confiable para la terapia más adecuada de su paciente con una enfermedad específica.
 OBJETIVOS

1. Determinar la sensibilidad de los antimicrobianos en bacterias aisladas.

2. Reconocer por su nombre genérico los antimicrobianos empleados para bacterias Gram
positivas y Gram negativas

3. Determinar la sensibilidad a diversos antibióticos de un determinado microorganismo

4. Comprender el concepto de antibiótico y su especificidad de acción sobre determinadas

bacterias
 MARCO TEÓRICO

ANTIBIOGRAMA

El antibiograma es un método de estudio in vitro del comportamiento de los

antimicrobianos (antibióticos y quimioterapicos) frente a los agentes infecciosos. Tiene
como finalidad proporcionar información útil para la iniciación y marcha de la terapéutica
anti-infecciosa. Con los resultados obtenidos en el antibiograma clasificamos las bacterias
en: sensibles, moderadamente sensibles y resistentes, a un determinado antimicrobiano.
El estudio estadístico del antibiograma permite conocer la tendencia de sensibilidad de
cada especie bacteriana, su coeficiente de benignidad frente a los antimicrobianos
utilizados y su índice de especifidad, que traduce la eficacia de cada antimicrobiano desde
el punto de vista terapéutico y epidemiológico.

TÉCNICAS DE REALIZACIÓN DEL ANTIBIOGRAMA

Para la realización del antibiograma es imprescindible partir de cultivos puros, si se

quieren obtener resultados fiables. Será necesario seleccionar entre las técnicas
propuestas las de más fácil estandarización, sencillez de ejecución y de resultados más
exactos. Los factores que pueden influir en los resultados son numerosos.
Las técnicas para ensayos de susceptibilidad a antimicrobianos deben ser las
recomendadas por los organismos internacionales: Federation of Drugs and Foods (FDA),
International Committee for Susceptibility Tests (ICS), National Committee for Clónica
Laboratory Standards (NCCLS), Center sor Disease Control (CDC). Se proponen tres
técnicas: una de difusión en medio sólido, con discos de carga constante (Kirby-Bauer), y
dos de dilución, en medio sólido y líquido, respectivamente, en las cuales se utiliza una
gama de concentraciones variables del antimicrobiano, con el fin de determinar la
concentración mínima inhibitoria (CMI) o menor concentración del antimicrobiano capaz
de inhibir el crecimiento bacteriano en unas determinadas condiciones.
MÉTODO DE DIFUSIÓN EN AGAR
Consiste en inocular masivamente una placa de agar con el microorganismo problema y
colocar sobre la superficie del medio unos discos que contienen determinadas
concentraciones de los antimicrobianos a ensayar. El antibiótico difunde por el medio y,
después de un tiempo de incubación determinado, el microorganismo se desarrolla en
toda la placa excepto alrededor de los discos cuya concentración de antimicrobiano es
inhibitoria. El diámetro del halo de inhibición del crecimiento expresa la sensibilidad o
resistencia del microorganismo., su tamaño está influenciado por el grosor del medio de
cultivo, la concentración del inoculo, la carga del disco y otros factores, por lo que habrá
que observar ciertas precauciones en la realización de la técnica.

1.- MEDIO DE CULTIVO

Se utiliza el medio Mueller- Hinton, el cual debe contener unos determinados índices de
calcio y magnesio (mínimo de 60 mcg/ml de calcio y 20 mcg/ml de magnesio), el PH debe
mantenerse entre 7,2 y 7,4. Para bacterias exigentes se adiciona un 5% de sangre:
Mueller-Hinton sangre (Streptococcus, Bacteroides) y Mueller-Hinton chocolate
(Haemophilus, Neisseria)., para ensayos de resistencia a meticilina (oxacilina) en
Staphylococcus se utiliza Mueller-Hinton salino (5% de ClNa).
Estos medios se reparten en placas de Petri, el espesor de la capa de agar debe ser de 4
mm. Las placas, una vez solidificado el medio, deben secarse en estufa a 37ºC durante 30
minutos por lo menos, destapadas e invertidas, con el fin de eliminar el agua de
condensación que dificulta la distribución del microorganismo en la superficie del medio

2.- INOCULO
La preparación del inoculo puede hacerse a partir de un cultivo puro en medio liquido o
bien de colonias aisladas en medio sólido. Conviene asegurarse de la pureza del cultivo, y
por eso se prefiere trabajar con colonias aisladas. Es conveniente que el microorganismo
no haya estado en contacto con antibióticos.
Cuando se prepara, debe estandarizarse para que ofrezca un crecimiento denso, pero no
totalmente confluente.
En general, la densidad microbiana del inoculo es de, aproximadamente, 10 7 – 108 UFC/ml,
o de turbidez equivalente al punto 0,5 de la escala de Mac Farland (0,5 ml de cloruro de
bario 0,048M añadidos a 99,5 ml de ácido sulfúrico 0,36M). Este inoculo se consigue
efectuando diluciones a partir de un cultivo en caldo en fase estacionaria de crecimiento y
ajustando la turbidez.

3.- INOCULACION

La inoculación no debe demorarse una vez preparado y ajustado el inoculo. La densidad

del inoculo y el modo de efectuar la inoculación desempeñan un papel importante en la
lectura de los halos de inhibición, los cuales pueden variar entre 2 y 8 mm al utilizar
distintos métodos.

 Método de Kirby-Bauer
Consiste en introducir un escobillón en el inoculo ajustado, eliminar el exceso presionando
suavemente sobre las paredes del tubo e inocular las placas por estriación masiva. Antes
de colocar los discos se deja secar la superficie, introduciendo la placa en estufa hasta 15
minutos como máximo.

4.- DISCO PARA ANTIBIOGRAMA

Se utilizan discos de papel absorbente grueso de 6 mm de diámetro, que contienen los
distintos antibióticos desecados y a la concentración conveniente. Estos discos ya listos
para su empleo, son preparados por distintas casas comerciales con la concentración
expresada en mcg/ml o en unidades internacionales(UI).
Normalmente se mantienen en congelador para evitar cambios en su contenido mientras
n se utilizan., una vez en uso, se conservan en refrigerador, nunca a temperatura
ambiente.
Es conveniente efectuar con cierta periodicidad un control de calidad de los discos para
verificar la actividad de los antibióticos. Este control se realiza con cepas patrón:
Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 y Staphylococcus
aureus ATCC 25923, por ejemplo.
Los discos se manejan con pinzas. Se colocan situados a unos 15mm de la periferia de la
placa y a la misma distancia entre ellos, comprimiéndolos ligeramente para que contacten
con el medio. Se pueden colocar unos 6 discos en la placa de 90 mm y 12 en la de 140
mm., como norma general, el número de discos por placa debe ser tal que los halos de
inhibición no se entrecrucen, para que sea posible la lectura de sus diámetros en varias
direcciones.

5.- ANTIMICROBIANOS

Se seleccionan según el microorganismo y el interés terapéutico. El grupo de trabajo de la

OMS recomienda elegir para el antibiograma un solo representante de los antibióticos con
estructura química similar y resistencia cruzada. De esta forma, se puede establecer una
pauta que contemple los antimicrobianos a utilizar según el microorganismo a ensayar.

Antibiograma de Staphylococcus
 Amicacina

 Ampicilina o amoxicilina

 Ampicilina-sulbactam
  Cefalosporina de primera generación

 Cefalosporina de tercera generación

 Clindamicina

 Cloxacilina (en Mueller-Hinton salino)

 Cotrimoxazol

 Eritromicina

 Fosfomicina

 Nitrofurantoina (en infecciones urinarias)

 Norfloxacina o ciprofloxacina

 Tetraciclina

 Tobramicina

 Vancomicina

Antibiograma de Pseudomonas
 Amicacina

 Azlocilina

 Aztreonam

 Cefotaxima

 Ceftazidima

 Ceftriaxona

 Ciprofloxacina

 Colistina

 Fosfomicina

 Imipenem

 Gentamicina

 Ofloxacina

 Norfloxacina
  Piperacilina

 Ticarcilina

 Tobramicina

Antibiograma de Streptococcus y otros microorganismos delicados

 Ampicilina

 Cefalotina

 Ceftriaxona

 Ciprofloxacina

 Cloranfenicol

 Cotrimoxazol

 Eritromicina

 Fosfomicina

 Imipenem

 Penicilina

 Tetraciclina

 Vancomicina
6.- LECTURA

La lectura se lleva acabo después de incubación a 35-37ºC durante 18-24 horas, midiendo
el diámetro de los halos de inhibición del crecimiento con una regla. Esta medida se
expresa en milímetros, clasificando al microorganismo como sensible o resistente de
acuerdo con el diámetro critico establecido. Para la interpretación de los resultados ha de
tenerse presente la concentración del disco, el microorganismo en cuestión y el medio de
cultivo empleado.
La tendencia actual es la de hacer una valoración binaria, clasificando los microorganismos
como sensibles o resistentes según que el diámetro de la zona de inhibición sea mayor o
menor que el diámetro crítico., las respuestas intermedias, que expresan una sensibilidad
moderada, quedan incluidas dentro de las resistentes para no inducir a error terapéutico.
Cuando los límites del halo de inhibición son claros y definidos se puede hacer la lectura
de manera impecable., sin embargo, en algunos casos, hay que tener en cuenta ciertas
consideraciones:
 Cuando se aprecian colonias resistentes dentro del halo se debe considerar al
microorganismo como resistente, y al antibiótico ineficaz para el tratamiento.
 Algunos microorganismos pueden mostrarse sensibles in vitro a la ampicilina por
ser productores de betalactamasa y, por tanto, ineficaces. Es necesaria la
detección de betalactamasa para confirmar una cepa sensible.
 Con algunos antibióticos, como las sulfamidas, aparecen bordes borrosos en los
que debe medirse el diámetro de la parte regular, es decir, la exterior, sin tener en
cuenta el crecimiento que pueda producirse en el interior.
MÉTODOS DE DILUCIÓN
Se realizan con el fin de determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI). Para ello se
preparan una serie de placas (dilución en agar) o tubos (dilución en caldo) inoculados con
un determinado volumen del medio de cultivo que contiene concentraciones progresivas
y crecientes del antimicrobiano a ensayar., sobre ellos se adiciona el inoculo bacteriano.
Tras un periodo de incubación establecido, se considera la primera placa donde no existe
crecimiento., la concentración del antimicrobiano en ese lugar corresponde a la CMI.

 MÉTODO DE DILUCIÓN EN AGAR

Es un método adecuado para probar muchas cepas simultáneamente, capaz de
detectar heterogeneidad o contaminación microbiana., presenta mejor
reproductibilidad que el método de dilución en caldo.
El medio de cultivo recomendado es agar de Mueller-Hinton, suplementado con un
5% de sangre en caso necesario. El antimicrobiano se añade al medio fundido
cuando este se encuentre a una temperatura aproximada de 50ºC, en proporción
1/10 (v/v), y una vez homogeneizado se vierten en placas.
El inoculo ajustado se prepara de igual manera que para las pruebas de difusión en
agar., posteriormente se diluye al 1/20 en solución salina (concentración de 10 4
UFC/ml).
La CMI representa la menor concentración del antimicrobiano capaz de producir
inhibición total del crecimiento., no se consideran los crecimientos muy finos,
apenas visibles, ni los de una sola colonia.
  MÉTODO DE DILUCIÓN EN CALDO
Este método es apropiado para el estudio simultaneo de varios antimicrobianos
frente a un microorganismo.
Se recomienda el caldo de Mueller-Hinton, y el de Tripticasa-soja para aquellos
microorganismos que no pueden crecer en Mueller-Hinton.
Las diluciones del antimicrobiano se practican en el propio caldo, dispuesto en
tubos de una placa de microtitulacion, hasta un volumen final de 1 ml por tubo y
0,05 ml por pocillo, teniendo en cuenta que al añadir posteriormente la misma
proporción de inoculo las concentraciones del antimicrobiano quedaran a la mitad
de las iniciales.
Una vez adicionado el inoculo a los tubos y pocillos, se homogeneizan y se incuban
a 35-37ºC durante 18-24 horas, preferiblemente en cámara húmeda y sin CO2,
protegiéndolos para que no se produzca evaporación y desecación.
La menor concentración de antimicrobiano que produce inhibición total del
crecimiento visible representa la CMI., un crecimiento muy tenue o un pequeño
grumo de posible crecimiento no se toman generalmente en cuenta.

APLICACIONES CLÍNICAS DEL ANTIBIOGRAMA

 Como consecuencia de la realización del antibiograma y del empleo de una terapéutica
correcta disminuye la presión que el uso indiscriminado de los antibióticos ejerce sobre la
flora bacteriana.
Para estimar la eficacia de un tratamiento se dispone de varias técnicas complementarias
aplicables a situaciones clínicas especiales:

 Determinación de sinergismo y antagonismo

 Determinación de la concentración mínima bactericida (CMB)
 Medición de niveles de antibióticos en suero y líquidos
 Determinación del título bactericida del suero (TBS)

PROCEDIMIENTO
Preparación del inóculo

Método de crecimiento activo recomendado

para microorganismos no fastidiosos

 Tome 3 a 5 colonias de igual morfología y emulsione en 4 a 5 ml de caldo tripticasa

soya.

 Incube a 35 °C (2-6 hrs).(Ajuste la turbidez con solución salina (NaCl 9o/oo) estéril a McF
0,5 con luz adecuada, contra tarjeta blanca con una línea negra de contraste).

Método de suspensión directa de colonia

(recomendado para microorganismos de crecimiento fastidioso como Streptococcus spp,
Haemophilus spp, Neisseria gonorrhoeae, Staphylococcus spp)

 Prepare inóculo con ajuste de turbidez McFarland 0,5, directo en caldo de colonias frescas
en agar no selectivo.

Inoculación de placas

 Dentro de 15 min de hecho el ajuste de la turbidez.

 Con tórula en tres direcciones inocule toda la placa (giros de 60°).
 Deje impregnar durante no más de 15 min.
Nota:
-No utilice caldos de 18 hrs.
-No utilice inóculos no estandarizados.

Aplicación de sensidiscos

 Cantidad: 12 unidades en placas de 150 mm y 5 unidades en placas de 100 mm.

 Separación: 24 mm (del centro de un sensidisco al otro más cercano).
 La difusión del fármaco es instantánea: no reubique los sensidiscos después de haberlos
depositado en la superficie del agar.
 Incube en O2 a 35° C (excepto Haemophilussp, N. gonorrhoeae y Streptococcus pneu-
moniae).

Lectura e interpretación de halos de

inhibición

 Uso de luz reflejada con fondo oscuro:

 -mida el crecimiento confluente.
-SXT puede producir un doble halo
-en Proteus spp. ignore la invasión.
-ignore colonias pequeñas intra-halo excepto en Staphylococcus y Enterococcus
spp.
 Uso de luz transmitida:
-En Staphylococcus spp frente a oxacilina.
-En Enterococcus spp frente a banco micina.
 El margen es la zona que no muestra evidencia ocular de cultivo visible.
 Ignore las colonias diminutas con lupa en el margen.
 Subcultive las colonias existentes dentro de las zonas de inhibición neta.
 En medios suplementados con sangre se debe medir la inhibición de crecimiento, no la
hemólisis.

RESULTADOS
OBSERVACIONES
Conclusiones:

 Para un tratamiento se debe elegir el antibiótico adecuado que sea mas sensible para que
le haga efecto al paciente
 El antibiograma se debe realizar en condiciones adecuadas para que no se contamine y
colocarlo en una incubadora al 37°C y pueda dar resultados.
  Con este método podemos darle a nuestros pacientes la medicación adecuada ante su
infección.

BIBLIOGRAFÍA

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https://www.seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/seimc-
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https://www.buenastareas.com/ensayos/Practico-n-3-Antibi%C3%B3ticos-y-
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https://www.ins.gob.pe/insvirtual/images/otrpubs/pdf/manual%20sensibilidad%202.pdf

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id=4N8qVKckrUUC&lpg=PA149&dq=antibiograma&hl=es&pg=PA132#v=onepage&q=antibiograma
&f=false