PRUEBAS DE SUCEPTIBILIDAD

ANTIMICROBIANA

LIC. CARLOS ARTURO MEDINA

PANTA
 ANTIMICROBIANOS
 Sustancia producida por un microorganismo o
elaborada en forma total o parcial por síntesis
química, la cual inhibe el desarrollo o mata a otros
microorganismos.

 Producto sintetizado por microorganismos:

ANTIBIOTICO

 Compuesto obtenido por síntesis química:

QUIMIOTERAPICO
 
 Los antimicrobianos se definen, como
medicamentos que destruyen los
microorganismos o impiden su multiplicación
o desarrollo. Estos fármacos, se dividen en
antibacterianos, antivirales, antimicóticos,
antimicobacterianos, antiparasitarios y
antirretrovirales.
Antibiótico:
 Sustancia producida por el metabolismo de

organismos vivos, principalmente hongos

microscópicos y bacterias, que posee la
propiedad de inhibir el crecimiento o destruir
microorganismos.
 ¿QUE CARACTERISTICA DEBE TENER UN
ANTMICROBIANO?
• Toxicidad selectiva:
Debe ser tóxico para el microorganismo, pero ser inocuo
para el hospedero. Esto es indispensable para la
utilización del antimicrobiano en clínica.
• No inducir resistencia
• Permanecer estable en los líquidos corporales y tener un
largo período de actividad
• Ser soluble en humores y tejidos
• No inducir respuesta alérgica en el huésped
• Tener un espectro de acción limitada
 ANTECEDENTES HISTORICOS

Paul Ehrlich (1908):

Creó el primer compuesto químico Estructura química del Salvarsan
sintético (Salvarsan) que podía (“La bala mágica”)
curar una infección, la sífilis
(Treponema pallidum).
 Penicillium notatum

Alexander Fleming (1928):

Observó que el hongo Penicillium notatum impedía el
crecimiento de Staphylococcus aureus
Florey y Chain (1939): aislaron Penicilina G
Foto original tomada por Fleming Foto actual

El hongo Penicillium notatum impide el

crecimiento de Staphylococcus aureus...
 CLASIFICACION DE LOS
ANTIMICROBIANOS

Desde el punto de vista práctico existen distintos tipos de antimicrobianos:

 Desinfectantes: sólo se aplican a sistemas inanimados y eliminan la carga
microbiana total.
 Sanitizantes: sólo se aplican a sistemas inanimados y disminuyen la
carga microbiana total.
 Antisépticos: reducen y controlan la presencia de microorganismos
potencialmente patógenos, sólo se pueden aplicar externamente en seres
vivos (piel y/o mucosas).
 Antimicrobianos de uso sistémico: reducen y controlan la presencia de
microorganismos que han invadido los tejidos. Actúan en el organismo,
pudiendo ser ingeridos (vía oral), absorbidos por piel (apósitos) y/o
inyectados.
Los agentes antimicrobianos de uso sistémico se puede
clasificar según su origen, efecto antimicrobiano,
espectro de actividad y mecanismo de acción.

 Origen:
 Naturales: se obtienen a partir de microorganismos
(hongos, Bacterias, etc.).
 Sintéticos: se obtienen totalmente por síntesis
química.
 Semisintéticos: se obtienen por modificaciones
químicas de antimicrobianos naturales, con el fin de
mejorarlos.
 Efecto:
 Bacteriostático: la máxima concentración no
tóxica que se alcanza en suero y tejidos impide el
desarrollo y multiplicación de los
microorganismos, sin destruirlos, pudiendo
éstos multiplicarse nuevamente al desaparecer el
agente antimicrobiano. Sirven para
complementar los mecanismos defensivos del
huésped.
 Bactericida: su acción es letal sobre los
microorganismos, por lo que éstos pierden
irreversiblemente su viabilidad o son lisados
 Espectro de actividad:
 Amplio: actúan sobre un gran número de
especies microbianas (ej. TETRACICLINA).
 Intermedio: actúan sobre un número limitado
de microorganismos (ej. MACROLIDOS).
 Reducido: actúan sobre un pequeño número de
especies microbianas (ej. POLIMIXINA).
 Mecanismo de acción:
 Inhibición de la síntesis de la pared celular.
 Alteración de la permeabilidad celular.
 Inhibición de la síntesis proteica.
 Inhibición de la síntesis de DNA y RNA.
 PRUEBAS DE SENSIBILIDAD
ANTIMICROBIANA
 El estudio de la sensibilidad de los
microorganismos a los antimicrobianos es una de
las funciones más importantes de los
laboratorios de microbiología clínica
 Su realización se desarrolla mediante las pruebas
de sensibilidad o antibiograma, cuyo principal
objetivo es evaluar en el laboratorio la respuesta
de un microorganismo a uno o varios
antimicrobianos, traduciendo, en una primera
aproximación, su resultado como factor
predictivo de la eficacia clínica.
Métodos de análisis de la sensibilidad
antimicrobiana
Cada sistema tiene sus ventajas y sus inconvenientes:
 El método de Kirby-Bauer es probablemente el más

utilizado por su sencillez y, si se realiza

correctamente, presenta una correlación muy buena
con los métodos cuantitativos.
 Algunos laboratorios trabajan con métodos

semicuantitativos como el E-test. Estos sistemas son

una modificación del método de Kirby-Bauer, en
los que en lugar de discos se utilizan tiras de papel
impregnadas con un gradiente del antibiótico, lo
que permite una semi-cuantificación.
 Los sistemas cuantitativos son los más exactos pero

también los más laboriosos.

DEFINICIONES

Concentración inhibitoria mínima (CIM)

Corresponde a la menor concentración de antimicrobiano

que inhibe el crecimiento bacteriano luego de 18 a 24 horas
de incubación.

Concentración bactericida mínima (CBM )

Corresponde a la menor concentración capaz de matar un

99,9% la población bacteriana.
METODO DE DIFUSION POR DISCO
 Fundamento:
Es un método basado en los estudios de Bauer,
Kirby y col y que el National Comittee for Clinical
Laboratory Standars(NCCLS) recomienda para
estudios de sensibilidad bacteriana a los
antimicrobianos.

Consiste en poner sobre placas inoculadas con el

microorganismo discos de papel secante
impregnados con los diferentes antibióticos
El antibiótico difunde radialmente a través del
espesor del agar a partir del disco formándose
una gradiente de concentración

Trascurridas las 18 24 horas los discos aparecen

rodeados de una zona de inhibición

La lectura de los halos de inhibición debe

interpretarse como sensible(S) resistente(R) o
intermedia(I) Según las categorías establecidas en
las tablas 1-4 de la NCCLS
ETAPAS DEL PROCEDIMIENTO
 Selección de las colonias
 Preparación del inoculo
 Estandarización del inoculo
 Inoculación de la placa
 Colocación de discos
 Incubación de placa
 Medición de halos
 Interpretación de los resultados
 Selección de colonias

 Seleccionar colonias bien aisladas

 Se deben tomar de 3 a 5 colonias , mayor
oportunidad de detectar resistencia
 Utilice colonias que no sobrepasen las 18-24
horas de aislamiento
PREPARACION Y ESTANDARIZACION
DEL INOCULO
 Suspensión directa de colonias
Suspenda las colonias en 9 ml de solución
salina o 4 ml de caldo
Ajuste el inoculo a turbidez 0,5 Mc Farland,
mediante estándar de Sulfato de Bario
PREPARACION Y ESTANDARIZACION
DEL INOCULO
 Método de fase logarítmica
Inocular las colonias en un caldo( Mueller o
Soya de 4 ml)
Incubar a 37 grados 2-8 horas
Ajustar a Mac Farland 0.5
Las suspensiones así ajustadas deben utilizar
dentro de los 15 minutos siguientes. No utilizar
cultivos de la noche anterior
 INOCULACION DE PLACAS
 Como prepararse
Retirar discos del congelador 1-2 horas antes
Permita que la placa de agar Mueller-Hinton se
caliente a Tº ambiente
Asegúrese que la placa tenga la profundidad
adecuada de 4 mm
Mezcle la suspensión del microorganismo
Sumerja una tórula estéril y presiónela contra
la pared del tubo para eliminar exceso de
líquido
Empezando por la parte superior cubra toda la
placa frotando de ida y vuelta de un borde a
otro. Rote la placa 60º y repita frotado, gire
nuevamente 60º y frote por tercera vez. Dejar
secar 3-5 minutos antes de poner discos
 Selección de antimicrobianos
 Dependerá del Laboratorio de Microbiología
en conjunto con la decisión del Comité de
Infecciones Intrahospitalarias
 En las tablas del 1-5 de la NCCLS aparecen los
antimicrobianos recomendados según tipo de
microorganismo
 DISPENSACIÓN DE DISCOS
 Colocar los discos con dispensador o uno a uno
con pinzas estériles
 Presionar ligeramente sobre la superficie del
agar
 No deben situarse a menos de 15 mm del borde
de la placa
 Para placas de 150mm no deben emplearse mas
de 10 discos y para las de 100mm no mas de 6
 INCUBACION

 Incubar las placas invertidas a 35º y en

atmosfera aerobia no mas allá de 15 minutos de
poner los antimicrobianos
 Las placas se incubaran 16-18
horas(Staphylococcus sensibles a meticilina y
Enterococcus spp deben incubarse 24 horas)
 Lectura de los resultados
 Leer el diámetro de las zonas de completa
inhibición con pie de metro o regla
 Los halos en medios trasparentes se miden
sobre el reverso de la placa y en medios con
sangre sobre la superficie del agar, mediante
luz reflejada
 Use luz transmitida para medir oxacilina en
Staphylococcus y vancomicina en
Enterococcus
ZONAS DE INHIBICION INUSUALES
 Como medir e Interpretar los halos
 Bordes difusos

Mida la zona que es obvia

 Doble zona

Mida la zona mas interna

 Zonas con trimetoprima - sulfamehoxazole

Medir zona con 80% de reducción de crecimiento

INTERPRETACION DE RESULTADOS

 Seguirán las normas establecidas por la

NCCLS, TABLAS 1-5 que establecen tres
categorías en las cepas estudiadas
 Sensible
 Intermedia
 Resistente
 DESVENTAJAS DEL METODO
 Gran cantidad de variables a controlar
 Composición, Ph y profundidad del medio de
cultivo
 Concentración del inóculo y procedimiento de
la inoculación
 Contenido del antimicrobiano en el disco,
almacenamiento de discos
 MEDIO DE CULTIVO

 Agar Mueller Hilton

 Se considera como el mejor medio para el

estudio de susceptibilidad de cepas no

fastidiosas
 Preparación

A partir de medio deshidratado y según

instrucciones del fabricante
 Las placas deben usarse en un lapso de 7 días
después de la preparación

 Una muestra representativa de cada lote

debería ser examinada para esterilidad por 24
horas a 30-35º
 pH
 Debe tener un pH entre 7,2 y 7,4 después de
gelificar a medio ambiente

 Ph bajo pierden potencia aminoglicósidos,

quinolonas y macrólidos, en cambio las
tetraciclinas presentan excesiva actividad
 Conservación de los sensidiscos
 Refrigerar a 8º o menos , las drogas de la clase
Beta lactamicos deben estar congeladas a -14º
Celsius o mas bajo
 Los dispensadores deben alcanzar la
temperatura ambiente antes de usar,
reemplazar el desecante cuando el indicador
cambia de color
 Solo aquellos discos con fecha de expiración
dentro del plazo pueden ser usados
 Antimicrobianos. E-test
 Técnicamente similar a disco-placa
 Ofrece resultados cuantitativos
 La CIM corresponde al punto de corte entre el
halo de inhibición y la tira de E-test.
 Permite estudiar sinergismos, antagonismos y
subpoblaciones.
 El principio de este método es una expansión de la técnica de
difusión en disco. En el método E-test (AB Biodisk, Suecia)
podemos, mediante lectura directa, determinar la concentración
inhibitoria mínima (CMI). Consiste en una tira de plástico no
poroso de 6 cm de largo por 5 mm de ancho que incorpora un
gradiente predefinido de antimicrobiano equivalente a 15
diluciones. El protocolo para preparar el inóculo es el mismo que
para la difusión en disco. Siguiendo el método de difusión, una
vez inoculado la placa de agar con el microorganismo, se coloca
la tira de E-test sobre su superficie, produciéndose de forma
inmediata una difusión del antibiótico desde el soporte hasta el
agar, creándose de este modo a lo largo de la tira un gradiente
exponencial de las concentraciones del antimicrobiano. Tras la
incubación de las placas, se puede observar una zona de
inhibición elipsoidal y simétrica. Después de la incubación la CMI
será el valor obtenido en el punto en el que el extremo de
inhibición intersecciona con la tira.
 Antibiograma por dilución
Técnica de referencia en la mayoría de los estudios clínicos de
susceptibilidad a antimicrobianos.
Entrega un resultado cuantitativo, ya que permite determinar la
concentración inhibitoria mínima (CIM).
Se puede realizar en medio líquido (dilución en caldo) o en medio
sólido (dilución en agar).
Método complejo y de alto costo.

Lectura del CIM

Dilución seriada en caldo CIM