UNIVERSIDAD MARIANA

FACULTAD DE INGENIERA
INGENIERIA DE PROCESOS

VALORACIN DE COMPUESTOS ANTIMICROBIANOS DE ORIGEN NATURAL



Objetivos.
Familiarizar al estudiante con la valoracin de antibiticos y sustancias antimicrobianas
Valorar extractos de diferentes plantas y vegetales para evidenciar su accin antimicrobiana

Marco terico.

Los antibiticos se pueden definir como un producto del metabolismo microbiano que es capaz de
matar o inhibir el crecimiento de otros microorganismos y adems es efectivo a bajas
concentraciones. En general, los antibiticos deben su toxicidad selectiva a las diferencias entre las
clulas eucariotas y procariotas. Su eficacia txica es la consecuencia de su capacidad de inhibir
una reaccin bioqumica especfica y esencial, bien sea para la clula eucariota o para la clula
procariota. Para que el antibitico ejerza su accin es necesario que llegue al foco infeccioso,
penetre en las bacterias (por difusin o transporte activo) y alcance intracelularmente la
concentracin necesaria. Una vez dentro de la clula el antibitico puede ser bacteriosttico si inhibe
la multiplicacin de forma reversible, o bactericida si tiene un efecto letal. En general, cada grupo de
antibiticos acta preferentemente de una forma u otra. Antibiticos bacteriostticos: macrlidos,
tetraciclinas, cloranfenicol. Antibiticos bactericidas: betalactmicos, aminoglicsidos, polipeptdicos,
polienos (1).

Pruebas en medio Lquido (2)

El medio de cultivo es lquido. Se toman de 7 a 10 tubos de ensayo que contienen la misma cantidad
de caldo nutritivo. A cada uno de ellos se le aade una cantidad de antibitico de manera de obtener
diluciones dobles y progresivas de agente antimicrobiano. Los tubos se inoculan con una suspensin
calibrada del microorganismo en estudio (de manera que garantice una misma cantidad de bacterias
en cada tubo) y se incuban durante 18 horas a 35C. Uno de los tubos no contiene antibitico y sirve
como control de desarrollo o testigo. En aquellos tubos donde la bacteria se desarrolla y multiplica
aparece turbidez. En cambio cuando el antibitico inhibe el crecimiento, la masa lquida del medio de
cultivo aparece clara. Esto determina un punto de ruptura en el crecimiento bacteriano que introduce
el trmino de CONCENTRACION INHIBITORIA MINIMA (C.I.M.). El CIM es la menor concentracin
de antibitico expresada e g/ml, que inhibe el desarrollo in vitro de las bacterias (figura 1) (2)
























Figura 1. Mtodo pruebas en medio lquido (2)


Difusin en agar (2)

El medio de cultivo es slido. Este sistema permite probar la eficacia de varios antibiticos al mismo
tiempo. Sobre la superficie de una placa de agar se realiza la siembra de una suspensin bacteriana
calibrada y a continuacin se depositan sobre ella discos de papel de filtro impregnados de
antimicrobianos (discos para antibiograma disponibles en el comercio). Tan pronto como el disco
toma contacto con la superficie hmeda del agar, el agua es absorbida por el papel de filtro y el
antibitico difunde hacia el medio circundante creando as concentraciones progresivamente
decrecientes. Se observa como a medida que la distancia al disco aumenta hay una reduccin
logartmica de la concentracin del antibitico. As, al cabo de 18 horas de incubacin, en aquella
zona donde el antibitico es capaz de impedir el crecimiento de la bacteria aparece un halo
alrededor del disco: halo de inhibicin (Figura 2).

El tamao de la zona de inhibicin depende de ciertas propiedades fisicoqumicas del antibitico que
influyen invitro sobre la velocidad de difusin en agar y no estn necesariamente relacionadas con la
actividad teraputica (in vivo) del antibitico. La valoracin de los halos se hacen por patrones
obtenidos de forma que se hallan correlacionadas la CIM y la carga antimicrobiana del disco con el
dimetro del halo. Para ello es necesario determinar previamente en forma individual la CIM y el halo
de inhibicin de un nmero amplio de cepas. Los resultados se representan en un sistema de
coordenadas que nos permite establecer una correspondencia para un antibitico determinado. De
esta forma midiendo el dimetro del halo de inhibicin de una cepa por el mtodo del disco-placa,
trasladamos este valor a la escala anterior y podemos conocer su CIM. Pese a las limitaciones, esta
tcnica representa un avance ya que provee de resultados estandarizados comparables entre los
distintos laboratorios.























Figura 2. Mtodo difusin en agar



Tcnica general para la valoracin de la actividad antimicrobiana (2)

MEDIO DE CULTIVO: se selecciona como medio de cultivo estndar el agar de Mueller-Hinton ya
que este promueve el desarrollo de la mayora de los aislamientos bacterianos de patgenos
significativos. Es importante que el medio alcance en la placa un espesor uniforme de 4 mm. Si es
ms fino, los antibiticos tienden a difundir ms en sentido lateral, dando halos de mayor tamao; y
un agar de ms de 4 mm de espesor produce una mayor difusin del antibitico hacia abajo con
tendencia a estrechar las zonas de inhibicin.

INCULO: la concentracin bacteriana debe ser de aproximadamente 108 microorganismos por
mililitro. Para esto, tocar con un hisopo estril la superficie de una o varias colonias de cepas
bacterianas puras (de la misma especie), luego sumergir el hisopo en 2 o 3 ml de caldo nutritivo
hasta que la turbidez del medio sea equivalente al estndar 0,5 de Mc Farland cuya turbidez
corresponde a la concentracin de microorganismos buscada. El estndar de Mc Farland se prepara
aadiendo 0,5 ml de cloruro de bario al 1% a 99,5 ml de cido sulfrico 0,36 N. La comparacin de
turbidez entre el estndar y el caldo con el microorganismo en estudio se puede efectuar mejor
mirndolos contra una cartulina blanca con lneas negras verticales y paralelas. Si la turbidez de la
suspensin es menor, se debe inocular nuevamente, y si la turbidez es mayor se debe diluir con
solucin fisiolgica hasta igualarlas. Una vez logrado esto, sumergir un hisopo estril y seco en la
suspensin bacteriana y eliminar el exceso de lquido haciendo rotar el hisopo contra la pared
interna del tubo. Inocular con sta la superficie de una placa de agar de Mueller-Hinton a
temperatura ambiente. Se sugiere estriar la superficie con el mismo hisopo en por lo menos tres
direcciones girando la placa en ngulos de 60 luego de cada estra. Una vez seco el inculo, la
placa esta lista para la colocacin de los discos con antibiticos.

DISCOS: pueden adquirirse en el comercio, y si bien su almacenamiento requiere refrigeracin,
debe estar a temperatura ambiente antes de su colocacin sobre la superficie de agar. Pueden ser
colocados manualmente utilizando una pinza estril y presionando suavemente sobre la superficie
de agar con la punta de la pinza o de una varilla para asegurar un contacto uniforme con el agar,
cuidando de no moverlos una vez colocados en su lugar. Los discos deben colocarse a no menos de
22 mm uno del otro y a 14 mm del borde de la placa para evitar que las zonas de inhibicin se
superpongan o se extiendan hasta el margen de la placa. El personal de laboratorio debe tener
cuidado de no emplear discos que excedan la fecha de vencimiento.

INCUBACIN: colocar las placas en una estufa a 35C. No son aconsejables las incubadoras con
dixido de carbono debido a que se puede formar cido carbnico en la superficie del agar,
provocando as una cada del pH. Las placas deben colocarse invertidas en la incubadora de modo
que la humedad o condensacin que se acumule en la placa no caiga sobre la superficie de agar
tratada. El mtodo estndar recomienda que todas las determinaciones finales se llevan a cabo
exactamente a las 18 horas, pues se ha establecido que este es el perodo en el que la reactividad
entre los microorganismos y los efectos inhibidores de los antibiticos es ptima, siendo adems los
bordes de las zonas de inhibicin ms ntidos. Si la interpretacin se demora ms all de ese tiempo,
se pueden producir alteraciones en el halo por desecacin del agar, por deterioro del antibitico o
por sobredesarrollo de las colonias.

MEDICIN DE HALOS: alrededor de los discos que contienen antibiticos a los cuales el
microorganismo en estudio es susceptible, aparecen zonas de inhibicin: halos. Los dimetros de
estas zonas se deben medir cuidadosamente por la parte posterior de la placa con una regla. Si es
necesario, ubicar la placa a contraluz o utilizando una fuente de luz brillante. Las mediciones se
realizan con una aproximacin de 1 mm y el operador debe tener la precaucin de observar la placa
siguiendo una vertical directa para evitar una lectura errnea de las marcas de la regla por el efecto
de paralaje.

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS: se lleva a cabo relacionando los dimetros de las
zonas de inhibicin y la CIM que le corresponde para el antibitico segn estndares.


MATERIALES

Cepa de un microorganismo patgeno
Extracto natural de plantas o vegetales
Tubos de ensayo
Cajas Petri con Agar Mueller Hinton
Bastillones
Solucion Mc Farland (1,5 x 106 UFC/ml).
Micropipetas
Cajas Petri vacas
Cloramfenicol
Mechero


METODOS.
1. Previamente los estudiantes seleccionarn una materia prima de la cual obtendrn un
extracto o aceite esencial considerado como antimicrobiano. El extracto deber tenerse
disponible para la practica.
2. Se siembra un microorganismo patgeno en Agar, las cuales se incuban a 35C durante 24
horas.
3. Luego de tener el microorganismo aislado se toma 4 o 5 colonias de cada uno de estos y se
coloca en 5ml de solucin salina al 85%, se ajusta las concentraciones con el tubo No. 0,5
Mc Farland (1,5 x 106 UFC/ml).
4. La suspensin ajustada se siembra masivamente con el escobilln estril en el agar Mueller
Hinton para cada microorganismo.
5. Se toman discos de papel estriles en los cuales se aada 10 L de extracto: se debe
determinar la concentracin del extracto (30g/ml).
6. Los discos se dejan secar en una caja Petri cerrada.
7. Se distribuyen los discos en la caja con Agar Mueller Hinton. Se utiliza como control negativo
agua esteril y como control positivo discos de otro antibitico comercial de amplio espectro
(cloramfenicol).
8. Se deja incubando a 37C durante 24 horas, luego del periodo de incubacin se realiza la
lectura de los halos de inhibicin (mm). Todos los ensayos deben hacerse por triplicado.

Preguntas

1. Destaque la importancia del antibiograma en el marco de la ingeniera de procesos. Qu
conclusiones le permite realizar?
2. Mencione los mtodos que conoce y analice las ventajas y limitaciones de cada uno.
3. Concepto y definicin de CIM y CBM. Cmo se determinan experimentalmente?
4. Menciona dos causas del por qu los microorganismos pueden llegar a hacerse resistentes
a los antibiticos.

Referencias bibliogrficas

1. Mateos, P. Agentes microbianos y microorganismos. Disponible en:
http://www.sld.cu/galerias/pdf/sitios/apua-cuba/a3. Consultado: Enero 2014
2. Universidad Nacional del Nordeste. Practicas de Microbiologa: Determinacin de la
actividad antimicrobiana (2006)
3. Lizcano Ramn, A.J y Vergara Gonzlez, J.L. Extractos etanlico y/o aceites esenciales de
las especies vegetales Valeriana pilosa, Hesperomeles ferruginea, Myrcianthes rhopaloides
y Passiflora manicata frente a microorganismos patgenos y fitopatgenos . Universidad
Javeriana. 2008