DEFINICIN

Es una prueba de susceptibilidad de

las bacterias frente a distintos
antibiticos o quimioterpicos.
Si un microorganismo en contacto
con un antibitico perdura y se
reproduce es resistente por lo
contrario si no desarrolla es sensible
al mismo.

Tipos De Antibiograma

A)
B)

Antibiograma de rutina.
Antibiograma especiales.

A) ANTIBIOGRAMA DE RUTINA.

ANTIBIOGRAMA POR DIFUSIN EN AGAR:

MTODO DE LOS DISCOS DE PAPEL.

Se caracteriza por usar discos de papel

impregnados con diversos antibiticos.
Si bien es mucho menos exacto resulta muy
prctico, sencillo y satisfactorio para la
clnica.
Los
discos
tienen
una
concentracin
establecida.
Para estandarizar la tcnica y hacer
comparable los resultados se debe utilizar
cepas puras de cultivo recientes.

Factores A Tomar En Cuenta

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.

Medio de cultivo.
Inculo.
Placa de Petri.
Siembra.
Predifusin.
Discos con antibiticos.
Aplicacin de los discos.
Incubacin.
Lectura.

1.- Medio de Cultivo.

Se recomienda internacionalmente el agar Muller Hinton.

Infusin de carne vacuna......300 g

Peptona..................................17,5 g
Almidn..................................1,5 g
Agar .........................................17 g
Agua ...................................100ml.
p H
..7.2 7.4

Muller Hinton
Rene

las
apropiadas:

caractersticas

ms

Contenido muy bajo de PABA que es un

inhibidor de Sulfas y Trimetoprin.
Baja concentracin de timidina inhibidor
de tetraciclinas.
Bajo contenido en sales de Ca++ y Mg++
que forman compuestos quelantes con
Betalactmicos y Tetraciclinas.

2.- Inculo.
La

Suspensin bacteriana deber provenir

de cultivos monobacterianos recientes.

Se suspende 5-6 colonias del microorganismo en 12 ml. de caldo nutritivo (tripticasa soja) y se ajusta
con el estndar.
El estndar o patrn de turbidez corresponde a la
mitad del tubo N1 de la serie turbidimtrica de Mac
Farland.
En caso de no llegar a la turbidez, incubar 2-6 horas
a 35-37C hasta llegar a la turbidez necesaria.

Estndar o Patrn de turbidez

Para preparar este patrn se procede de la siguiente manera:

Mezclar 0.5 ml. de una solucin de BaCl 2 48 mmol / lt. (1,175

% P/V de BaCl2.2H2O)
+
99,5 ml. de una solucin de
H2SO4 180 mmol / lt. (0.36 N 1% v/v).
Esta turbidez equivale aproximadamente a 150 millones de
UFC/ml.

Se puede fraccionar en tubos similares a los que se emplearn

para la preparacin del inculo, se cierran perfectamente y se
consen refrigerados.
Procediendo de esta manera puede ser empleado por
aproximadamente seis meses.
Si se cierran a la llama pueden permanecer en buenas
condiciones por ms de 20 aos.
Incluir una perla de vidrio para favorecer la resuspensin del
precipitado.
Esta suspensin deber agitarse antes de proceder a la
comparacin.

3.- Placa De Petri:

Debe tener 8 cm. de dimetro.

Agregar de 18 a 20 ml del medio de Muller
Hinton, para obtener una altura de 4mm.
Conservar en heladera hasta 7 das si se
envuelven en bolsa de plstico.
No debe existir humedad en la superficie
del agar, ni en las tapas antes de ser
inoculadas.

4.- Siembra.

Se realiza con hisopo de algodn

embebindolo con la suspensin de la
bacteria (inculo).
Se elimina el exceso del liquido
presionando el hisopo contra las
paredes del tubo.
Estriar por lo menos en tres
direcciones haciendo girar la placa.

5.- Predifusin

Dejar 15 minutos para estabilizar el

gradiente de concentracin, y conseguir
uniformidad en la distribucin del inculo.

6.-Discos con antibiticos.

PREPARACIN:
Usar

papel filtro Whatman N 2.

Tambin es prctico utilizar diferentes colores de
papel para identificar mas fcilmente los antibiticos
que se agreguen.
El tamao puede ser de 5 o 10 mm., pero en la
practica se han impuesto los de 5 mm. ya que con
otro tamao los resultados son los mismos y la
ventaja es que en una placa de cultivo podemos
probar hasta 6 antibiticos.
Los antibiogramas se hacen con un solo disco por
antibitico.

Tcnica para impregnar los discos.

Existen dos tcnicas:

Por determinacin de
absorbente del disco:
Por impregnacin global:

la

capacidad

Los discos de penicilina son los ms

susceptibles de
vencerse y deben
renovarse peridicamente, los dems
antibiticos duran ms hasta un ao.
Conservar los discos entre 2 -8 C.

7.- Aplicacin de los discos.

Retirar los discos de sus envases y

aplicarlos con la ayuda de una pinza
(flameada a la llama) ejerciendo una
ligera compresin contra el medio de
cultivo para asegurar un intimo contacto
entre ambos.
Se deben aplicar a una distancia de 15
mm entre ellos y del borde de la placa,
para que no haya sper posicin en los
halos de inhibicin.
No aplicar ms de 6 discos por placa.

8.- Incubacin.

Se realiza una vez aplicado los discos

dentro de los 15 minutos.
Colocar las placas en posicin
invertida a 37C durante 18 24
horas.

9.- Lectura

Los dimetros de las zonas de inhibicin, se miden a ojo

desnudo con la ayuda de un calibre o una regla milimtrica.
Comparar con las tablas de interpretacin de resultados.
Segn el dimetro obtenido se informar la susceptibilidad
a
los
agentes
antimicrobianos
como
SENSIBLE,
INTERMEDIO o RESISTENTE.
No deber informarse nunca un resultado indicando las
medidas del halo de inhibicin.
En la medicin del dimetro, deber tenerse en cuenta el
propio del disco, por lo cual la medicin se har desde el
centro del disco hasta el borde de la zona de inhibicin si es
que se mide el radio, multiplicando este resultado por 2.
Podemos decir que las cepas sensibles tienen grado de
sensibilidad adecuado a la dosis de antibitico, cepas
resistentes no responden a la terapeutica.

Causas de error:

Conservacin de los discos: si no se mantienen dentro del rango de

temperatura y no se protegen adecuadamente de la humedad pueden
dar halos de inhibicin incorrectos.
pH del medio: si no es adecuado puede dificultar el normal desarrollo
de los grmenes.
Empleo de un medio inadecuado: el Muller Hinton no contiene
sustancias antagonistas de los antibiticos que pueden resistir cambios
de Ph como consecuencia del crecimiento bacteriano, otros medios no
consideran estos factores.
Espesor de la capa de agar: una capa demasiado delgada va
producir halos de inhibicin falsamente amplios y una capa gruesa
producir halos falsamente pequeos por lo que los resultados no sern
reales.
Turbidez del inoculo: deber estandarizar a fin de que los resultados
sean producibles, una suspensin demasiado diluida proporciona halos
grandes y en una concentrada los halos sern pequeos.
Temperatura de incubacin: mantener 35-37C para asegurar el
adecuado desarrollo de los grmenes.

Desventajas:

Es
aplicable
a
bacterias
de
crecimiento
rpido
(los enterococos son
de lento crecimiento).
Nos dice si la cepa es
sensible o resistente,
pero no dice nada
acerca de la mnima
concentracin
inhibitoria.

B) ANTIBIOGRAMAS ESPECIALES

Bajo este rubro consideraremos a los Antibiogramas Cuantitativos.

Determinacin de la concentracin inhibitoria mnima (CIM)

Determinacin de la concentracin bactericida mnima (CBM).

La CIM mide la actividad bacteriosttica de las drogas antibacterianas, y

est dada por la mnima concentracin expresada en g/ml, capaz de
detener el desarrollo visible de un cultivo.
La CBM mide la actividad letal de estas drogas expresada en g/ml.
En una dilucin seriada, solamente es posible evidenciar la CBM, mediante
repiques a nuevos medios slidos o lquidos, de aquellos tubos en los que no
se observ desarrollo bacteriano luego de una incubacin durante 18 24
horas.
La CBM estar dada por la concentracin correspondiente a la menor
concentracin del tubo cuyo subcultivo no dio desarrollo bacteriano.
Los valores de CIM y de CBM son iguales o muy cercanos en los
antibiticos bactericidas, en cambio en los antibiticos bacteriostticos
ambas concentraciones estn muy alejadas.
Esta tcnica es aplicable a todo tipo de bacterias aisladas de materiales
clnicos aerobios o anaerobios.

MTODO DE DILUCIN EN TUBOS

Consiste en hacer diluciones del antibitico en caldo y

luego agregar a cada tubo un volumen de la
suspensin microbiana cuya sensibilidad se quiere
probar incubando a 37 durante 24 hrs.
Es conveniente usar un testigo del medio de cultivo
bacteriano que debe mostrar turbidez y otro del
antibitico, que debe mantenerse lmpido.
Comparando con los testigos se observara cual es el
tubo que primero presenta turbidez tomndose como
CIM la del tubo anterior.
La concentracin se expresa en g/ml o unidades/ml.

Material:
1.
2.
3.
4.
5.

Suspensin bacteriana.
Solucin de antibiticos.
Tubos estriles para hemlisis largos.
Gradillas.
Pipetas estriles

1.- SUSPENSIN BACTERIANA:

Con la bacteria procedente de un cultivo de

no ms de 24 hrs se hace una suspensin
en caldo equivalente a una concentracin
entre 500.000 -1.000.000 bacterias/ml.
Esta suspensin se puede hacer de la
siguiente forma:

Se toma una ansada de cultivo que se suspende

en 10 ml. de solucin fisiolgica.
Homogenizar y retirar 0.1ml.
Colocar en un tubo con 7ml de caldo nutritivo.

2.- SOLUCIN DE ANTIBITICOS:

La disolucin se hace en agua destilada con

concentraciones variables del antibitico, de
acuerdo a la probable resistencia de la
bacteria problema.
En la practica para ahorrar tiempo se hace
1 o 2 concentraciones de 100 y 500 U/ml. o
microgramos/ml.
Pesado el antibitico mas el agua destilada
adecuada se coloca en frascos estriles que
se pueden congelar para su conservacin
hasta un mes.

Tcnica:

Si usamos 2 concentraciones debemos

preparar 2 series de tubos, o una serie
de tubos si usamos una sola dilucin.
Veremos la tcnica con una sola
dilucin ya que para dos solo repetimos
la serie.

INCULO
Suspensin Bacteria

Solucin de
antibitico (100 U.I./ml)

DESECHAR

Solucin
de ATB

N 1
100
1

N 2
50

N 3
25

N 4
12,5
1/8

N 5
6,25
1/16

N 6
3,17
1/32

N 7
1,56
1/64

N 8
0,78
1/128

N 9
(D)

N 10
(ND)

Colocar 10 tubos en la gradilla numerados del 1 al 10

Agregar 0.5ml de caldo nutritivo a todos los tubos menos al tubo N 1.
Agregar 0.5 ml de solucin de antibitico al tubo N 1, al tubo N 2 y al N 10.
Sacar 0.5 ml del tubo N 2 y depositar en el tubo N 3, mezclar; realizar el mismo procedimiento hasta el tubo N 8, de
este sacar 0.5ml y desechar.
Colocar 0.5 ml de suspensin bacteriana (Inculo) a todos los tubos, menos al tubo N 10.
Incubar a 37C durante 24hrs.
El tubo N 9 nos servir de control positivo (con desarrollo bacteriano).
Contiene solamente caldo nutritivo + inculo.
El tubo N 10 lo usaremos como control negativo, (sin desarrollo bacteriano).
Contiene solamente caldo nutritivo + antibitico.

LECTURA:

El control positivo (+) siempre debe mostrar turbidez debido al

desarrollo bacteriano.

El control negativo (-) debe estar lmpido.

Significa que el inoculo y el medio de cultivo han sido correctamente

preparados, en caso contrario la prueba no tiene valor, puesto que por
algn defecto se a inhibido el desarrollo de la bacteria.
Significa que el antibitico ha sido preparado correctamente, y que
ejerce su poder inhibitorio de desarrollo bacteriano.

Se observa cual es la dilucin menor que presenta turbidez,

tomando como concentracin inhibitoria mnima el tubo siguiente.
Por ejemplo: el tubo N 4 da turbidez, la CIM ser la del tubo N
5, o sea de 6,25 U/ml (en una serie preparada de 100 U/ml.)
La turbidez y la claridad de los tubos tiene que ser continua, no
deben existir tubos lmpidos mezclados con tubos turbios.

VENTAJAS:

Mayor exactitud.
Medicin cuantitativa de los resultados.
Permite usar variaciones microbianas.

DESVENTAJAS:

Son de orden prctico y econmico.

Mayor tiempo que se emplea.

Mayor cantidad de material usado