FOTOMETRÍA Karol Barboza A.

II Cuatrimestre, 2020
CONTENIDOS
Conceptos básicos

Fundamento

Aplicaciones
FOTOMETRÍA
Medición de la intensidad de la luz

• Brillo percibido por el ojo humano

Capacidad que tiene la radiación electromagnética de

estimular el sistema visual

El ojo humano no tiene la misma sensibilidad para todas

las longitudes de onda que forman el espectro visible.
• magnitudes radiométricas medidas para cada longitud de onda por un
factor que representa la sensibilidad del ojo para esa longitud
DEFINICIÓN
Es un método científico utilizado para medir cuanta luz absorbe una sustancia
química, midiendo la intensidad de la luz cuando un haz luminoso para a través de la
solución muestra.
Cuando un haz de luz incidente interactúa con
la materia produce una variedad de
fenómenos como refracción, reflexión,
absorción etc.

Una porción de la luz incidente es absorbida

y es representada como Ia

Otra porción es transmitida y es

representada como It.

Otra porción es reflejada y es representada

como Ir, representa un % tan bajo que es
despreciable.
CONSIDERACIONES
It depende de:
De la intensidad de la luz incidente
Del espesor del medio atravesado por la luz
De la estructura molecular de la sustancia disuelta en ese medio y también de la
estructura del solvente
De la concentración de dicha sustancia
De la longitud de onda utilizado en el haz incidente
De la temperatura del sistema
ESPECTROFOTOMETRÍA
ESPECTROFOTOMETRÍA
 ESPECTROFOTOMETRÍA
 Es la CUANTIFICACIÓN de la
cantidad de energía radiante
absorbida por las moléculas de
una muestra en función de las
longitudes de onda específicas.

 Se basa en la relación que existe

entre la absorción de luz por
parte de un compuesto y su
concentración.
BEER-LAMBERT
Beer
1852 August Beer: físico y matemático
alemán.
Ley de Beer: A mayor concentración de
la sustancia en la solución que atraviesa
la luz, menor va a ser la cantidad de luz
transmitida.
Lambert
1790 Johann Heinrich Lambert:
Matemático, Astrónomo, Filósofo.
Ley de Lambert: La cantidad de luz que
se transmite depende fuertemente del
espesor que debe atravesar.
 LEY DE BEER-LAMBERT
La absorbancia de una solución es directamente
proporcional a su concentración –a mayor número de
moléculas mayor interacción de la luz con ellas-; también
depende de la distancia que recorre la luz por la solución
–a igual concentración, cuanto mayor distancia recorre la
luz por la muestra más moléculas se encontrará-; y por
último, depende de ε, una constante de proporcionalidad
-denominada coeficiente de extinción- que es específica
de cada cromóforo.
LEY DE BEER-LAMBERT
Ley que indica la relación
directamente proporcional que existe
entre la absorbancia de una muestra
y su concentración, al ser constantes
los valores del trayecto óptico, la
longitud de onda de la radiación
incidente, la absortividad (cantidad
de luz absorbida por una solución)

A: a b c

A: absorbancia a: cuando C: g/L

b: ancho de paso de luz ε: cuando C: mol/L
c: concentración
LIMITACIONES LEY DE BEER
Dispersión de luz por partículas en la muestra

Fluorescencia de la muestra

Radiación no monocromática

Luz extraña

Cubetas sucias
DIAGRAMA BÁSICO
PARTES DEL ESPECTROFOTÓMETRO
ESPECTROFOTOMETRÍA
Selección de longitud de onda
• Longitud a la que la absorbancia del analito
(sustancia a analizar) es máxima

Cumplimiento de linealidad
• Curva de calibración
CURVA DE CALIBRACIÓN

Gráfica que relaciona la

concentración de al menos cinco
soluciones de estándar de
concentraciones conocidas, con la
absorbancia de cada uno de
ellos a la longitud de onda y: mx + b
máxima. y: absorbancia b: intercepto en la recta
m: pendiente x: concentración
FINALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN

Determinar si se Determinar hasta

cumple ley de Beer dónde se cumple

Determinar
concentración de la
sustancia
(interpolación o
factor)
USO DE BLANCOS
Blanco de reactivos Blanco de muestra
Todos los reactivos menos la muestra Todos los reactivos y la muestra excepto
el reactivo que genera color
Elimina coloración producto de los
reactivos Elimina absorbancias debido a la
turbiedad y pigmentos en la muestra
 CÁLCULOS
Cálculo de factor: Σconcentración patrones/
Σabsorbancia de patrones

Absorbancia de la muestra X factor

Cm: (Am/Ap)XCp
PRACTICA ESPECTROFOTOMETRÍA EJEMPLOS
DETERMINACIÓN DE GLUCOSA POR EL MÉTODO
GLUCOSA-OXIDASA (MODIFICADO POR SCHOSINSKY)
Muestra: suero o plasma libre de hemólisis. También LCR, orina

EDTA, citrato o heparina no causan interferencia

Separación de suero en un plazo de 30-60 minutos

Estabilización de glucosa en sangre 24h, 25°C con fluoruro de sodio

En sueros separados y no hemolizados: estable 8h, 24°C; 72h, 4°C

CONDICIONES QUE ALTERAN EL VALOR DE LA GLUCOSA
HIPERGLICEMIA

DM Pancreatitis Desórdenes
endocrinos

Fallo renal Enfermedad Medicamentos

crónico hepática
CONDICIONES QUE ALTERAN EL VALOR DE LA GLUCOSA
HIPOGLICEMIA

Insuficiencia Hipopituitarismo Enfermedad

adenocortical hepática grave

Insulinoma Neoplasias Medicamentos

extra páncreas
FUNDAMENTO DE LA DETERMINACIÓN

Glucosa oxidasa cataliza la oxidación de la

glucosa a ácido glucónico y peróxido de
hidrógeno.
El peróxido de hidrógeno en presencia de
peroxidasa, 4-aminofenazona y fenol forma
complejo coloreado
REACTIVOS
Solución amortiguadora de fosfatos
Reactivo glucosa oxidasa
Solución patrón de glucosa 100 mg/dL
 PROCEDIMIENTO
Patrón Muestra Blanco reactivo
Solución patrón 20 uL
Muestra 20 uL
Agua destilada 20 uL
Reactivo glucosa oxidasa 3,0 mL 3,0 mL 3,0 mL

Mezclar e incubar por 25 minutos a temperatura ambiente.

Leer absorbancias a 550 nm contra blanco de reactivos
PATRÓN Blanco Muestra
20uL 20uL 20uL
Reactivo
glucosa
oxidasa
3mL Incubación 5 minutos 37 °C
Lectura a 550nm
 CURVA DE CALIBRACIÓN
Concentración Vol patrón Vol de agua Vol final Absorbancia
600 mg/dL 5 5
400 mg/dL 3,330 1,670 5
200 mg/dL 1,670 3,330 5
100 mg/dL 0,830 4,170 5
50 mg/dL 0,417 4,583 5

Concentración Vol patrón Vol de agua Vol final Absorbancia

600 mg/dL 3 3
400 mg/dL 2 1 3
200 mg/dL 1 2 3
100 mg/dL 0,5 2,5 3
50 mg/dL 0,25 4,75 3
 EJEMPLO DE RESULTADOS
Proteínas totales Método de Biuret

Patrón (7g/dL) Muestra Blanco reactivo

Solución patrón 50 uL
Muestra 50 uL
Agua destilada 50 uL
Reactivo Biuret 2,5 mL 2,5 mL 32,5 mL
Absorbancia 0.339 0,334 0,087
 CURVA DE CALIBRACIÓN
Concentración Vol patrón Vol de agua Vol final Absorbancia
10 g/dL 1,0 1 0,432
7,5 g/dL 1,5 1,5 2 0,279
5,0 g/dL 0,5 0,5 1 0,169
2,5 g/dL 0,5 0,5 2 0,041

Cálculo de concentración utilizando el factor

Cálculo de factor: Σconcentración patrones/ (10+7,5+5,0+2,5) =20,14
Σabsorbancia de patrones (0,432+0,279+0,169+0,041)

Absorbancia de la muestra X factor

20,14 x 0,334 = 6,7g/dL
CÁLCULOS
Cálculo utilizando fórmula
Cm: (Am/Ap)XCp

0,334/0,339 X 7g/dL =
6,9
APLICACIONES

Ausencia o Prevención,
presencia de Cuantificación de Actividad de tratamiento,
parámetros estos parámetros numerosas enzimas diagnóstico,
analíticos seguimiento de
enfermedades.