Carrera: MEDICINA

Ctedra: BIOQUIMICA

TRABAJO PRCTICO DE LABORATORIO:

DETERMINACIN DE GLUCEMIA
OBJETIVOS: Conocer una tcnica de cuantificacin colorimtrica, metodologa de uso habitual en laboratorios de anlisis clnicos e investigacin biomdica. Ejercitarse en la obtencin de datos experimentales y procesamiento de los mismos. Familiarizarse con parmetros estadsticos utilizados en el tratamiento e interpretacin de datos experimentales.

INTRODUCCIN: La cuantificacin de la concentracin de una sustancia de inters presente en una muestra biolgica es de suma importancia ya que permite conocer en muchos casos el estado metablico de un individuo y las variaciones que sufre el parmetro estudiado en condiciones fisiopatolgicas. Los mtodos utilizados ms frecuentemente para cuantificar son los colorimtricos. Los mismos se basan en que: Muchas sustancias tienen color propio, o pueden dar lugar a productos finales coloreados. Hay una relacin directa entre la intensidad de este color y la concentracin del soluto en una solucin (como lo expresa la ley de Lambert -Beer). Una vez realizada la cuantificacin, es necesario analizar los datos obtenidos para llegar a conclusiones confiables. En esta instancia se recurre a las herramientas que aporta la Bioestadstica. DISEO DEL TRABAJO PRCTICO: El trabajo prctico consiste en que cada comisin lleve a cabo: 1. La determinacin colorimtrica de glucosa srica o plasmtica de una muestra incgnita. 2. El clculo de la media, el desvo estndar y el coeficiente de variacin de la muestra procesada por triplicado. 3. La graficacin de la curva de distribucin normal de glucemia obtenida a partir de los datos muestrales obtenidos por todos los alumnos 4. La obtencin de los valores normales de glucemia. 5. El anlisis de la utilidad de los parmetros obtenidos

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DESARROLLO EXPERIMENTAL Fundamento de la reaccin colorimtrica La glucosa es transformada por la glucosa oxidasa (GOD), en cido glucnico y perxido de hidrgeno el cual, en presencia de peroxidasa (POD), oxida el cromgeno (4-aminofenazona/fenol) convirtindolo en un compuesto de color rojo. GOD Glucosa + O2 H2O2 + cromgeno reducido (incoloro) Materiales Suero o plasma sanguneo humano obtenido de un paciente en ayunas. PRECAUCIN: trabajar con guantes de ltex y dejar todo el material de laboratorio utilizado 30 minutos en lavandina antes de proceder al lavado. Reactivos - Buffer fosfato - glucosa oxidasa (GOD) - peroxidasa (POD) - 4-Aminofenazona - fenol 170 mM pH= 7 5 U/ml 3 U/ml 0,28 mM 16 mM cido glucnico + H2O2 POD cromgeno oxidado + H2O (coloreado)

En el T.P se utilizar un KIT comercial usado en los laboratorios de anlisis clnicos. Todos los reactivos hasta aqu enumerados vienen preparados y constituyen la SOLUCION 1, que es la que se utiliza en las determinaciones. La solucin estndar o testigo tambin la provee el KIT. Solucin estndar: Procedimiento Disponer en una gradilla los tubos de ensayo a utilizar y rotularlos. Tener en cuenta que cada determinacin muestra y testigos se realiza por triplicado, excepto el tubo blanco. Pipetear con pipeta automtica en cada tubo las cantidades de la solucin de glucosa estndar para construir la curva de calibracin. Enjuagar la pipeta con agua destilada para cargar la muestra incgnita. Proceder luego como se indica en la Tabla 1: Glucosa 5,55 mM.

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Tubo 1 2 3 4 5 6

Suero o plasma -----------------------------------0,020

Solucin de Glucosa (ml) -------0,005 0.010 0,020 0,030 --------

Solucin de Trabajo(ml) 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0.

Luego del agregado de la solucin 1, mezclar con vrtex e incubar 37 en bao de agua durante 15 min. Leer la absorbancia de los tubos frente al blanco de reactivo en el espectrofotmetro, longitud de onda: 505 nm. Clculos 1. Confeccione en papel milimetrado una curva de absorbancia en funcin de mg de glucosa para la solucin estndar 2. Utilice la curva obtenida para calcular los mg de glucosa presente en la muestra y exprselos en mg glucosa / 100 mL de suero o plasma. 3. Utilice los tres datos obtenidos en el paso anterior para calcular la media, el desvo estndar y el coeficiente de variacin. 4. Todas las comisiones de los cuatro grupos analizarn los resultados obtenidos en la siguiente clase practica, para realizar una grfica de distribucin de frecuencias, calcular la media y los valores normales. INFORME 1. Complete la Tabla 1 con los valores de absorbancia obtenidos. 2. Adjunte los valores y resultados obtenidos segn el orden establecido en clculos 3 Qu conclusin puede sacar en base al coeficiente de variacin obtenido? 4) Cules son los valores normales obtenidos para la glucemia con este muestreo? GUA DE ESTUDIO 1- Fundamento de la reaccin colorimtrica del Trabajo Prctico. 2- Espectrofotometra. Ley de Lambert Beer. 3- Precauciones

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APENDICE I: ESPECTROFOTOMETRIA La luz visible es una variedad de energa radiante que forma parte del espectro electromagntico. Como se muestra en la Figura 1, la luz visible al ojo humano ocupa slo una pequea parte del mismo (de 400 nm a 700 nm).

Figura 1: Diagrama representativo del espectro electromagntico.

Algunas sustancias son coloreadas porque absorben la luz de cierta longitud de onda y dejan pasar las otras. Por ejemplo, una solucin roja debe su color a que trasmite el color cuya longitud de onda se encuentra entre 650-750 nm, en tanto absorbe las longitudes de onda ms cortas. Las soluciones incoloras (que no absorben la luz visible), absorben en el infrarrojo o el ultravioleta. Ley de Lambert Beer Cuando un rayo de luz atraviesa un medio homogneo de espesor b, en el cual hay especies absorbentes que estn en una concentracin c, parte de la luz es absorbida y parte es transmitida. Dicho de otra forma, la probabilidad de que un fotn sea absorbido al atravesar una muestra es directamente proporcional a la concentracin de las molculas absorbentes y al camino ptico recorrido. Para una determinada longitud de onda la relacin entre la luz incidente (lo) y la luz transmitida (l) esta dada por la ley de Lambert - Beer: T (transmitancia) = l = 10 lo
-k.c.b

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Se define Absorbancia (A), como: A = log T o sea

-1

= log lo = k.c.b I

A= k.c.b

La constante k es el coeficiente de extincin, es una caracterstica intrnseca de cada sustancia y depende de la longitud de onda, sus unidades dependen de las utilizadas para b y para c: b c k ancho de cubeta (camino ptico en la solucin) concentracin coeficiente de extincin molar coeficiente de extincin especfico cm Mg/L 1 -1 M x cm -1 -1 L x g x cm

ESPECTROFOTMETRO Es un instrumento para medir absorbancia y bsicamente se compone de una fuente de radiacin electromagntica, un dispositivo para monocroma, una celda o cmara de muestra, detectores fotosensibles, amplificador y sistema de registro (procesador de la seal) (Figura 2).

Figura 2. Diagrama de Espectrofotmetro de un haz a) y de doble haz b)

Figura 2: Diagrama representativo de los componentes de un espectrofotmetro.

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Bibliografa

Libros de texto: Voet &Voet., ., BIOQUMICA Ediciones Omega 1992. Lehninger,A. ., BIOQUMICA. Segunda edicin. Ediciones Omega S.A. Barcelona.1995. Stryer L. Bioqumica. Editorial Revert S.A. (1995). Murray, Robert et al., BIOQUMICA DE HARPER, Vigsima edicin. Editorial El manual moderno S.A. Bogot. 1997. Devlin, T., BIOQUMICA. Tercera edicin. Editorial Revert S.A. Barcelona. 1999. Blanco, A. QUMICA BIOLGICA. Editorial el Ateneo 2000.

APENDICE II: BIOESTADISTICA Qu es y para que sirve la Bioestadstica? La Bioestadstica es la aplicacin de los mtodos estadsticos a la resolucin de problemas que surgen en los estudios biolgicos. Los mtodos estadsticos son procedimientos creados y desarrollados que permiten disear investigaciones, analizar los datos para obtener conclusiones cientficas a partir de ellos y finalmente determinar el grado de confiabilidad de esas conclusiones. Por qu es necesario aplicar procedimientos biolgicos? estadsticos a los problemas

Primero: por la imposibilidad de recoger y manejar un conjunto numeroso de datos. Por ejemplo si se desea conocer el peso promedio de los bebs de tres meses para confeccionar una curva de crecimiento, es evidente la dificultad de pesar todos los bebs de tres meses. Por lo tanto, se toma un nmero limitado y a partir de los datos correspondientes a ese conjunto limitado (muestra de individuos) se extraen datos acerca del peso promedio. Segundo: debemos recurrir a los mtodos estadsticos debido a la gran variabilidad del material gentico. Es necesario utilizar mtodos que nos permitan generalizar y adems, evaluar la magnitud del error que cometemos al efectuar esas generalizaciones. Para tratar estadsticamente un fenmeno biolgico debemos construir primero un modelo matemtico adecuado, que utilizaremos para explicar este fenmeno de la mejor manera posible. Los modelos matemticos pueden ser: determinsticos o aleatorios. Se denomina modelo determinstico aqul que permite determinar el resultado de un experimento cuando se conocen las condiciones en que se realiza. Por ejemplo: P.V = n.R.T (ecuacin general de los gases) Log I0 / I = k x b x c

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En cambio en un modelo aleatorio no se conoce el resultado exacto, no se puede predecir, pero es posible repetirlo indefinidamente bajo las mismas condiciones; se conoce el conjunto de todos los resultados posibles y si se repite un gran nmero de veces, hay cierta regularidad en los resultados. Por ejemplo: Determinar el nmero de glbulos rojos en 1 mL de sangre. Sembrar 50 semillas de cierta especie y al cabo de un tiempo contar cuantas germinaron. As como par el modelo determinstico basta con una frmula, para trabajar con un modelo aleatorio debemos conocer nuevos conceptos como: frecuencia, frecuencia relativa, polgono de frecuencia, media aritmtica, desvo estndar y coeficiente de variacin. Frecuencia absoluta ( fi ) = nmero de veces que aparece un resultado o variable. Ej: 20 veces aparece el valor 1 3 veces aparece 1,2 4 veces aparece 1,3 2 veces aparece 1,1 Frecuencia relativa ( hi ) = proporcin con que aparece cada valor de la variable. Ej: 20/29; 3/29; 4/29 y 2/29 Media aritmtica (X) = promedio de todos los valores obtenidos de la muestra. X = xi / n xi = valor de cada observacin n = nmero total de observaciones Ej: 1,06 Varianza ( s ) = medida de dispersin de la muestra. Cuanto ms dispersos sean los datos de una muestra, mayor ser su varianza muestral.
2 2 S = ( xi - x ) / n-1 2

Desvo estndar = expresa la amplitud de la variacin de los resultados experimentales. S = S2 Cuando el nmero de observaciones es muy grande, tabular todos los datos resulta largo y poco claro; por ello se condensan, subdividiendo la amplitud de la serie de observaciones en intervalos iguales, cada uno de los cuales se llama intervalo de clase. Intervalo = rango de valores que uno define dentro de una variable continua. Ej: 0,95 a 1,15 y 1,15 a 1,25 (dos intervalos, siguiendo el ejemplo)

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Cuando las observaciones figuran condensadas en intervalos de clase, uno de los grficos que se utilizan para representarlas son los polgonos de frecuencia, graficando hi en funcin del punto medio del intervalo de clase. Si el nmero de observaciones es muy grande y la amplitud de los intervalos de clase muy pequeos, el polgono de frecuencia se aproxima a una curva de distribucin de frecuencia, que si es de distribucin normal, adopta la forma ya observada de distribucin Gausiana o normal (Figura 1).

Figura 1: Valores de una curva normal incluidos entre el promedio X y 1S = 68 %; X y 2S = 95 % y X y 3S = 99, 7 %.

Grfico de Gauss

El nico tipo de cantidad que puede medirse con exactitud perfecta es un conjunto especfico de objetos discretos, por ejemplo el nmero de objetos del museo de la

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Universidad Nacional del Comahue. En cambio al medir cualquier cantidad de variaciones continuas, por ejemplo la masa o la longitud, siempre existe cierta incertidumbre. Adems de los errores que resultan de las equivocaciones inherentes al experimentador, estn tambin los errores implcitos en el mtodo y en el aparato de medicin empleado. En consecuencia, es necesario que al hacer cualquier medicin se efecten al menos tres o ms determinaciones. La precisin de una medida indica la consistencia mutua entre varias determinaciones repetidas, es una medida de la reproducibilidad del experimento. El promedio aritmtico de los valores obtenidos se considera normalmente como el mejor valor. La medida ms simple de la precisin es la desviacin promedio (ver apndice de bioestadstica). Existen nmeros ejemplos de fenmenos aleatorios: 1- Tirar un dado y ver que nmero sale. 2- se le asigna un tratamiento determinado a un paciente y a la semana se observa si mejor, empeor o sigue igual. 3- En 1 ml de sangre se determina el nmero de glbulos rojos. As como para enunciar un modelo determinstico nos bastaba con una frmula, para poder dar un modelo aleatorio necesitamos conocer nuevos conceptos como frecuencia, espacio muestral, intervalo, distribuciones, media, etc. BIBLIOGRAFIA Day Junior, Underwood, A. (1993). Qumica Analtica Cuantitativa. Quinta Edicin, Prentice Hall. Cooper, T. (1984). Instrumentos y Tcnicas de Bioqumica. Ed. Revert.