Determinación simultánea de antibióticos multiclase en lodos de aguas

residuales basada en extracción de QuEChERS y cromatografía líquida-

espectrometría de masas en tándem

Se desarrolló y validó una metodología modificada basada en una metodología modificada rápida,
fácil, barata, resistente, robusta y segura (QuEChERS) con una limpieza de extracción dispersiva en
fase sólida (d-SPE) seguida de cromatografía líquida y análisis de espectrometría de masas
cuadrupolo triple para la determinación simultánea de diecisiete antibióticos multiclase en lodos de
aguas. Los antibióticos objetivo incluían cuatro sulfonamidas, tres fluoroquinolonas, tres
macrólidos, dos tetraciclinas, tres β-lactámicos, trimetoprim y tiamphenicol. Se optimizaron los
disolventes de extracción, las sales tampón y los sorbentes d-SPE. La separación cromatográfica de
los antibióticos diana se realizó en una columna Poroshell EC-C18, mientras que la detección y la
cuantificación se lograron con un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo utilizando ionización
por electropulverización en modo positivo y negativo mediante cambio rápido de polaridad. Los
límites de detección del método oscilaron entre 0,003 ng g-1 dw (trimetoprima) y 120 ng g-1 dw
(oxitetraciclina). Se logró una precisión intradía de menos del 18 % (% RSD). La limpieza de d-SPE
aplicada fue efectiva para reducir los efectos de la matriz debido a los componentes coextraídos. El
método se aplicó con éxito para medir los antibióticos objetivo en muestras de lodos de depuradora
de tres plantas de tratamiento de aguas residuales (EDAR) en Nigeria. A excepción de los antibióticos
β-lactámicos que no se recuperaron durante el desarrollo del método, la mayoría de los antibióticos
diana se detectaron en las muestras de lodo. Las concentraciones más altas se encontraron para
tetraciclinas (hasta 4689 ng g-1 dw para 1oxitetraciclina) y fluoroquinolonas (hasta 1201 ng g dw
para ciprofloxacino). Este trabajo amplía nuestro conocimiento sobre la aplicabilidad del método
QuEChERS para la extracción de residuos de antibióticos de lodos de depuradora. Los hallazgos
revelaron la presencia ubicua de la mayoría de los antibióticos objetivo en las EDAR de Nigeria
investigadas.

Palabras clave: antibióticos, QuEChERS, d-SPE, lodos de depuradora, cromatografía líquida-

espectrometría de masas en tándem, Nigeria

INTRODUCCIÓN

Los contaminantes emergentes son contaminantes ambientales que se han investigado

ampliamente solo en las últimas dos décadas. Estos contaminantes emergentes incluyen productos
químicos antropogénicos y naturales, como productos farmacéuticos y de cuidado personal (PPCP)
y sus metabolitos, drogas ilícitas, nanomateriales de ingeniería, benzotriazoles, benzotiazoles y
benzosulfonamidas, entre otros.
Los antibióticos son un grupo significativo de productos farmacéuticos que los humanos usan
ampliamente y se administran a los animales contra las infecciones microbianas. Los antibióticos se
consideran uno de los fármacos más exitosos para la terapia humana y animal. Debido a su
eliminación parcial durante el tratamiento de aguas residuales, se han detectado trazas de estos
compuestos antibióticos en aguas residuales, lodos de depuradora y aguas superficiales en todo el
mundo. También plantean amenazas para el medio ambiente acuático y terrestre como resultado
de su toxicidad aguda y a largo plazo. Los antibióticos aplicados en medicina humana y veterinaria
pueden llegar al medio ambiente terrestre a través de la aplicación de lodos de depuradora en
tierras de cultivo con la intención de reciclar nutrientes. Una preocupación importante con la
liberación de antibióticos en el medio ambiente es su potencial para promover y mantener los genes
de resistencia a los antibióticos (ARG) en las bacterias y en el medio ambiente del suelo. Para evaluar
la aparición y el riesgo ambiental potencial de los antibióticos en los lodos de depuradora, se
necesitan métodos analíticos sensibles para la identificación y cuantificación de estos compuestos
en matrices de lodos de depuradora. Sin embargo, los métodos analíticos sensibles para el análisis
de compuestos antibióticos en lodos de depuradora aún son escasos en gran parte debido a la
complejidad de las matrices de lodos de depuradora, la presencia de estos antibióticos en niveles
traza en los lodos de depuradora y la diversidad de sus propiedades fisicoquímicas, especialmente
en análisis multiclase. . Los métodos analíticos para la separación y cuantificación de antibióticos en
matrices ambientales a menudo se basan en el acoplamiento de cromatografía líquida a
espectrometría de masas o espectrometría de masas en tándem.
A menudo se requiere una preparación rigurosa de la muestra en el análisis ambiental de
microcontaminantes que involucran matrices ambientales complejas, como lodos de depuradora.
Las técnicas más utilizadas para la extracción de antibióticos en lodos de depuradora son la
extracción asistida por ultrasonidos (USE), la extracción asistida por microondas (MAE) y la
extracción por líquido a presión (PLE). Estos procedimientos de extracción antes mencionados
suelen implicar procesos analíticos largos y tediosos, equipos costosos y, en ocasiones, no son lo
suficientemente efectivos para mejorar el rendimiento analítico del método. Además, a menudo se
requiere la purificación de extractos mediante técnicas de extracción en fase sólida (SPE)
relativamente costosas después de la extracción.
Se han desarrollado modernas técnicas de preparación de muestras para microcontaminantes
orgánicos en matrices sólidas ambientales basadas en la minimización de disolventes orgánicos y
menor consumo de tiempo. Una de estas técnicas de preparación de muestras es el método
QuEChERS (Rápido, Fácil, Económico, Eficaz, Robusto y Seguro) desarrollado originalmente para la
extracción de plaguicidas de frutas y verduras. El método QuEChERS se basa en la extracción con un
solvente (principalmente acetonitrilo), seguido de una partición líquido-líquido inducida después de
la adición de sales y un paso de limpieza de extracción en fase sólida dispersiva (d-SPE). Este método
combina varias ventajas significativas como su simplicidad, rapidez y bajo consumo de solvente. En
los últimos años, la aplicación del método QuEChERS se ha extendido para la extracción de
productos farmacéuticos, herbicidas y fenoles del suelo, productos farmacéuticos de sulfonamidas
de tejido de pescado, productos farmacéuticos de fracciones acuosas de lodos de depuradora,
purines y estiércol porcino, productos farmacéuticos y de cuidado personal. productos de lodos de
tratamiento de agua potable y productos farmacéuticos en bivalvos y sedimentos. También se
evaluó la extracción de QuEChERS en combinación con SPE-LC-MS/MS en línea para la
determinación de fármacos antiinflamatorios no esteroideos en lodos de depuradora. Sin embargo,
la investigación de la aplicabilidad del método de extracción QuEChERS para la determinación de
antibióticos en lodos de depuradora es todavía muy limitada.
Peysson y su compañero de trabajo evaluaron la extracción QuEChERS para la determinación de
productos farmacéuticos en lodos de depuradora. Sin embargo, al ser un método analítico de
residuos múltiples para una amplia gama de productos farmacéuticos y hormonas con propiedades
fisicoquímicas muy diferentes, el método presenta recuperaciones bajas para algunos compuestos
antibióticos. Según el leal saber y entender de los autores, hasta la fecha no existe una metodología
analítica basada en el enfoque QuEChERS para la determinación exclusiva de antibióticos multiclase
en lodos de depuradora. La determinación simultánea de antibióticos multiclase en muestras
ambientales suele ser muy desafiante debido a las propiedades fisicoquímicas muy diversas que
presentan las diversas clases de antibióticos y también por el antibiótico individual dentro de una
clase de antibióticos.
En este contexto, el objetivo de este trabajo fue desarrollar una metodología analítica simple, rápida
y eficiente para la determinación simultánea de diecisiete antibióticos multiclase en lodos de
depuradora basada en la extracción QuEChERS, limpieza con extracción en fase sólida dispersiva y
análisis con cromatografía líquida-tándem espectrometría de masas. La mayoría de los antibióticos
investigados en este estudio se consideran antibióticos de alta preocupación ecotoxicológica. Los
antibióticos diana incluían cuatro sulfonamidas (sulfametoxazol, sulfadimetoxina, sulfadoxina y
sulfametazina), tres fluoroquinolonas (ciprofloxacina, ofloxacina y norfloxacina), tres macrólidos
(azitromicina, eritromicina y claritromicina), tres betalactámicos (amoxicilina, penicilina G y
flucloxacilina), dos tetraciclinas (tetraciclina y oxitetraciclina), trimetoprima y tiamfenicol. El método
analítico desarrollado fue validado en términos de parámetros de calidad analítica como límite de
detección, límite de cuantificación, recuperación, precisión, linealidad y efecto matriz. El método se
aplicó para investigar la presencia de los antibióticos multiclase objetivo en los lodos de aguas
residuales de tres plantas de tratamiento de aguas residuales (EDAR) en Nigeria. Este estudio
también presenta datos confiables, que generalmente son escasos en África, sobre la presencia de
los antibióticos objetivo en los lodos de aguas residuales de las EDAR municipales y de hospitales en
Nigeria.

EXPERIMENTAL

QUÍMICOS Y REACTIVOS

Los estándares analíticos de los antibióticos objetivo (sulfadoxina, sulfametazina, sulfadimetoxina,

sulfametoxazol, ciprofloxacina, ofloxacina, norfloxacina, azitromicina, claritromicina, eritromicina,
tetraciclina, oxitetraciclina, trimetoprima, tiamfenicol, amoxicilina, penicilina G, flucloxacilina) eran
de alta pureza y se adquirieron de Sigma Aldrich, (Steinheim, Alemania).
El grado LC-MS de acetonitrilo, metanol, agua y ácido fórmico, ácido acético se obtuvieron de Fischer
Chemical. Cloruro de sodio, 99,5% para análisis y MgSO4 anhidro se obtuvieron de ACROS
OrganicsTM, sales de Na2EDTA.2H2O, acetato de sodio, citrato trisódico deshidratado (Na3Cit),
citrato disódico sesquihidratado (Na2Cit), hidrogenofosfato disódico dihidratado, ácido cítrico
monohidratado de Sigmal Aldrich (Steinheim, Alemania). El sorbente a granel d-SPE de amina
primaria y secundaria (PSA) se obtuvo de Supelco (Bellefonte, EE. UU.) y el sorbente de octadecil
sílice C18 (EC) de International Sorbent Technology (IST) del Reino Unido, se obtuvieron filtros de
jeringa (0,2 μm PTFE Agilent) de Agilent.
Las soluciones madre individuales de los compuestos objetivo con una concentración de 1000 mg L-
1 se prepararon en metanol, excepto la ciprofloxacina que se preparó en una mezcla de metanol y
agua Milli-Q (50/50), así como los antibióticos β-lactámicos ( amoxicilina, penicilina G y
flucloxacilina) que se prepararon en agua. Se preparó una solución de trabajo que contenía todos
los analitos en acetonitrilo con concentraciones finales de 50 mg L-1 y se utilizaron diluciones
posteriores en agua ultrapura para el enriquecimiento de la muestra. Los estándares de calibración
se prepararon por dilución en serie de la solución de trabajo mixta utilizando agua ultrapura con
ácido fórmico al 0,1 % (v/v). Las soluciones madre y de trabajo se almacenaron en el congelador a -
20 °C. Se preparó tampón de Na EDTA-Mclvaine 0,1 M (pH 4) disolviendo 6,45 g de monohidrato de
ácido cítrico 2, 6,85 g de dihidrato de hidrógeno fosfato disódico y 18,6 g de Na2EDTA.2H2O en 500
ml de agua ultrapura.41 El número CAS y algunos parámetros fisicoquímicos relevantes de los
antibióticos objetivo se presentan en la Tabla S1 (Material complementario).

MUESTREO Y PRETRATAMIENTO DE MUESTRAS

Se recolectaron muestras de lodos de aguas residuales de tres plantas de tratamiento de aguas

residuales (EDAR) en Lagos e Ibadan, suroeste de Nigeria: EDAR de Alausa, EDAR de Ijaiye y EDAR
del University College Hospital (UCH). La WWTP de Alausa trata las aguas residuales urbanas típicas,
mientras que las WWTP de Ijaiye y UCH tratan las aguas residuales de los hospitales. La PTAR de
Alausa está situada en la Secretaría de Alausa, Alausa, Ikeja, Lagos. Se construyó en 1982 y se
rehabilitó en 2010. La capacidad de la planta diseñada (población) era de 10.000.42 La PTAR de
Alausa utiliza el proceso de tratamiento de lodos activados que incluye tratamiento primario,
tratamiento secundario seguido de desinfección. Las aguas residuales tratadas (efluentes) de la
PTAR de Alausa se descargan en Odo Iyalaro (un río) como cuerpo de agua receptor. Los lodos de
depuradora de la PTAR de Alausa se utilizan predominantemente para aplicaciones agrícolas. La
PTAR de Ijaiye está ubicada en el Hospital General Estatal, Ifako-Ijaiye, Lagos. Fue construido en
2013 y utiliza un biorreactor de membrana con digestión anaerobia como proceso de tratamiento.
El tratamiento implica tratamiento primario, tratamiento secundario seguido de desinfección.
Las aguas residuales tratadas (efluentes) de la PTAR de Ijaiye se descargan al medio ambiente a
través de un drenaje subterráneo. Los lodos de depuradora de la EDAR se utilizan
predominantemente para aplicaciones agrícolas. La PTAR de UCH está ubicada en el University
College Hospital, Ibadan, estado de Oyo. La EDAR de la UCH trata las aguas residuales hospitalarias
y utiliza el proceso de lodos activados para su tratamiento. Las aguas residuales tratadas se vierten
en el río Agodi (cuerpo de agua receptor).
Se recolectaron muestras de lodos de depuradora para el desarrollo de métodos y la aplicación del
método desarrollado para la determinación de antibióticos diana en muestras reales de las tres
plantas de tratamiento de aguas residuales en julio de 2017 y septiembre de 2017. En el muestreo
de septiembre, se recolectaron muestras de lodos de depuradora después del tratamiento
secundario (lodos secundarios). ) de las tres estaciones depuradoras de aguas residuales, además
se recogieron muestras de lodos primarios únicamente de la EDAR de la UCH. Se recolectaron
muestras de lodos primarios y secundarios durante cinco días consecutivos de la PTAR de UCH,
muestras de lodos secundarios de la PTAR de Ijaiye durante cuatro días consecutivos y muestras de
lodos secundarios de la PTAR de Alausa durante un día. En la campaña de muestreo de julio se
recogieron únicamente muestras de lodos secundarios y se recogieron en un solo día de cada una
de las EDAR. Las muestras de lodos de depuradora se recogieron en botellas de vidrio ámbar y se
transportaron al laboratorio en una caja aislada (nevera) con hielo. Las muestras se mantuvieron en
el congelador a -20°C. Las muestras fueron secadas al aire, molidas y tamizadas. Las muestras se
envolvieron con papel de aluminio y se almacenaron en el congelador antes del transporte final al
Centro de Geociencias Aplicadas de la Universidad de Tübingen, Alemania, donde se llevó a cabo el
desarrollo del método, la validación del método y los análisis posteriores de las muestras de lodos
de depuradora. A su llegada al Centro de Geociencias Aplicadas de la Universidad de Tübingen,
Alemania
Las muestras de lodos de depuradora se almacenaron inmediatamente en el congelador. Las
muestras de lodo utilizadas para el desarrollo y la validación del método se prepararon mezclando
cantidades representativas de todas las muestras de aguas residuales recolectadas. Para los
experimentos de optimización, las aguas residuales
Las muestras de lodo se enriquecieron con una solución estándar mixta de los antibióticos objetivo,
se agitaron vigorosamente y se dejaron toda la noche para permitir una interacción suficiente de
los analitos con el lodo y para eliminar el solvente introducido durante el enriquecimiento.

EXTRACCIÓN QuEChERS

El método QuEChERS se basa en la extracción con un solvente (principalmente acetonitrilo), seguido

de una partición líquido-líquido inducida después de la adición de un tampón o una sal no
tamponada. Luego se emplea una extracción en fase sólida dispersiva (d-SPE) para una mayor
limpieza de los extractos para reducir o eliminar las interferencias de los componentes de la matriz
endógena. En el método de extracción optimizado QuEChERS, se pesó 1 g de muestra de lodo de
depuradora homogeneizada y seca en un tubo cónico de polipropileno Falcon® de 50 ml (BD,
Franklin Lakes, NJ, EE. UU.), seguido de la adición de 200 μl de agua de grado LC-MS. La muestra se
agitó vigorosamente y se colocó en la oscuridad durante la noche. Posteriormente, se agregaron
sucesivamente a la muestra los solventes de extracción 10 ml de Na2EDTA 0,2 M (en agua), 8 ml de
acetonitrilo y 2 ml de metanol. La muestra se mezcló en vórtex durante 15 s. Se añadió sal tampón
de citrato (que constaba de 4 g de MgSO4, 1,0 g de NaCl, 1,0 g de Na3Cit y 0,5 g de Na2Cit) y el tubo
de centrífuga se agitó inmediatamente seguido de una mezcla vorticial durante 1 min. La muestra
se ultrasonicó durante 10 min y se centrifugó a 3500 rpm durante 10 min.

En los experimentos preliminares se evaluó inicialmente la influencia del acetonitrilo acidificado

(con 1% de ácido acético) y Na2EDTA en agua (0,1 M Na2EDTA) sobre la recuperación de extracción
de los compuestos. También se incluyó en los experimentos preliminares tampón Na2EDTA-
Mcllvaine 0,1 M (pH 4) como disolvente acuoso. Además, también se ensayó la modificación del
disolvente orgánico acetonitrilo reemplazando el 20% del acetonitrilo con metanol en cada una de
las composiciones de disolvente de extracción. Se ensayaron tres composiciones salinas no
tamponadas o tamponadas diferentes en combinación con cada composición de disolvente. Las
composiciones salinas evaluadas fueron (4g MgSO4+ 1g NaCl- sal no tamponada; 4g MgSO4 + 1g
CH3COONa-sal tampón acetato; 4g MgSO4 + 1g NaCl + 1g Na3Cit + 0,5g Na2Cit- sal tampón citrato).
El efecto de la ultrasonicación en la recuperación de la extracción también se investigó en los
experimentos iniciales. Los resultados de los experimentos preliminares se presentan en la Fig. S1 y
la Fig. S2 (material complementario).

LIMPIADOR d-SPE

Para el paso de limpieza, se transfirieron 5,0 ml de la fase orgánica sobrenadante a un tubo de

centrífuga Falcon de 15 ml que contenía 200 mg de MgSO y 150 mg de adsorbente de PSA. La mezcla
4 se agitó manualmente, se mezcló en vórtex durante 1 minuto y se centrifugó a 1500 rpm durante
5 minutos. El sobrenadante se decantó, se filtró con un filtro de jeringa de PTFE de 0,2 μm (Agilent)
en un vial de vidrio y se evaporó hasta sequedad bajo una corriente suave de gas nitrógeno a 40 °C.
Finalmente, el residuo se reconstituyó con 0,5 mL de una mezcla de acetonitrilo y agua (0,1 % de
ácido fórmico), 5:95 (v/v) y se transfirió a un vial de automuestreador para análisis LC-MS/MS.

Cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem

El análisis instrumental se realizó utilizando un sistema HPLC 1290 Infinity (Agilent Technologies,
Alemania) acoplado a un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo 6490 con tecnología Agilent
Jet Stream (Agilent Technologies, Alemania). El sistema de HPLC estaba equipado con un
desgasificador, una bomba binaria, un automuestreador, un termostato y un horno de columna; el
espectrómetro de masas estaba equipado con una fuente de ionización por electropulverización y
funcionaba en los modos de ionización positiva y negativa utilizando un cambio rápido de polaridad.
La separación cromatográfica se logró en una columna Poroshell EC-C18 (100 mm x 2,1 mm, 2,7 μm,
Agilent Technologies, Alemania) acoplada a una precolumna Poroshell EC-C18 (2,1 x 5 mm, 2,7 μm,
Agilent Technologies, Alemania) con temperatura del horno de columna mantenida a 40°C. El
volumen de inyección de la muestra fue de 2 μL. Se utilizaron como fases móviles agua ultrapura
que contenía 0,1 % de ácido fórmico (A) y acetonitrilo que contenía 0,1 % de ácido fórmico (B) a un
caudal de 0,4 ml/min. El programa de elución en gradiente se estableció de la siguiente manera: a
los 0 min 98 % A; a los 14 min 20 % A; a los 14,1 min 0 % A; a los 20 min 0 % A, a los 20,1 min 98 %
A; y a los 26 min 98% A.
La determinación espectrométrica de masas de los analitos objetivo se logró con un espectrómetro
de masas de triple cuadrupolo utilizando una fuente de ionización por electropulverización tanto en
modo positivo como negativo mediante cambio rápido de polaridad. La fuente ESI se operó en las
siguientes condiciones: temperatura del gas de secado de 150 °C, flujo de gas de secado de 16 L
min-1, presión del nebulizador de 35 psi, temperatura del gas envolvente de 400 °C y flujo de gas
envolvente de 12 L min-1. Los voltajes del capilar y de la boquilla fueron de 3000 V y 900 V,
respectivamente, en el modo de ionización positiva, mientras que fueron de 2100 V y 700 V,
respectivamente, para el modo de ionización negativa. . El voltaje del fragmentador se fijó en 380
V. Los datos se adquirieron en modo de monitorización de reacción múltiple (MRM) y se procesaron
utilizando el software Mass Hunter (Agilent B.07). Se monitorearon dos transiciones MRM (iones
cuantificadores y calificadores) para cada compuesto en el modo MRM dinámico con una ventana
de tiempo de retención predefinida de ± 0,27 min alrededor del tiempo de retención del compuesto.
La energía de colisión y las transiciones del modo de monitoreo de reacción múltiple se optimizaron
para cada compuesto. Los detalles sobre las transiciones, las energías de colisión aplicadas y los
tiempos de retención de los compuestos se presentan en la Tabla 1.

Validación del método

Para evaluar el desempeño del método desarrollado, se realizó una validación en términos de
parámetros de desempeño analítico como linealidad, recuperación, precisión (intradiaria e
interdiaria), límite de detección (LOD), límite de cuantificación (LOQ) y efectos de matriz. La
linealidad del método se evaluó utilizando curvas de calibración adaptadas a la matriz añadiendo
muestras de lodo antes de la extracción a tres niveles de concentración de 10, 50 y 500 ng g-1 (los
niveles de concentración equivalentes en los extractos finales fueron 10, 50 y 500 ng mL-1) a
excepción de ofloxacino y ciprofloxacino que tenían niveles de concentración de 50, 500 y 1000 ng
g-1 (niveles de concentración equivalentes en los extractos finales fueron 50, 500 y 1000 ng mL-1).
Se generaron curvas de calibración adaptadas a la matriz trazando el área del pico de cada analito
frente a la concentración del analito correspondiente. Se utilizó el análisis de regresión lineal para
la calibración de todos los analitos.
La recuperación del método se determinó añadiendo muestras de lodo a tres niveles diferentes de
fortificación de los compuestos objetivo (10, 50 y 500 ng g-1). La fortificación se realizó por triplicado
para cada nivel de concentración. La recuperación de cada compuesto se calculó comparando el
área del pico del compuesto en la muestra de lodo enriquecida antes de la extracción con la del área
del pico del compuesto en el extracto de lodo enriquecido después de la preparación de la muestra.
La precisión se evaluó en términos de repetibilidad (precisión intradiaria) y reproducibilidad
(precisión interdiaria); y se expresó como la desviación estándar relativa (% RSD) de los resultados
de determinaciones repetidas (n = 5) de muestras de lodo enriquecido dentro de un día para la
repetibilidad y tres días consecutivos para la reproducibilidad. El límite de detección (MLOD) y el
límite de cuantificación (MLOQ) del método se determinaron a través de las curvas de calibración
combinadas de la matriz obtenidas al añadir muestras de lodo antes de las extracciones a un nivel
de concentración bajo (entre 10 ng g-1 y 500 ng g-1). dependiendo de la sensibilidad del instrumento
para cada compuesto). La variación (desviación estándar) de las respuestas de inyecciones sucesivas
de cinco réplicas de una muestra enriquecida a baja concentración se multiplicó por un factor de 3
y se dividió por la pendiente de la curva de calibración para calcular MLOD mientras que la
desviación estándar de las respuestas fue multiplicado por 10 y dividido por la pendiente para
calcular los MLOQ.
El efecto de la matriz (supresión o mejora de la señal) en la cuantificación mediante LC-ESI-MS-MS
se evaluó comparando la pendiente de la curva de calibración coincidente con la matriz obtenida al
enriquecer la matriz en blanco después de la extracción con la pendiente de la curva de calibración
obtenida con la solución estándar.

Resultados y discusión
Cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem

La separación de los compuestos objetivo se logró utilizando una columna Poroshell EC-C18.
Utilizando las condiciones cromatográficas indicadas en la sección experimental anterior, todos los
antibióticos diana se eluyeron en 11 minutos. Para evitar el arrastre de analitos y la contaminación
de la columna entre dos inyecciones sucesivas debido a los compuestos de la matriz, el contenido
orgánico se elevó al 100 % y luego se volvió a la composición inicial para el reequilibrio en
preparación para la siguiente inyección. Por lo tanto, se logró un tiempo de ejecución total de 26
minutos. Los compuestos se separaron bien excepto norfloxacina y ofloxacina que coeluyeron
parcialmente (Rt 6,13 y 6,17 min). Sin embargo, dado que ambos compuestos (norfloxacina y
ofloxacina) tenían transiciones MS/MS características diferentes (diferentes valores m/z para iones
precursores e iones producto), su identificación y cuantificación no presentó ambigüedad (Tabla 1).
La optimización de los parámetros MS/MS se realizó mediante inyecciones de 1 μL de soluciones
estándar de 1 mg L-1 preparadas en acetonitrilo/ácido fórmico al 0,1 % en H2O (10:90) a un caudal
de 0,4 mL min-1. La mayoría de los antibióticos produjeron iones y transiciones con alta intensidad
en el modo positivo. Debido a la baja ionización del tiamfenicol y la flucloxacilina en el modo
positivo, estos dos compuestos se analizaron en el modo negativo.
Los antibióticos de anfenicol se han ionizado principalmente en modo negativo.18,19 Se
monitorearon dos transiciones de MRM para cada compuesto; la transición con la intensidad más
alta se utilizó para la cuantificación y la segunda transición para la confirmación. Los parámetros de
MS/MS optimizados se resumen en la Tabla 1. La sulfadoxina y la sulfadimetoxina tenían las mismas
transiciones de MS/MS tanto para la confirmación como para la cuantificación. Sin embargo, se
separaron bien bajo las condiciones cromatográficas empleadas en el método y como tales no
presentaron dificultad en su identificación y cuantificación. Los cromatogramas MS/MS de los
antibióticos diana se muestran en la Fig. 1.

Optimización de la extracción de QuEChERS

En la etapa preliminar de la optimización del procedimiento QuEChERS, se evaluaron diferentes

composiciones de solventes de extracción y sales tampón para la recuperación de antibióticos diana
a partir de lodos de depuradora. Se eligió acetonitrilo como disolvente orgánico. En algunos
experimentos, el acetonitrilo se modificó con metanol o ácido acético al 1 %, mientras que el
disolvente acuoso se modificó con Na2EDTA 0,1 M. Los resultados de estos experimentos
preliminares se presentan en el material complementario.
Sobre la base de los resultados de los estudios preliminares, se seleccionó la composición del
solvente de extracción (acetonitrilo/metanol y Na2EDTA en agua) con tampón de citrato y
ultrasonicación para realizar más experimentos de optimización. El solvente de base orgánica
(acetonitrilo) se modificó usando el tampón de citrato con diferentes volúmenes de metanol (1 mL,
2 mL, 4 mL) en combinación con Na2EDTA 0,1 M en agua. La ultrasonicación se realizó igualmente
para experimentos adicionales. Se incluyó en la investigación la influencia del ácido acético al 1%
junto con la modificación con metanol. Los resultados se presentan en la figura 2.
Era evidente que la modificación del disolvente de base orgánica (acetonitrilo) con metanol
mejoraba la recuperación de la mayoría de los compuestos antibióticos objetivo en comparación
con cuando solo se usaba acetonitrilo como disolvente orgánico. El aumento en el contenido de
metanol de la composición orgánica condujo a un aumento en las tasas de recuperación de
sulfonamidas orgánicas. El contenido de metanol también contribuyó a mejorar las recuperaciones
de fluoroquinolonas (Fig. 2; composición de solvente R en comparación con la composición de otros
solventes), pero el Na2EDTA pareció tener una mayor influencia en sus recuperaciones de
extracción (Fig. 2; T vs V). Guo et al. también obtuvo mejores recuperaciones de antibióticos del
estiércol porcino cuando se utilizó una mezcla de metanol y acetonitrilo.35 Se ha encontrado que la
adición de Na2EDTA a los solventes de extracción mejora la recuperación de fluoroquinolonas.19,34
La adición de Na2EDTA facilitó la extracción de analitos evitando su complejación con cationes como
Mg2+ y Ca2+.32

Las recuperaciones de extracción de macrólidos, tetraciclinas, trimetoprima y tiamfenicol mejoraron

igualmente con la modificación del disolvente de base orgánica (acetonitrilo) con metanol. Sin
embargo, se seleccionó un volumen de metanol de compromiso de 2 mL (que constituye 20 % de
solvente orgánico) porque un aumento en el contenido de metanol a 4 mL (40 % de solvente
orgánico) produjo residuos de extracto muy viscosos que eran difíciles de evaporar a sequedad. El
acetonitrilo acidificado redujo la recuperación de extracción de sulfonamidas y pareció tener poca
o ninguna influencia en la recuperación de fluoroquinolonas, tetraciclinas, macrólidos, tiamfenicol
y trimetoprima. Na2EDTA mejoró la recuperación de sulfonamidas, fluoroquinolonas y tetraciclinas.
Sin embargo, no se observó una influencia obvia de Na2EDTA 0,1 M para la recuperación de
trimetoprima y tiamfenicol en estas condiciones de extracción. Nuevamente, se debe enfatizar que
los antibióticos β-lactámicos no se recuperaron bajo estas condiciones de extracción.

Optimización de limpieza de d-SPE

Debido a la complejidad de la matriz de lodos de depuradora, se optimizó un procedimiento de

limpieza de d-SPE para reducir la influencia de los componentes que interfieren. Los experimentos
preliminares para investigar la posibilidad de utilizar aminas primarias y secundarias (PSA) y
adsorbentes C18 se llevaron a cabo añadiendo extractos en blanco de muestras de lodos de
depuradora. El sorbente PSA es un intercambiador aniónico débil que se utiliza en la eliminación de
ácidos grasos, azúcares, lípidos y pigmentos.
El PSA tiene una estructura química con un alto efecto quelante debido a la presencia de la amina
primaria y secundaria, lo que resulta en la retención de interferencias polares en la matriz. El
sorbente C18 es un sorbente hidrofóbico de fase reversa que elimina compuestos grasos de cadena
larga y otras interferencias no polares a través de interacciones no polares.
En los experimentos preliminares, se añadió una solución estándar de analitos objetivo a 250 ng mL-
1 a 2 ml de extracto en blanco antes de la d-SPE. A modo de comparación, se tomaron otros 2 ml de
extracto en blanco mediante el mismo procedimiento d-SPE sin adición previa de solución estándar;
el extracto se añadió después de d-SPE a la concentración esperada de analitos en el extracto final
reconstituido (1000 ng mL-1). Los experimentos se realizaron por duplicado. La composición de los
adsorbentes de d-SPE probados para estos experimentos fue: (a) 100 mg de PSA + 200 mg de MgSO4
(b) 100 mg de C18 + 200 mg de MgSO4. Los resultados (Fig. S3, Material complementario) muestran
que tanto el PSA como el C18 presentaron tasas de recuperación similares para la mayoría de los
antibióticos objetivo. La mayoría de los compuestos se recuperaron de ambos adsorbentes. Sin
embargo, se observaron recuperaciones bajas (< 30 %) para las sulfonamidas, lo que indica la
posibilidad de retención de estos antibióticos tanto por los adsorbentes de PSA como de C18. Salvia
et al. también observaron que el PSA provocó la pérdida de sulfonamidas en el extracto de la matriz
del suelo.32 Sin embargo, en nuestro estudio C18 no se desempeñó mejor en la recuperación de
sulfonamidas.
Se llevó a cabo una mayor optimización con diferentes cantidades de adsorbentes d-SPE (50 mg PSA,
150 mg PSA, 300 mg PSA, 50 mg C18, 150 mg C18, 300 mg C18, 50 mg PSA+100 mg C18, 75 mg PSA+
75mg C18). Cada composición de d-SPE contenía 200 mg de MgSO4 para eliminar el exceso de agua.
Los resultados de las recuperaciones (extracción con solvente + d-SPE) como se presenta en la Fig.
S4 (Material complementario) indican que 150 mg de PSA fue el mejor compromiso para los analitos
objetivo. 150 mg C18 también presentó recuperaciones similares pero se obtuvieron mejores
recuperaciones para las sulfonamidas con 150 mg de PSA. Se observó una ligera reducción en la
recuperación de algunos antibióticos objetivo (especialmente sulfonamidas) con una mezcla de PSA
y C18. Cabe señalar que la eficiencia de recuperación en los experimentos de optimización es una
función de las eficiencias de los pasos de extracción y d-SPE. Finalmente, se eligió 150 mg de PSA
como adsorbente de d-SPE en nuestro estudio.
Para probar la relevancia del paso d-SPE, se compararon las recuperaciones obtenidas en tres
niveles de fortificación diferentes (10 ng g-1, 50 ng g-1 y 500 ng g-1) cuando se incluyó el paso d-SPE
y sin el paso d-SPE. Se realizó el paso SPE. Los resultados se presentan en la Fig. 3. d-SPE mejoró la
recuperación de azitromicina y tetraciclinas. Sin el paso de d-SPE, se encontró que las
recuperaciones de estos compuestos eran inusualmente altas (hasta un 700 % para la
oxitetraciclina) a un nivel de fortificación bajo. Las altas recuperaciones inusuales sin un paso de d-
SPE podrían ser el resultado de la influencia de los componentes de la matriz en los extractos. Sin
embargo, algunos de los compuestos objetivo (eritromicina, tiamfenicol) también se perdieron
durante el paso de d-SPE a un nivel de fortificación bajo. La relevancia de d-SPE en el método
desarrollado para reducir la influencia de los componentes de la matriz se analiza con más detalle
en la sección "Efectos de la matriz".

Efectos de matriz

La supresión o mejora de las señales de los analitos en presencia de componentes de la matriz

(efecto matriz) es uno de los principales inconvenientes de LC-ESI-MS/MS. Los efectos de la matriz
en este estudio se muestran en la Fig. 4.
La supresión de la señal se observó en la mayoría de los casos en el rango entre -64% y -29%. La
mejora de la señal fue evidente para solo cuatro compuestos objetivo en el rango de 4% a 57%. Para
demostrar la eficacia de la limpieza con d-SPE para reducir los efectos de la matriz en nuestro
estudio, las recuperaciones obtenidas sin un paso de limpieza con d-SPE se compararon con las
recuperaciones logradas cuando se incorporó un paso de limpieza con d-SPE. La Fig. 4 muestra que
el paso de limpieza con d-SPE redujo el efecto matriz para todos los compuestos. El uso de
estándares marcados isotópicamente podría reducir o eliminar los efectos de la matriz, pero estas
sustancias suelen ser caras y, a veces, no están disponibles comercialmente. En este estudio, se
aplicó la calibración ajustada a la matriz (pico antes de la extracción) para la cuantificación de los
compuestos objetivo con el fin de evitar imprecisiones en los resultados de la cuantificación.
Nuestro enfoque de extracción QuEChERS desarrollado en combinación con la limpieza d-SPE fue
menos propenso al efecto matriz que los métodos informados anteriormente.

Parámetros de rendimiento analítico

Los parámetros de rendimiento analítico del método desarrollado se resumen en la Tabla 2. El

coeficiente de correlación de las curvas de calibración emparejadas con la matriz (pico antes de la
extracción) osciló entre 0,9385 y 0,9999 excepto para ofloxacina y ciprofloxacina (0,8012 y 0,7691,
respectivamente). Sin embargo, debe tenerse en cuenta que las curvas de calibración preparadas
en extractos de muestra (aumento después de la extracción) mostraron un coeficiente de
correlación superior a 0,95 para todos los compuestos objetivo, incluidos ofloxacino y
ciprofloxacino. Análisis del blanco
La muestra utilizada para el desarrollo y la validación del método (una mezcla representativa de
todas las muestras de lodos) ya contenía antibióticos. Por lo tanto, especialmente la ofloxacina y la
ciprofloxacina mostraron áreas de pico relativamente altas en la Fig. S5 (Material complementario).
La adición de una muestra de este tipo que ya contiene analitos objetivo en grandes cantidades
podría afectar la linealidad de la curva de calibración, especialmente cuando se utiliza una
calibración de matriz coincidente.
Por esta razón, sería preferible utilizar una muestra de lodo de material de referencia certificado
(CRM) limpio para el desarrollo y la validación del método.19 Es difícil obtener un CRM limpio para
lodos de depuradora. La cuantificación de los analitos se realizó en este estudio usando las curvas
de calibración emparejadas con matriz para muestras enriquecidas antes de la extracción. Por lo
tanto, las concentraciones notificadas de ambos antibióticos (ofloxacino y ciprofloxacino) en las
muestras de lodos reales solo pueden considerarse semicuantitativas.

La precisión intradía (% RSD) fue inferior al 10 % para la mayoría de los compuestos y estuvo entre
el 2 % (oxitetraciclina) y el 18 % (claritromicina). Se logró una precisión interdía de ≤ 20% con la
excepción de eritromicina, sulfametoxazol, claritromicina y
tiamfenicol con %RSD de 24%, 29% 32% y 35% respectivamente. Salvia et al también observaron
una RSD entre días del 37 % para la eritromicina en la matriz del suelo utilizando SPE para la limpieza.

Los valores MLOD y MLOQ estaban en el orden de magnitud ng g-1 o incluso más bajos para la
mayoría de los compuestos objetivo. Para las sulfonamidas, los MLOQ oscilaron entre 0,02 ng g-1
(sulfadoxina) y 0,09 ng g-1 (sulfadimetoxina), mientras que trimetoprima y tianfenicol mostraron
MLOQ de 0,01 ng g-1 y 85,65 ng g-1, respectivamente. Los MLOQ para las fluoroquinolonas oscilaron
entre 0,05 ng g-1 (ofloxacina) y 8,38 ng g-1 (norfloxacina). Los macrólidos exhibieron un rango de
MLOQ entre 0,05 ng g-1 (claritromicina) y 39,92 ng g-1 (azitromicina). La tetraciclina y la
oxitetraciclina tenían MLOQ de 13,78 y 364,8 ng g-1, respectivamente. Los valores de MLOQ para
los antibióticos en nuestro trabajo (especialmente para sulfonamidas, fluoroquinolonas,
trimetoprima y macrólidos) fueron inferiores o equivalentes a los valores de MLOQ informados
previamente para estos antibióticos. Los bajos valores de MLOQ obtenidos en este estudio para la
mayoría de los antibióticos objetivo muestran que el método desarrollado es lo suficientemente
sensible para la determinación de estos compuestos en una matriz compleja de lodos de
depuradora.
Las recuperaciones del método se determinaron a tres niveles de fortificación diferentes (10, 50 y
500 ng g-1). El tianfenicol y la trimetoprima presentaron valores de recuperación del 70 % (nivel de
fortificación de 500 ng g-1) y del 72 % (nivel de fortificación de 10 ng g-1) respectivamente. Según
el nivel de fortificación, la ofloxacina exhibió recuperaciones en el rango de 84 y 139 %, mientras
que la ciprofloxacina y la norfloxacina exhibieron un rango de recuperación de 83 -150 % y 26 - 162
%, respectivamente. Para azitromicina las recuperaciones estuvieron entre 125 y 138% y para
claritromicina entre 14 y 68%. No se detectó eritromicina en la fortificación
niveles a 10 y 50 ng g-1 pero se obtuvo una recuperación del 4% a 500 ng g-1. Salvia et al.32 también
obtuvieron una recuperación baja del 2 % para la eritromicina en la matriz del suelo. De manera
similar, empleando extracción líquida presurizada con limpieza SPE, se lograron recuperaciones
absolutas bajas del 29-37 % para los macrólidos (eritromicina, azitromicina y claritromicina) en lodos
de depuradora por Göbel y colaboradores.21 Las sulfonamidas (sulfadimetoxina, sulfadoxina,
sulfametazina y sulfametoxazol) presentaron recuperaciones bajas con un valor promedio de
alrededor del 35%. Vom Eyser et al. lograron un valor de recuperación absoluto del 33 % para el
sulfametoxazol. utilizando como método de extracción la extracción con líquido a presión29. Los
antibióticos β-lactámicos (amoxicilina, penicilina y flucloxacilina) no se recuperaron de los lodos de
depuradora y, por tanto, no se cuantificaron. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la extracción
repetida con más solventes y el paso repetido de limpieza de d-SPE podrían mejorar la recuperación
de los antibióticos objetivo. Las bajas recuperaciones exhibidas por algunos de los compuestos
objetivo no se consideraron un obstáculo para su cuantificación confiable porque su sensibilidad y
reproducibilidad fueron satisfactorias, y la cuantificación de todos los compuestos se llevó a cabo
mediante una calibración ajustada a la matriz (pico antes de la extracción) que tiene en cuenta
cualquier pérdida del compuesto o compuestos durante todo el procedimiento analítico.

Aplicación a muestras reales de lodos de aguas residuales

El método desarrollado se aplicó con éxito para la determinación de residuos de antibióticos

objetivo en muestras de lodos de depuradora recolectadas de tres plantas de tratamiento de aguas
residuales en Nigeria, como se describe en la sección "Recolección de muestras y pretratamiento".
En la tabla 3 se muestran los perfiles de concentración de los antibióticos en lodos de depuradora
para el primer muestreo (julio de 2017) y el primer día de la segunda campaña de muestreo
(septiembre de 2017). Se sabe que los fármacos que se encuentran en aguas residuales y lodos de
depuradora reflejan patrones de prescripción o consumo y comportamiento farmacocinético en los
pacientes.
Todas las sulfonamidas, fluoroquinolonas, macrólidos, tetraciclinas y trimetoprimas objetivo se
detectaron en la mayoría de las muestras de aguas residuales, lo que indica su consumo
generalizado. Sin embargo, en algunas muestras se detectaron varios antibióticos a niveles por
debajo de MLOQ. No se detectó tiamfenicol en ninguna muestra. Las concentraciones de
trimetoprim variaron desde menos de MLOQ a 23,7 ng g-1, las concentraciones de sulfonamidas
estuvieron en el rango <MLOQ a 125 ng g-1 con la concentración más alta (125 ng g-1) medida para
sulfadoxina en lodos de la PTAR del hospital (Ijaiye EDAR). La sulfadoxina se presentó en
concentraciones mucho más bajas (entre 1,9 y 25 ng g-1) en muestras de lodos de la EDAR del otro
hospital (EDAR UCH) y no se detectó en muestras de lodos de la EDAR municipal (EDAR de Alausa).
Las concentraciones de macrólidos oscilaron entre por debajo de MLOQ a 304 ng g-1 con la
concentración más alta de azitromicina cuantificada en la EDAR del hospital Ijaiye.

Se detectaron fluoroquinolonas y tetraciclinas a niveles de concentración mucho más altos que

cualquier otra clase de antibióticos. Los niveles de concentración de fluoroquinolonas fueron para
ofloxacina entre 11,2 y 557 ng g-1, para ciprofloxacina entre debajo de MLOQ y 1201 ng g-1 y para
norfloxacina entre debajo de MLOQ y 825 ng g-1. Norfloxacino dominó en la EDAR municipal de
Alausa, mientras que ofloxacino, ciprofloxacino, tetraciclina y oxitetraciclina dominaron tanto en la
EDAR municipal de Alausa como en la EDAR hospitalaria de Ijaiye. Las concentraciones más altas se
midieron para la oxitetraciclina en la PTAR Alausa a 4689 ng g-1. No se pueden reportar datos para
los antibióticos β-lactámicos (amoxicilina, penicilina y flucloxacilina), ya que no se pudieron incluir
en este método.

CONCLUSIONES
En este trabajo se desarrolló una metodología analítica simple y eficaz para la determinación
simultánea de 14 antibióticos pertenecientes a seis clases de compuestos diferentes en lodos de
depuradora. El método analítico implica una extracción basada en QuEChERS con limpieza
dispersiva-SPE seguida de análisis LC-MS/MS. La limpieza dispersiva-SPE aplicada fue efectiva para
reducir los efectos de la matriz debido a los componentes co-extraídos en la matriz del lodo. Se
lograron límites de método de detección (MLOD) y límites de método de cuantificación (MLOQ)
bajos adecuados con buena precisión y exactitud satisfactoria para la mayoría de los antibióticos
objetivo. El método analítico desarrollado permitió la determinación de antibióticos diana en lodos
de depuradora en el rango de ng g-1. El método se aplicó con éxito para medir los antibióticos
objetivo en muestras de lodos de aguas residuales recolectadas de tres plantas de tratamiento de
aguas residuales en Nigeria en las que se detectaron todos los compuestos objetivo en la mayoría
de las muestras de lodos de aguas residuales. Las concentraciones más altas se observaron para
tetraciclinas (hasta 4689 ng g-1) y fluoroquinolonas (hasta 1201 ng g-1) en las EDAR municipales y
hospitalarias. Los niveles ambientales de la mayoría de los antibióticos objetivo en los lodos de
depuradora en este estudio fueron comparables a las concentraciones previamente determinadas
en los lodos de depuradora en Europa: 100 a 5000 ng g-1 de fluoroquinolonas en Suecia, 24,11 2500
a 3500 ng g-1 de fluoroquinolonas en lodo digerido en Suiza,44 0,6 a 27 ng g-1 de sulfametoxazol
en España,28 60,8 - 267 ng g-1 de azitromicina en Grecia.19 Esto sugiere que parece haber un
consumo similar de antibióticos en las regiones de las EDAR investigadas en Nigeria en comparación
con los países de la UE. Este estudio subraya la necesidad de realizar más estudios para investigar la
aparición y los posibles riesgos ecotoxicológicos de
antibióticos en lodos de depuradora utilizados para aplicaciones agrícolas en Nigeria.

Conflicto de intereses: Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Agradecimientos
Los autores agradecen a la Fundación Alemana de Investigación (DFG) y a la Academia Mundial de
Ciencias (TWAS) por la concesión de la beca de visitas de cooperación TWAS-DFG a Akinranti Ajibola.
Akinranti Ajibola agradece a la dirección de la Universidad de Ibadan por la aprobación de la licencia
de estudios para realizar la beca de investigación. Se agradece a los funcionarios de las plantas de
tratamiento de aguas residuales investigadas por su asistencia en la recolección de muestras de
lodo.