Informe

2022
Determinación de método de secado, fenoles totales e identificación de

compuestos bioactivos por HPLC de una muestra de café
Determinació n de método de secado, fenoles totales e identificació n de compuestos bioactivos
por HPLC de una muestra de café 2022
1. TÍTULO
Determinación del método de secado, fenoles totales e identificación de

compuestos bioactivos de muestras de café por HPLC de una muestra de café.
2. OBJETIVOS
 Determinar el mejor método para la extracción de compuestos fenólicos

presentes en la cáscara de café.
 Determinar el contenido de fenoles totales de los extractos obtenidos
por ultrasonido, microondas, maceración dinámica.
 Identificación de compuestos bioactivos mediante HPLC- MS
3. MARCO TEÓRICO
3.1. Compuestos fenólicos de la cáscara de café
La cascarilla de café se caracteriza por presentar metabolitos secundarios,

como la cafeína y los taninos, y ácidos fenólicos como el ácido clorogénico,
siendo así una fuente potencial para la obtención de compuestos bioactivos de
interés para aplicar en alimentos. El ácido clorogénico está ampliamente
distribuido en el reino vegetal, el café y sus derivados se consideran su mayor
fuente. La función biológica de este compuesto fenólico está ligada a sus
actividades antioxidante, antimicrobiana y anticancerígena (Silva et al., 2020).
3.2. Métodos de secado
Práctica de Análisis de alimentos 2

aplicados al desarrollo de nuevos
productos
Liofilización: Es un proceso que tiene como objetivo eliminar el contenido de

agua u otro solvente mediante la congelación y posterior sublimación del hielo
a presión reducida. Este método tiene como ventaje que no altera la
composición cualicuantitativa presentes en el alimento.
Secado en bandejas: Consiste en una cámara sellada y aislada en cuyo
interior se encuentran las bandejas en donde se colocan las muestras. En el
interior de la cámara circula aire caliente el cual se transfiere en el interior por
medio de ventiladores.
3.3. Métodos de extracción

Extracción asistida por ultrasonida
La extracción asistida por ultrasonido (UE) es un método no convencional que
emplea ondas mecánicas con el objetivo intensificar la extracción mediante un
fenómeno llamado cavitación. En este método las ondas se propagan a través
del recipiente de muestra mientras la sonda actúa directamente sobre la matriz
y el solvente lo que induce a la ruptura de la membrana celular facilitando la
extracción de sus componentes (Chemat et al., 2011).
Microonadas
En el análisis de microondas se da por la irradiación la cual hace que las

moléculas se muevan gracias a la migración de iones y rotación de polos esto
causando que exista una energía en el material vegetal y el solvente
utilizado(Gao & Liu, 2005). Las radiaciones electromagnéticas usadas en la
extracción de microondas son no ionizantes teniendo frecuencias con rango de

productos
0.3-300 GHz que esto sería igual a una longitud de onda 1m-1mm las cuales
suelen generar calor(Vivekananda Mandal et al., 2007).
Maceración dinámica
En este método a la muestra en polvo se le pone en contacto con el solvente
que puede ser agua, metanol o mezcla de ambos, esta al ser una técnica no tan
eficaz se debe tener control sobre todos los parámetros de a extracción por lo
tanto se debe considerar el tamaño partícula de la muestra, la frecuencia de
maceración y el tiempo de trabajo (Alam et al., 2010)
3.4. Determinación de ácido ascórbico
Método del indofenol para determinación de vitamina C
Es un método cuantitativo que se basa en el poder reductor del ácido ascórbico

sobre el tinte indicador. Al añadir el colorante (2,6‐diclorofenolindofenol) a la
muestra, este es reducido mientras la Vit C es oxidada. Durante este proceso el
colorante se vuelve incoloro. De esta forma, mientras haya Vit C en la
muestra, no se verá el color del indicador. Una vez se haya oxidado toda la Vit
C presente en la muestra, el colorante dejará de verse incoloro y se verá de un
color rosado tenue. Para determinar el fin de la titulación el color debe
persistir durante unos segundos. La titulación se realiza en presencia de
solución de ácido metafosfórico y acético para evitar la autooxidación del
ácido ascórbico a pH alto (Nielsen, 2007).

productos
Figura 1. Reacción de la vitamina C con 2,6‐diclorofenolindofenol
3.5. Determinación de fenoles totales

Método de Folin-Ciocalteu
El reactivo está constituido por una mezcla de ácido fosfotúngstico
(H3PW12O40) y ácido fosfomolibdico (H3PMo12O40) que se reduce, por la
oxidación de los fenoles, en una mezcla de óxidos azules de tungsteno
(W8O23). La coloración azul producida posee una absorción máxima entorno a
765 nm y ésta es proporcional al porcentaje de compuestos fenólicos. Por
tanto, la respuesta de este análisis depende de la cantidad de fenoles presentes.
El número de grupos OH o grupos potencialmente oxidables controlan la
intensidad de color formado (García et al., 2018).
4. MEDIDAS DE SEGURIDAD
Leer las hojas de seguridad de los reactivos a emplear y verificar el

funcionamiento de los sistemas de emergencia (duchas, fuente lavaojos). Usar
protecciones de los ojos y la piel ya que para el desarrollo de la práctica
implica la utilización de productos químicos corrosivos. Los residuos eliminar
por el desagüe, arrastrándolos con agua.
5. MATERIALES
 Balones de aforo
 Bureta
 Pipetas
 Micropipetas
 Jeringuillas
 Filtros
productos
 Tubos eppendorf
6. EQUIPOS
 Espectrofotómetro
 HPLC acoplado a detector de masas
 Balanza analítica
 Horno de bandejas
 Equipo liofilizador
 Molino y triturador eléctrico
 Equipo microondas
 Equipo de ultrasonido
 Centrífuga
 Homogenizador
7. REACTIVOS
 Agua destilada
 Carbonato de sodio 7,5%
 Etanol
 Metanol
 Ácido acético metafosfórico
 Patrón de vitamina C
8. DESCRIPCIÓN DEL PROCEDIMIENTO
8.1. Obtención de la cáscara de café

productos
 Retirar la cáscara de los granos frescos de café mediante despulpado

mecánico.
 Deshidratar la cáscara de café mediante secado por bandejas y
liofilización
 Morturar la cáscara seca en un molino eléctrico a 12000 rpm.
8.2. Determinación de la vitamina C
 Pesar 5 gramos de cáscara seca de café, añadir 40 ml de ácido acético y

metafosfoórico y agregar 60 ml de agua destilada
 Tomar 1mL de la solución anterior y agregar 10 ml de ácido acético
 Titular
Preparación de la solución stock
Concentración
(mg/mL) Volúmen Concentración Volúmen alícuota
estándar (mL) trabajo (mg/mL) trabajo (mL)
0,2 1
0,5 2,5
1 25 5 5
1,5 7,5
2 10
26
Volumen
Vol. Alícuota Sol.
Conc. Stock Volumen solucion Stock Conc. Trabajo Trabajo
mg/mL Solución stock (mL) (mg/mL) (mL)
5 25 500 5 100

productos
8.3. Extracción de los compuestos fenólicos
Extracción por microondas
 En 9 tubos para microondas colocar 1 g de muestra triturada triturada

 A tres tubos añadir 40 mL la solución de agua y etanol, a otros 3 tubos
40 mL de agua y finalmente a los 3 tubos restantes 40 mL etanol
 Configurar en el equipo las condiciones de extracción.
 Traspasar el contenido de los tubos a tubos eppendorf y centrifugar
durante 30 minutos a 800 rpm
 Trasegar el sobrenadante de cada tubo.
Peso muestra Solvente (mL)

# Tubo
(g) EtOH Agua
1 1
2 1,01 40
3 1
4 1
5 1 20:20
6 1
7 1
8 1,01 40
9 1,01
Método oficial para compuestos fenólicos (Método comparable)
 Pesar 1g de pulpa de café deshidratada en los tubos de centrífuga.

 Añadir 20 mL de metanol + 2 gotas de ácido clorhídrico para llevarlo a
un medio ácido.

productos
 Luego de centrifugar la primera mezcla de MetOH + HCl, se adicionó

20 mL de cetona y se centrifugó nuevamente (8000 rpm)
Peso muestra Solvente

# Tubo RPM
(g) (mL)
1 1.01 20 de MetOH
2 1,01 + 2 gotas de 8500
3 1 HCl
Método de extracción por ultrasonido
 Pesar 1g de muestra pulpa de café deshidratada y colocar en tubos de

centrífuga.
 Añadir 40 mL de EtOH y agua
 Centrifugar a la máxima rpm durante 30 minutos.
 Extraer el sobrenadante y colocar el tubo para el análisis posterior.
Peso muestra Solvente (mL)

# Tubo
(g) EtOH Agua
1 1
40
2 1
3 1
20:20
4 1,01
5 1,01
40
6 1,01
Método de extracción por maceración dinámica

 Pesar 2g de pulpa de café deshidratada.
 Colocar 80 mL de EtOH y agua segun corresponda
 Colocar 40 mL de solución preparada (punto 2) y centrifugar a 4500
rpm durante 30 minutos.
# Tubo Peso muestra Solvente (mL)

productos
(g) Agua EtOH

1 2,05 80
2 2,0801 40 40
3 2,0024 80
8.3. Determinación de cafeína y ácido clorogénico por HPLC- MS
Filtrar la muestra de los extractos y colocar en el vial para la lectura en el

equipo.
8.4. Determinación de fenoles totales por espectrofotometría
Preparación de la curva de calibración
 10 uL de muestra
 160 ul de agua
 10 uL de Follin Coaulet
 Agitar durante 10 minutos
 20 uL de carbonato de sodio
 Agitar durante 10 minutos
Preparación de la muestra
Seleccionar una muestra de color intenso, intermedio y leve de cada uno de los
extractos. La muestra de mayor concentración realizar una dilución (500 uL de
muestra más 500 uL metanol)
 Colocar 10 µL de las muestras seleccionadas, añadir 10 µL de Folin

Coaulet y 100 µL de agua.

productos
 Agitar la placa durante 10 minutos.

 Añadir a cada pocillo 100 µL de carbonato de sodio 15%.
 Agitar la placa durante 10 minutos
 Dejar reposar en la obscuridad durante 2 horas.
Análisis de la muestra
 Colocar las microplacas en el lector de placas del espectrofotómetro

 Seleccionar la longitud de onda a 750 nm
9. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
9.1. Método de secado de la cáscara de café
Tabla 1 Valor promedio de secado de los subproductos del café en función del
tiempo Tiempo (min) Peso (g)
30 852,10
60 489,43
90 302,27
120 215,12
150 185,24
180 183,68
210 181,81
240 173,64
270 172,63
Se inició con un valor de materia fresca (cáscara de café) de 852,10 g,

transcurrido 4 horas y 30 minutos dentro del desecador en bandejas a 70°C se

productos
obtuvo un valor promedio de 172,63 g puesto que la variación de peso es de

1,1 g.
9.2. Determinación del contenido
Volumen = 100 mL
%Pureza = 0,97
m * pureza
C= --> Conc. Real = 4,92178
volumen
C * volumen
m=
Pureza
m= 5 * 100
0,97
m= 515,4639175 mg de Vit. C
m= 0,515463918 g de Vit. C
m real = 0,5074 g de Vit. C
507,4 mg de Vit. C
Volúmen Volumen
Concentración Volúmen Concentración Volumen
alícuota trabajo Indofenol
real (mg/mL) estándar (mL) trabajo (mg/mL) Indofenol (mL)
(mL) (mL)
0,1968712 1 2,23 4,92
0,492178 2,5 5,88 11,76
0,984356 10 246,089 5 11,79 23,58
1,476534 7,5 18,07 36,14
1,968712 10 23,23 46,46
Vol. Alícuota
Conc. Stock Volumen Solución solucion Stock Conc. Trabajo Volumen Sol.
mg/mL stock (mL) (mL) real (mg/mL) Trabajo (mL)

productos
4,92178 25 500 246,089 10
Volumen
Indofenol (mL)
25
f(x) = 11.956751228603 x − 0.00048780487805189
20 R² = 0.999038896371844
15
10
0
0 0.5 1 1.5 2 2.5
Pendiente = 11,95675123
Intersección = -0,000487805
y - intersección
x=
pendiente

productos
Volumen
Indofenol (mL)
50
45 f(x) = 23.7293838315043 x + 0.279512195121949
40 R² = 0.999133690875635
35
30
25
20
15
10
5
0
0 0.5 1 1.5 2 2.5
Pendiente = 23,72938383
Intersección = 0,279512195
De acuerdo a los valores obtenidos de Vitamina C se observa que tiene una
concentración mayor en relación al valor inicial, lo que es un indicativo que el
proceso de secado no degrada el contenido de compuestos fenólicos, lo que se
corrobora lo expuesto por quien indica que para obtener un mayor rendimiento
de compuestos fenólicos se requiere secar la muestra como pretratamiento.
9.3. Extracción de compuestos fenólicos

productos
A simple viste se observa que la mezcla de etanol y agua en proporción 1:1, es

el mejor método para la extracción de compuestos fenólicos ya que presenta
mayor intensidad; sin embargo, al calcular las concentraciones esto no se
refleja probablemente a que el alcohol puede extraer otros compuestos que los
disolventes puros.
9.4. Determinación de cafeína y ácido clorogénico de la cáscara de café

por HPLC- MS

productos
8.4. Determinación de fenoles totales por espectrofotometría

productos
Conc. Ac.
Clorogénico Área
ug/mL
Estándar 1 7 68,1533
Estándar 2 33 435,4622
Estándar 3 67 933,145
Estándar 4 100 1692,5206
Estándar 5 133 2053,0996
1.2
1
f(x) = 0.00378091978609626 x + 0.0135754010695187
0.8 R² = 0.999627704812843
0.6
0.4
0.2
0
0 50 100 150 200 250 300
Dinami: Dinámica, UAE: Extracción asistida por ultrasonido, MW: Extracción por microondas

productos
En base a los resultados obtenidos que se observa que el uso de agua como
solvente permite extraer mayor contenido de compuestos fenólicos, lo que se
corrobora con el estudio reportado por quien resalta que los compuestos
fenólicos son compuestos polares por ende presentan alta solubilidad en agua,
generalmente los difenoles y polifenoles (Pérez et al., 2013). El empleo de
agua y etanol es el segundo método con mayor contenido esto se debe a que la
presencia de agua aumenta el volumen del material vegetal, por tanto,
aumenta el área de superficie entre la planta y el solvente
https://www.aaiq.org.ar/SCongresos/docs/06_029/papers/05c/05c_1775_727.p
df,
Además, se observa que la extracción dinámica y microondas a 100°C son los

métodos con mayor contenido de compuestos fenólicos, esto se puede deber a
que el agua incrementa la constante dieléctrica, lo cual ayuda a absorber la
energía de microondas, aumentando así la extracción. El incremento de
temperatura disminuye la viscosidad del disolvente, ayudando a penetrar la
matriz vegetal y mejorando el proceso de extracción, es por esto que es mejor
la extracción por microorndas100°C en comparación a la realizada a la
temperatura de 50 °C https://ciencia.lasalle.edu.co/cgi/viewcontent.cgi?
article=1057&context=ing_alimentos.
Finalmente, al comparar la cantidad de compuestos fenólicos obtenidos con lo

reportados por diferentes autores.

productos
Ac Clorogénico ug/mL
2500
2000 f(x) = 16.4064790015692 x − 79.1644321067088

R² = 0.989551526084533
1500
1000
500
0
0 20 40 60 80 100 120 140
Cafeína ug/mL
4500
4000 f(x) = 15.5913235494217 x − 62.7649027213529

R² = 0.999167053070592
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
0 50 100 150 200 250 300
MUESTRA C MG AC C MG CAFEÍNA GAE/G BS

CLOROGÉNICO GAE/G
BS
MW 50 ETOH H2O 0.64 5.40
MW 50 ETOH 0.69 5.61
MW 50 H2O 0.66 5.09
MW 100 H2O 0.69 6.87
MW 100 H2O ETOH 0.19 7.18
MW 100 ETOH 0.19 5.25

productos
UAE 50 ETOH H2O 0.81 6.63

M DINAM 50 ETOH 0.74 6.56
SAURA 0.89 7.33
la tabla XXX se ha identificado la concentración de ácido clorogénico y

cafeína en la cascara de café obtenidos mediante diversos métodos, de los
cuales, el mas efectivo para la extracción de ácido clorogénico es la
maceración asistida por ultrasonidos a una temperatura de 50 °C y como
solvente ETOH – H2O (50:50), Como lo indica (Gómez-Caravaca et al.,
2016), el ultrasonido, ayuda a que la materia prima permita mejorar el paso de
los compuestos fenólicos al solvente, aumentando su extracción. En el caso de
la cuantificación de cafeína, la extracción por microondas a una temperatura
de 100 °C utilizando ETOH y H2O como solvente fue mas efectivo en
comparación a los demás métodos, de tal manera que el agua aumenta la
constante dieléctrica por tanto absorbe la energía de microondas, aumentando
la extracción de cafeína. (Cangussu et al., 2021) en su estudio determinó la
cantidad de cafeína y ácido clorogénico siendo 6.18 mg/g y 1.22 mg/g BS,
respectivamente. Los datos se relacionan a los obtenidos en la práctica,
relativamente se encuentran en el mismo rango, y en las mismas condiciones
de extracción (UAE).
La extracción dinámica y las microondas permitieron obtener mayor cantidad

de compuestos fenólicos, ocupando agua como solvente en los dos casos,
siendo este el mas efectivo para la extracción de los fenoles de la cascara de
café, siendo una cantidad de 0,43 mg de GAE/g BS. (Marcelo-Diaz et al.,
2017) determinó 1429 mg GAE/g a una concentración de 35% de ETOH,

productos
como solvente, por un tiempo de 78 minutos, en comparación al estudio

realizado que se pretrató a la muestra de cascara por un tiempo de 4.5 horas a
una temperatura de 70 °C, por lo que la perdida de la cantidad de fenoles
totales se ve disminuida por la exposición de la muestra a la temperatura de
secado, de la misma forma se puede ver este valor reducido en los análisis por
HPLC, que la cantidad mas elevada de ac. Clorogénico es de 0.74 mg/g,
comparado con 90.34 mg en el estudio de (Pérez-Hernández et al., 2013), los
cuales trataron a la muestra únicamente con agua a temperatura ambiente por
15 minutos. Es necesario evaluar y relacionar las condiciones de cosecha,
almacenamiento y especie vegetal de la muestra analizada, puesto que estos
factores, se relacionan con el contenido de fenoles totales de las muestras.
Visualmente la muestra antes del proceso de secado, presentó un color
marrón, indicativo de la oxidación y degradación de los compuestos fenólicos,
a causa de la exposición prolongada de la muestra a los factores ambientales.
10. CONCLUSIONES
11. RECOMENDACIONES
 Desarrollar la práctica de manera presencial ya que en el simulador

se puede modificar valores, como el límite de detección de vitamina
C debido a que se requería de volúmenes grandes de solución
titulante.

productos
12. BIBLIOGRAFIA

productos

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2022

Determinación de método de secado, fenoles totales e identificación de

Determinación del método de secado, fenoles totales e identificación de

 Determinar el mejor método para la extracción de compuestos fenólicos

3.1. Compuestos fenólicos de la cáscara de café

La cascarilla de café se caracteriza por presentar metabolitos secundarios,

3.2. Métodos de secado

Práctica de Análisis de alimentos 2

Liofilización: Es un proceso que tiene como objetivo eliminar el contenido de

3.3. Métodos de extracción

En el análisis de microondas se da por la irradiación la cual hace que las

Práctica de Análisis de alimentos 3

Es un método cuantitativo que se basa en el poder reductor del ácido ascórbico

Práctica de Análisis de alimentos 4

Figura 1. Reacción de la vitamina C con 2,6‐diclorofenolindofenol

3.5. Determinación de fenoles totales

Leer las hojas de seguridad de los reactivos a emplear y verificar el

8. DESCRIPCIÓN DEL PROCEDIMIENTO

8.1. Obtención de la cáscara de café

Práctica de Análisis de alimentos 6

 Retirar la cáscara de los granos frescos de café mediante despulpado

8.2. Determinación de la vitamina C

 Pesar 5 gramos de cáscara seca de café, añadir 40 ml de ácido acético y

Preparación de la solución stock

Práctica de Análisis de alimentos 7

8.3. Extracción de los compuestos fenólicos

Extracción por microondas

 En 9 tubos para microondas colocar 1 g de muestra triturada triturada

Peso muestra Solvente (mL)

Método oficial para compuestos fenólicos (Método comparable)

 Pesar 1g de pulpa de café deshidratada en los tubos de centrífuga.

Práctica de Análisis de alimentos 8

 Luego de centrifugar la primera mezcla de MetOH + HCl, se adicionó

Peso muestra Solvente

 Pesar 1g de muestra pulpa de café deshidratada y colocar en tubos de

Peso muestra Solvente (mL)

Método de extracción por maceración dinámica

# Tubo Peso muestra Solvente (mL)

(g) Agua EtOH

8.3. Determinación de cafeína y ácido clorogénico por HPLC- MS

Filtrar la muestra de los extractos y colocar en el vial para la lectura en el

8.4. Determinación de fenoles totales por espectrofotometría

Preparación de la curva de calibración

 Colocar 10 µL de las muestras seleccionadas, añadir 10 µL de Folin

Práctica de Análisis de alimentos 10

 Agitar la placa durante 10 minutos.

 Colocar las microplacas en el lector de placas del espectrofotómetro

9.1. Método de secado de la cáscara de café

Se inició con un valor de materia fresca (cáscara de café) de 852,10 g,

Práctica de Análisis de alimentos 11

obtuvo un valor promedio de 172,63 g puesto que la variación de peso es de

9.2. Determinación del contenido

Práctica de Análisis de alimentos 12

4,92178 25 500 246,089 10

Práctica de Análisis de alimentos 13

9.3. Extracción de compuestos fenólicos

Práctica de Análisis de alimentos 14

A simple viste se observa que la mezcla de etanol y agua en proporción 1:1, es

9.4. Determinación de cafeína y ácido clorogénico de la cáscara de café

Práctica de Análisis de alimentos 15

8.4. Determinación de fenoles totales por espectrofotometría

Práctica de Análisis de alimentos 16

Práctica de Análisis de alimentos 17

Además, se observa que la extracción dinámica y microondas a 100°C son los