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PRACTICA 4.

EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN
DE ARN DE PLANTAS PRACTICA 5.
Materia: Laboratorio de
CUANTIFICACIÓN DE ARN POR
biotecnología molecular
ESPECTROFOTOMETRÍA Y VISUALIZACIÓN
EN GEL DE AGAROSA

Unidad Profesional Interdisiplinaria de Ingenieria Campus


Guanajuato

Laboratorio de biotecnología molecular


Profesores:
Dra. Karla Lizbeth Macías Sánchez
M. en C. Francisco Sánchez López
Dr. César Aza González

Alumnos

Hugo Ramírez Rodríguez 2011660475


Juan Cristóbal García García 2012660213
José Gilberto Savi Tejeda 2012660319
Ricardo Rafael Marín Mosqueda 2010660234
Erick Noé Soto Martínez 2011660270

Reporte Prácticas:
4. EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ARN DE PLANTAS
5. CUANTIFICACIÓN DE ARN POR ESPECTROFOTOMETRÍA Y
VISUALIZACIÓN EN GEL DE AGAROSA

5BV1

25/02/2014
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PRACTICA 4. EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN
DE ARN DE PLANTAS PRACTICA 5.
Materia: Laboratorio de
CUANTIFICACIÓN DE ARN POR
biotecnología molecular
ESPECTROFOTOMETRÍA Y VISUALIZACIÓN
EN GEL DE AGAROSA

Resultados

Siguiendo el protocolo se llevó a cabo la extracción y purificación de RNA total


proveniente de Capsicum annuum (chile serrano) el cual fue congelado por medio
de nitrógeno líquido, y macerado.
La ruptura celular es el primer paso en la extracción y uno de los más críticos para
obtener un ARN total con buen rendimiento y calidad. Uno de los problemas al
trabajar con plantas y hongos filamentosos es la composición de su pared celular,
lo cual dificulta el acceso al interior de la célula para la extracción de todo el
contenido intracelular. Dicha pared se debe romper por acción mecánica,
pulverizando el tejido con hielo seco o con nitrógeno líquido. (Rogers and Bendish,
1988).
Una vez realizada esta ruptura celular se emplean soluciones para obtener
segmentos de RNA íntegros. Estas soluciones, de baja o alta fuerza iónica y de
altas concentraciones de cloruro de sodio (NaCl) destruyen rápidamente las
membranas celulares e inactivan las RNAsas, el complejo empleado en la práctica
(RNAse out) es una solución de este tipo, por lo cual inactiva la RNAsas.

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Descripción RNasa out (Invitrogen)

El complejo RNAseOUT™ Inhibidor de ribonucleasas recombinantes es un


potente inhibidor no competitivo de ribonucleasas de tipo pancreático como
las RNAsas A y es usado para evitar la degradación del RNA.
RNAseOUT™es una proteína ácida con un peso molecular de ~52 kDa.
RNAseOUT™ inhibe RNAsa A, RNAsa B, y RNAsa C.

La cuantificación de RNA se llevó a cabo mediante el método de electroforesis en


gel de agarosa y a través del método de espectrofotometría por medio del
Nanodrop.

Tabla 1.- Concentraciones y absorbancias obtenidas del Nanodrop para las


muestras analizadas.

Conc. AC. Nucl A260 A280 260/280 230/260 260/230

Medición 1 1183.4 µg/mL 24.792 13.256 1.87 2.04 0.49

Medición 2 991.7 µg/mL 29.589 17.902 1.65 1.49 0.67

De acuerdo a los valores obtenidos en la Tabla I., para RNA de Capsicum


annuum, la muestra 1 sugiere ser una muestra libre de impurezas proteicas
respecto a la relación 260/280, ya que, para considerar la muestra como de alta
pureza este valor debe estar en el intervalo de 1.8-2.2, obteniendo una relación de
1.87 en dicha muestra (1μL cuantificado mediante Nanodrop 2000c).
Cocientes menores a este intervalo indican contaminación de la muestra por
impurezas proteicas, tal es el caso de la muestra 2 con un valor de 1.65 (Escrig,
2003).

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Para cuantificar la contaminación por fenol, cloroformo y carbohidratos, se utiliza la


relación 230/260 o bien 260/230, donde el cociente 230/260, debe ser mayor de
2.0 o menor de 0.5 para la relación 260/230, obteniendo un resultado en
Nanodrop™ 2000c (Tabla X) de 2.04 y 0.49 para la muestra 1 (1 ),
respectivamente para las relaciones 230/260 y 260/230 por lo que la muestra 1 es
una muestra libre de estas impurezas (Escrig, 2003)(Mackey, 2007).

Figura 1.- Resultados obtenidos de la electroforesis en gel de agarosa. En el lado derecho


de la imagen se pueden observar los tamaños de las bandas correspondientes al marcador
de peso molecular. Los carriles número 4 y 5 corresponden a las muestras analizadas en el
reporte.

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Electroforesis en gel de agarosa donde el carril M representa al marcador


molecular (Hyperladder 1kB,Bioline), el carril 1 y 7 corresponden al del equipo
AM, carriles 2 y 3 al equipo 0, carriles 4 y 5 para el equipo X, carril 6 para el
equipo 64 y carriles 8 y 9 para el equipo 3, el círculo en rojo representa el lugar
donde se presentó una posible picadura en el gel con punta de micropipeta, lo cual
pudo haber afectado en la migración de las moléculas, reflejándose esto en una
imagen de bandas difusas.

Figura 3.- Análisis del carril 5 de la electroforesis en gel de agarosa para RNA de Capsicum
annuum mediante software de procesamiento de imágenes GelAnalizer2010a donde no se
localiza ninguna banda específica para RNA.

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Figura 4.- Análisis del carril 6 de la electroforesis en gel de agarosa para ARN de Capsicum
annuum mediante software de procesamiento de imágenes GelAnalizer2010a donde se
identifica una banda específica para ARN en la posición de 504 pb.

DISCUSIÓN DE RESULTADOS
El RNA generalmente se encuentra en forma de cadena sencilla, aunque suele
formar estructuras secundarias de doble hélice, por auto apareamiento de
regiones complementarias. La mayor parte del RNA forma parte de los ribosomas.
A diferencia del DNA, el RNA es muy inestable una vez obtenido del tejido, por la
presencia de las RNAsas celulares. Por ello resulta crítica la congelación del tejido
o su rápida homogeneización en la solución desnaturalizante. Una fuente
potencialmente grande de contaminación con RNAsas son las manos del
investigador por las células epidérmicas que se liberan continuamente.

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Es por ello obligado el uso de guantes tanto al realizar la extracción como al


preparar las soluciones. De fundamental importancia para una extracción de RNA
intacto con éxito es la ejecución de todas las fases tan rápidamente como sea
posible, ya que esto elimina riesgos de contaminación (Hernández, 1995).
Es importante trabajar con soluciones libres de RNAsas contaminantes, y esto se
consigue tratándolos previamente con DEPC. El DEPC (dietil pirocarbonato) es un
agente alquilante que reacciona covalentemente de modo inespecífico con las
proteínas, pero es muy reactivo con los sitios activos de las RNAsas,
inactivándolas de manera muy eficaz, aunque no absolutamente. El DEPC
sobrante puede reaccionar con el RNA y es preciso eliminarlo introduciendo en la
autoclave las soluciones antes de usarlas; así, el DEPC se descompone en etanol
y CO2 que son volátiles. Una vía para evitar la degradación de RNA durante la
extracción es desnaturalizar todas las proteínas celulares, incluyendo las RNAsas
(Hernández, 1995).
El RNA total está constituido por 80% de RNAr (28S, 18S, 5S y 5.8S), 5% de
RNAm y 15% de RNAt. (Amaru, 2008). Existen diversos tipos de RNA ribosómico
nombrados de acuerdo a su coeficiente de sedimentación. En procariotas, el
RNAr 23S y el 5S constituyen la subunidad mayor ribosomal, mientras que el 16S
forma parte de la subunidad menor. (Devlin, 2004).
En el carril 5 para la corrida electroforética en gel de agarosa (Figura 1) se puede
observar que la muestra de RNA de Capsicum annuum se concentró de manera
inadecuada observándose un resplandor, esto puede ser debido a que el gel fue
picado con la micropipeta resultando en una migración inadecuada, además se
puede decir que se obtuvo RNA de bajo peso molecular, pero no se logró
identificar qué subunidad de RNAr corresponde ó si es RNA de transferencia.
(Sambrook J, 2001) y (Brown TA ,1998).

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El carril 4 de la misma figura muestra una línea vertical definida a lo largo del gel,
lo cual señala una perforación en el gel de agarosa, debido a esto y a que la
mayor parte de la muestra se concentró en el pozo donde se depositó la muestra
es que obtenemos como resultado de la espectrofotometría una línea difusa de
RNA degradado.
Además se añade una posible contaminación de las muestras o una activación de
las RNAsas debido a no poner en hielo las muestras durante intervalos de tiempo
no definidos. Ya que al presentar un cambio de temperatura pudieron activarse las
RNAsas aún presentes en las muestras.
CONCLUSIONES

Se logro extraer RNA total a partir de Capsicum annuum (chile serrano) ambas
muestras de RNA resultaron libres de proteínas debido a las relaciones de
A260/A280 obtenidas, donde reportamos valores de 1.87 y 1.65, que nos
muestran una pureza aceptable en nuestras muestras. Además que las muestras
resultaron libres de fenol, carbohidratos y cloroformo debido a la relación
A260/A230 que nos dio un resultado de 0.49 y 0.67 en nuestras muestras
Comparando los valores obtenidos en el Nanodrop y el gel de agarosa, se
determinó que la muestra 1 contenía un nivel significativo de concentración de
RNA, mientras que en la muestra 2 se observó un nivel menor, por lo que se
concluye que al realizar el lavado del RNA se perdió un porcentaje de la
concentración de la muestra inicial.
Con respecto al resultado del gel de agarosa, se concluyó que al momento de
perforar el gel de agarosa con la punta de la micropipeta, esto generó la
difusividad de la muestra de RNA en el gel, al provocar una migración
inadecuada en la corrida electroforética.

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Otro factor que pudo causar dichas lecturas es que se mantuvo expuesta las
muestras a la temperatura ambiente, antes de realizar la colocación de las
muestras en los respectivos pozos lo cual pudo contribuir en el resultado obtenido.
En propuesta, se plantea tener un mayor control en los inhibidores de RNAsas, ya
que a estos complejos no logran modificar covalentemente a las RNAsas, estos
deben ser usados en todas las etapas de la extracción y purificación del RNA, de
esta manera evitando que se degrade el RNA en el transcurso de la práctica
(Chomczynski, Mackey, 1995).

CUESTIONARIO.

1.- Sobre el DEPC, en el protocolo de extracción de RNA, investigue:


a. Nombre IUPAC del compuesto
Dicarbonato de dietilo
b. Estructura química

c. Mecanismo de acción
El DEPC reacciona con los grupos amino de las RNAsas lo cual hace que se
desactiven químicamente (Philip M. Gilmartin, 2002).
Este compuesto reacciona con enzimas que llevan en la estructura de su sitio
activo los grupos –NH, SH y OH, la enzima 2, 3,4 es inhibida por este reactivo.
Tiene diversas aplicaciones, es usado como agente de esterificación, en el ácido
aspártico y glutámico condensa los grupos amino y carboxilo.

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Tiene la capacidad de carboxilar a restos de histidina y así, modificar los restos de


purina del ARN.
2.- Explique una metodología para obtener ARN mensajero a partir de ARN
total. Si lo considera utilice esquemas para la descripción del método.
1) Para la obtención de RNAm a partir de RNA total, se sigue el método de
captura en solución: poly-Atract RNAm isolation Systems (Promega).
2) Extraer previamente el RNA total.
3) Hibridar con un iniciador oligo (dT) biotinilado la región 3’poliA+ de los
ARNm.
4) Usar estraptavidina acoplada a partículas magnéticas, con el fin de capturar
los híbridos.
5) Descartar sobrenadante.
6) Eliminar ARN no mensajeros mediante lavados con tampón de alta
astringencia.
7) Eluir en 250 mL de agua libre de RNAsas el RNAm.
8) Anadir 0.1 volúmenes de acetato de sodio al 3 molar y 0.1 volúmenes de
isopropanol.
9) Dejar precipitar a una T de -20°C, durante toda la noche.
10)Centrifugar a 12000 g, por 10 minutos.
11) Descartar sobrenadante.
12)Lavar el precipitado con 1 mL de etanol a una concentración de 75%.
13)Secar el precipitado al vacío.
14)Realizar RT-PCR para determinar la integridad del ARN mensajero.

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3.- Explique cuál es la función de la formamida en el buffer de carga.


Compare y analice la composición del buffer de carga para ADN y ARN.
La formamida estabiliza la estructura secundaria del ADN al formar puentes de
H con las bases del ADN. Una concentración alta de formamida es capaz de
inhibir la PCR (en caso de realizarla), se recomienda utilizarla de 1% a 5%.
4. Explique la función de la RNAsa out y las especificaciones que para
este producto indica la casa comercial que la vende.
Es un inhibidor de RNAsas, es obtenida a partir de E. Coli, un tipo de cepa
recombinante. Tiene gran afinidad por las ribonucleasas del páncreas, llevando
a cabo una inhibición no competitiva. Es activa contra las siguientes RNAsas.
- 1t1
- T2
- S1
- H
Es compatible con los reactivos utilizados en la RT-PCR
Especificaciones:
No se debe exponer el producto a los cambios bruscos de T. y para que la
RNAsa mantenga su actividad debe de estar en presencia de DTT.

Cuestionario Práctica 5.
6.- Analice qué factores que afectan el rendimiento, calidad y pureza de los
ácidos nucleicos cuando se purifican.
El carril 2 y 3 se encuentra con un barrido el cual demuestra cierto grado de
degradación de ambas bandas, por lo que la muestra no tiene una pureza alta.
Para la banda 4, no se logra distinguir ninguna de las bandas por lo que el RNA de
esa muestra está completamente degradado.

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7.- A partir del siguiente problema, responda los incisos a, b, c y d:


Las siguientes imágenes muestran los productos de RNAm de tejido de flor de
plantas de chile (carril 2, 3 y 4) por un método basado en perlas magnéticas
(Dynabeads mRNA Purification Kit Dynal Biotech, Brown Deer, WI), a partir de
RNAt (carril 8). El panel A corresponde a una corrida después de 2 minutos de
iniciada la electroforesis a 100 V y el panel B a la misma corrida después de 30
minutos.

1 2 3 4 5 6 7 8

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1. Marcador de peso molecular 1Kb


2. Muestra 1 RNArr flor chile
3. Muestra 2 RNArr flor de chile
4. Muestra 3 RNArr flor de chile
5. RNA control 25pg
6. RNA control 50pg
7. RNA control 100pg
8. RNAt flor de chile
a) Analice la integridad de las muestras 2, 3 y 4.
El carril 2 y 3 se encuentra con un barrido el cual demuestra cierto grado de
degradación de ambas bandas, por lo que la muestra no tiene una pureza alta.
Para la banda 4, no se logra distinguir ninguna de las bandas por lo que el RNA
de esa muestra está completamente degradado.
b) Teniendo en cuenta los controles de RNA utilizados en la electroforesis (carriles
5, 6 y 7), estime visualmente la cantidad de RNA en las muestras de RNAm de los
carriles 2, 3 y 4.
Se estimó la cantidad de RNA que había en la muestra, teniendo 2 y 3
concentraciones muy similares de aproximadamente 80 pb para ambas, mientras
que en el carril 4 la concentración puede estar entre 0-5 pb.
c) Calcule mediante un programa de cómputo de análisis y procesamiento de
imágenes, la Concentración de las mismas muestras.
El gel se analizó mediante el software GelAnalyzer 2010ª.

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Figura 5. Análisis para el segundo carril.

Figura 6. Análisis para el tercer carril.

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Figura 7. Análisis para el cuarto carril.

Del análisis de los carriles se obtiene:

Muestra/Carril Cantidad de muestra (bp)

2 97.08

3 105.45

4 0

d) Compare los resultados obtenidos en los incisos a y b. Emita conclusiones.


Se puede observar que la cantidad de RNA presente en las muestras 2 y 3 es
similar, como se supuso al hacer el análisis visual y mediante el software
GelAnalyzer 2010a, así como que en el carril 4 no se detectó muestra.

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8.- Por qué es necesario tomar dos imágenes en diferentes tiempos de


corrida para la estimación visual de la concentración de ARNm en gel de
agarosa.
Se hace por la razón de que es necesario corroborar que la cantidad de RNA
colocado en los pozos es la misma cantidad que se encuentra a lo largo del gel.
9.- Realice un análisis comparativo entre el método espectrofotométrico y
densitométrico para cuantificar ácidos nucléicos, teniendo en cuenta:
Fundamento
Precisión
Exactitud
Reproducibilidad
Cantidad de muestras a analizar
Costo de las determinaciones.

Densitometría Espectrofotómetro

Fundamento Cuantificación de la Separación de las moléculas de


absorbancia, obteniendo ácidos nucleicos dependiendo de
la concentración dentro de su tamaño.
la muestra.

Precisión Precisa No es preciso.

Exactitud Exacto. No es exacto debido a que la


variabilidad aumenta debido a que
es un método que depende del
análisis de imágenes.

Reproducibilidad Es reproducible y Es complicado debido a que se

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recuperable, y toma poco necesitan nuevos geles, implicando


tiempo volver a preparar tiempo invertido así como
una muestra. materiales.

Cantidad de Nanodrop 1µL Depende del tamaño del pozo


muestras a (normalmente se manejan
analizar volúmenes entre 7-15µL).

Costo de las Baja (Equipo es costoso) Alta (los reactivos son costosos).
determinaciones

Referencias
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ed. Ed
 Cold Spring Harbor Laboratories. Nueva York. USA 2001. 2344 págs.
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Modificados en Muestras de Alimentos. Organización Mundial de la Salud.
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 Ávila, A. F. (2008). Ecología molecular. México, D.F.: Instituto Nacional de
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 Modificados en Muestras de Alimentos. Organización Mundial de la Salud.
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