sxscsdcsd

Un popular yeffUna forma eficaz de introducir a los estudiantes en los cursos de introducción al
laboratorio de química en el concepto y la práctica de la cromatografía en columna es mediante la
separación de pigmentos vegetales fotosintéticos.1 Esto se logra con mayor frecuencia utilizando
extractos de pigmentos de hojas de espinaca frescas o congeladas, que se pueden obtener fácilmente
y contienen pigmentos carotenoides y clorofila de polaridades y colores altamente contrastantes que
permiten a los estudiantes establecer visualmente la separación cromatográfica.1b-D,F Se han
informado varios métodos para extraer pigmentos de hojas de espinaca para la separación
cromatográfica; p. ej., triturar hojas frescas o congeladas en un mortero o dispositivo mecánico con
o sin disolvente orgánico, seguido de uno o más pasos de separación adicionales (líquidoextracción
de líquidos, fifiltración, centrifugación); 2 pretratar las hojas frescas con agua hirviendo o etanol
seguido de trituración con acetona o hidrocarburo;1b,D moler hojas congeladas con una solución de
acetona al 20% en hidrocarburo;1f y moler las hojas con un agente secante, a veces con arena
añadida, y extraerlas en acetona.3

Como tarea de un solo período, habitualmente les preguntamos a los estudiantes en nuestro Curso
de laboratorio de química orgánica de primer semestre para preparar un extracto de pigmento de
espinaca mediante un método de varios pasos.

2c y luego use cromatografía en columna de gravedad con 10 g de alúmina para separar carotenos y
clorofilas / feofitinas en dos fracciones separadas de color amarillo y verde, respectivamente. Tanto
la extracción de pigmentos como la cromatografía consumían mucho tiempo, y para garantizar que
todos los estudiantes completaran el experimento dentro del tiempo asignado, les pedimos que
trabajaran en parejas: uno realizando el aislamiento del pigmento y el otro preparando la columna.
Para abordar las restricciones de programación que ahora requieren que ejecutemos nuestro
experimento de cromatografía en columna el mismo día que un experimento de TLC no
relacionado, buscamos acortar el tiempo requerido para el experimento de columna adoptando la
práctica común de usar una pipeta

Pasteur para cromatografía de columna a microescala.1f Aunque se puede lograr una separación
rápida de los pigmentos en una microcolumna de pipeta utilizando una combinación de gravedad y
presión de aire, necesitábamos un método de extracción de pigmentos con menos manipulaciones
que las informadas. En consecuencia, desarrollamos un método de extracción de pigmento simple, a
pequeña escala (miligramos) utilizando material vegetal seco común que rápidamente unffords una
solución de extracto de color verde oscuro, todo lo cual se puede aplicar directamente a una
microcolumna. Como espinacas frescas y otras plantas de hojas verdes, secasflLas tortas de perejil,
cilantro, eneldo y espinaca están disponibles a bajo costo en las tiendas de comestibles locales o en
línea; pero a diferencia de los primeros, tienen el beneficio adicionalfits de capacidad de
almacenamiento a largo plazo y fácil de transferir y pesar.
La separación de pigmentos vegetales fotosintéticos es el paso previo requerido para la
cromatografía en columna, el cual es empleado en la enseñanza de los alumnos como
introducción de la práctica, el cual se puede realizar empleando con diversos extractos de
pigmentos, un ejemplo seria las hojas de espinaca frescas ya sean frescas o congeladas de
los cuales se puede obtener fácilmente pigmentos carotenoides y de la clorofila , los cuales
presentas colores altamente contrastantes con lo cual permite a los estudiantes establecer
visualmente la separación cromatográfica , se pueden emplear diversos métodos para
extraer los pigmentos de las hojas de espinaca del ejemplo mencionado como 1;triturar
hojas frescas en un mortero o dispositivo mecánico con o sin disolvente orgánico, seguido
de uno o más pasos de separación adicionales (extracción líquido-líquidos, filtración,
centrifugación); 2 Tratar las hojas frescas con agua hirviendo o etanol seguido de
trituración con acetona o hidrocarburo;3 Moler las hojas congeladas con una solución de
acetona al 20% en hidrocarburo;4 Moler las hojas con un agente secante, a veces con arena
añadida, y extraerlas en acetona. Posterior a dichos procesos se emplea cromatografía en
columna de gravedad con 10 g de alúmina para separar carotenos y clorofilas / feofitinas en
dos fracciones separadas de color amarillo y verde respectivamente , empleando una pipeta
comúnmente adoptando para esta práctica .Sin embargo aunque se puede lograr una
separación rápida de los pigmentos en una microcolumna de pipeta utilizando una
combinación de gravedad y presión de aire,requiere mucho tiempo por ello los autores
desarrollaron un método de extracción de pigmento simple, a pequeña escala utilizando
como materia prima espinacas frescas y otras plantas de hojas verdes como perejil, cilantro,
eneldo y con ello disminuir el paso más trabajoso y que toma más tiempo por los diversos
procesos que se emplea comúnmente para esta practica .

En consecuencia, desarrollamos un método de extracción de pigmento simple, a pequeña escala

(miligramos) utilizando material vegetal seco común que rápidamente unffords una solución de
extracto de color verde oscuro, todo lo cual se puede aplicar directamente a una microcolumna.
Como espinacas frescas y otras plantas de hojas verdes, secasflLas tortas de perejil, cilantro, eneldo
y espinaca están disponibles a bajo costo en las tiendas de comestibles locales o en línea; pero a
diferencia de los primeros, tienen el beneficio adicionalfits de capacidad de almacenamiento a largo
plazo y fácil de transferir y pesar.
■EXPERIMENTAR

Los autores emplearon dos métodos en la de extracción de pigmento (A o B), los cuales fue realizado por los
estudiantes, utilizando perejil, cilantro, eneldo o espinaca

(A) En esta serie de pasos los alumnos primeramente agregaron heptano (0.5 mL) en los 4 Tubos de
ensayo de 100 mm que contenían 50 mg de material vegetal seco seguido a ello adicionaron 3 gotas
de acetona. Empleando para ello una varilla de vidrio resistente para moler y triturar la suspensión
durante aproximadamente 2 minutos formando con ello una solución de color verde oscuro, el cual
se pueden transferir directamente a la pipeta de microcolumna para la cromatografía

Figura 1. Extractos de color verde oscuro de (a) espinacas, (b) cilantro, (c) perejil
y (d) eneldo utilizando el método A.

(B) En esta serie de pasos los alumnos primeramente agregaron acetona (0.5 mL) en los 4 Tubos de
ensayo de 100 mm que contenían 50 mg de material vegetal seco, empleando para ello una varilla de
vidrio resistente para moler y triturar la suspensión durante aproximadamente 2 minutos, cuya
solución resultante presento un color verde oscuro, el cual transfirieron mediante una pipeta para
realizar la evaporación rotatoria , de ello los alumnos atuvieron un residuo de color verde oscuro, el
cual diluyeron con agua y agregaron 15 gotas de heptano directamente a través de una pipeta en una
microcolumna de cromatografía.

Después de la extracción de los pigmento ya sea empleando el método A o B, los estudiantes prepararon
microcolumnas empaquetadas en seco utilizando pipetas Pasteur de tallo corto (3/4 pulgadas) y gel de sílice
(0,75 g; 230- 400 mallas) buscando obtener un empaquetamiento uniforme, añadieron rápidamente heptano a
través de la microcolumna mediante una jeringa de plástico o una pera de goma de pipeta Pasteur como
eluyente , de ello los carotenos se eluyeron por gravedad y fueron recogidos por los estudiantes como una
única fracción amarilla dentro , análogamente con la clorofila / feofitina se eluyeron rápidamente y fueron
recogidos como una única fracción verde.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los dos métodos ideados por los autores, fueron realizados por sus alumnos para ello
se les asignó un material vegetal (perejil, eneldo, espinaca y cilantro) y trabajar con el
método de extracción A o B, de esto obtuvieron los siguientes resultados:

- Los estudiantes trabajaron individualmente tanto en el aislamiento de pigmentos

como en la separación cromatográfica, y completaron sus aislamientos y
separaciones en 1-1,5 h.
- Usando el método A o B en hierbas secas (perejil, cilantro , eneldo y espinaca ), los
estudiantes obtuvieron extractos con concentraciones de pigmento consistentemente
y bandas de columnas de colores intensos

Figura 2. Resultados cromatográficos de los estudiantes utilizando extracto de

pigmento de perejil del método A; (a y b): separación limpia de carotenos
y clorofilas ; (c): Fracciones de columna de colores brillantes carotenos amarillos
(izquierda) y clorofilas verdes (derecha).
- Las bandas de columnas del perejil y cilantro presentaron un color más vívido que
los del eneldo y las espinacas, posiblemente debido a las variaciones en el contenido
de pigmento causadas por los métodos utilizados para su fabricación.
- La acetona es uno de los disolventes más utilizados para la extracción de
carotenoides y clorofilas de las plantas.
- Se puede emplear acetona para la extracción de pigmentos de perejil seco
pulverizado, sin embargo el uso de acetona o mezclas de disolventes ricas en
acetona para la extracción de pigmentos a pequeña escala (como en el método B) no
permite la carga directa de todo el extracto en una microcolumna de pipeta corta;
esto debido a la alta fuerza eluotrópica que causa una superposición severa de
caroteno y cloruro sobre las bandas cromatográficas.
- Un extracto de pigmento en hidrocarburo puro sería ideal para la carga directa de la
columna, pero las clorofilas más polares se extraerían solo parcialmente y lo mismo
ocurre con los carotenoides más polares que muestran mayor solubilidad en acetona
que en hidrocarburos.
- Una mezcla de hidrocarburo con una pequeña cantidad de acetona extrae
completamente todos los carotenoides, incluidos los ésteres de xantofila
y los carotenoides secundarios

- Usando el método de extracción A, los estudiantes encontraron que la concentración

de acetona debe ser lo suficientemente alta para realizar una eficiente extracción de
pigmentos fotosintéticos ya que al tener baja concentración llevaría a tener poca
efectividad sobre la separación cromatográfica de carotenos y clorofilas.

- De los dos métodos de extracción de pigmentos , el método A es el más

Sencillo: evita los pasos adicionales de evaporación del solvente y disolución del
pigmento del método B, lo que permite a los estudiantes transferir toda la solución
de extracto directamente del tubo de ensayo a la microcolumna.
Los instructores
que requieran un experimento aún más abreviado pueden modificar el
método A para preparar cantidades mayores de extractos de pigmentos
concentrados de cualquiera de los cuatro materiales vegetales secos
antes del laboratorio para que los estudiantes puedan omitir la
extracción y proceder directamente a la separación cromatográfica. Por
ejemplo, la instructora en una sección amplió el método A (1.0 g de
cilantro seco, 10 mL de heptano y 60 gotas de acetona) para obtener un
extracto de pigmento concentrado que sus estudiantes usaron con éxito
como solución madre para sus separaciones.
Aunque les pedimos a nuestros estudiantes que aislaran todos los
carotenos y todas las clorofilas como dos fracciones distintas de amarillo y
verde, respectivamente, este experimento podría modificarse fácilmente.fied
para lograr una mejor separación de cada clase de pigmento utilizando las
condiciones cromatográficas descritas en informes anteriores.1b1d