Las DNA-polimerasas

La propiedad más notable de las células vivas

es su capacidad de reproducirse con una
fidelidad casi perfecta, no solamente una
generación, sino durante centenares y millares
de generaciones. El modelo que explica cómo
se duplica el DNA se denomina modelo
semiconservativo ya que a partir de una
molécula de ADN obtendremos dos
exactamente iguales, cada una con una hebra

antigua (cadena parda en la imagen siguiente) y otra nueva (cadena naranja en la imagen
siguiente): la cadena original comienza a separarse de un extremo a otro de modo que
cada una de las hélices va a sintetizar una hélice nueva complementaria habiendo
tomado como modelo o patrón a la hélice inicial.

La replicación del DNA está catalizada por una enzima que se denomina DNA-
polimerasa: cataliza la formación de cadenas de nucleótidos por la adición sucesiva de
nucleótidos trifosfato (NTP). Al incorporarse el NTP, se liberan dos de los tres fosfatos
para aportar la energía necesaria a la reacción química. Las DNA-polimerasas sólo
funcionan utilizando un DNA como molde, necesitando inexcusablemente un cebador
(pequeño oligonucleótido de 5 a 30 nucleótidos que puede ser un pequeño DNA o
RNA) al que se añadirá el primer nucleótido. Los nucleótidos se van añadiendo en el
extremo 3’ de la cadena en síntesis. Todas las DNA-polimerasas tienen una estructura
común en forma de mano derecha con tres dominios claramente diferenciados a lo que
denominanermos «dedos», «palma» y «pulgar».
La DNA-polimerasa no comienza a replicar ni al azar ni en cualquier parte. Un
complejo sistema de regulación intracelular le indica el momento del ciclo celular en
que debe comenzarse la replicación, la enzima reconoce una secuencia de nucleótidos
llamada origen de replicación que marca el punto el que ha de comenzarse la
replicación. En Escherichia coli es la secuencia de 245 pares de bases que tiene varias
repeticiones de una secuencia consenso GATCTNTTNTTT.
La replicación
Meselson y Stahl confirman en 1958 que la síntesis del DNA es semiconservativa
partiendo de un DNA con gran contenido de [15N].

El proceso se inicia con la

enzima helicasa que se
dedica a deshacer los puentes
de hidrógeno entre los pares
de bases para poder separar
las dos cadenas del DNA. En
el caso de E. coli, se observa que el origen de replicación es rico en A y T para que
cueste menos
energía
separar las
cadenas. La
separación
de las dos
cadenas
provoca una
serie de
tensiones topológicas en el DNA que hacen necesaria la intervención de otras enzimas,
las topoisomerasas, para eliminar dichas tensiones.Se forma así una burbuja de
replicación con un ADN desapareado flanquedado por sendos ADN apareados.
Como el proceso es bidireccional, a cada extremo de la burbuja se forma una horquilla
de replicación de manera que las dos hebras se van copiando a la par. Antes de que la
DNA-polimerasa añada el primer nucleótido interviene una DNA-polimerasa
denominada primasa que sintetiza un corto fragmento de RNA de 10 nucleótidos que
actúa de cebador. El cebador es elongado por la DNA-polimerasa en dirección 5´->3´.
Una de las dos hebras, la hebra conductora es de crecimiento continuo puesto que la
horquilla se va abriendo en el mismo sentido que la DNA-polimerasa añade los
nucleótidos. La otra cadena (hebra retrasada) transcurre en sentido opuesto, por lo que
ha de seguir un proceso un poco diferente para replicarse. En ella la primasa sintetiza el
cebador a 1000 nucleótidos del punto de separación del DNA progenitor. A partir del
cebador la DNA-polimerasa sintetiza unos 1000 nucleótidos de DNA, alejándose de la
horquilla de replicación, formándose el denominado fragmento de Okazaki. Después,
otra DNA-polimerasa distinta retira los fragmentos de RNA que han hecho de cebador y
rellena los huecos con nucleótidos de DNA. Finalmente la ADN-ligasa empalma entre
sí los diferentes fragmentos para formar una cadena única a partir de los fragmentos de
Okazaki; por eso se dice que es una replicación discontinua. El proceso continúa hasta
que se duplica todo el DNA. El conjunto de proteínas que se formaen el punto de
bifurcación de la horquilla se conoce como replisoma. Es mejor conocido es el
replisoma de E. coli.
Aunque las actividades enzimáticas sean las mismas en procariotas y eucariotas, hay
muchas más proteínas implicadas en la replicación de los eucariotas. Por otro lado, el
DNA eucariótico tiene más problemas con el superenrollamiento al estar muy
estrechamente asociado a unas proteínas denominadas histonas. También es distinto el
hecho de que en un cromosoma procariótico sólo hay un origen de replicación en el
único cromosoma, mientras que en los de eucariotas suele haber muchos más (a veces
más de 30.000) por cada cromosoma. Los múliples orígenes de replicación en eucariotas
asegura que el genoma se puede replicar en muy poco tiempo. Una visión general del
proceso es la siguiente:

Terminación de la replicación: síntesis de los telómeros

El final de la replicación en eucariotas tiene que resolver el problema del acortamiento de los cromosomas
Para ello ha desarrollado la estructura de los telómeros y telosomas, y la actuación de una nueva enzima
emparentada con las retrotranscriptasas: la telomerasa. Para entender la estructura de los telómeros y el
mecanismo de acción de la telomerasa descárgate este fichero PDF con 25 imágenes.

EPLICACI�N DEL DNA

Pregunta nº 1 (Múltiple Elección): En una horquilla de replicaci�n

A) las dos hebras hijas se replican del mismo modo

B) la hebra gu�a se replica en direcci�n 3'-->5'
C) la hebra retardada se replica de forma fragmentada
D) s�lo se replica una de las hebras, que recibe el nombre de hebra
codificadora

Pregunta nº 2 (Múltiple Elección): La DNA-polimerasa III de E. coli

 A) es un mon�mero de 103 kDa
B) necesita de un molde, pero no de cebador
C) necesita de un cebador, pero no de molde
D) es incapaz de unir el OH en 3' de una hebra con el fosfato en 5'
de otra hebra

Pregunta nº 3 (Múltiple Elección): Durante la replicaci�n, las dos hebras que

forman la mol�cula de DNA deben separarse. Este problema se resuelve con
la ayuda de prote�nas como

A) la DNA-polimerasa
B) la histona H1
C) las prote�nas ssb
D) la helicasa

Pregunta nº 4 (Múltiple Elección): La replicaci�n del DNA

A) normalmente es bidireccional
B) es conservadora
C) se lleva a cabo mediante unidades discretas llamadas replicones
D) requiere una mol�cula de RNA que act�a como cebador

Pregunta nº 5 (Múltiple Elección): La uni�n entre el OH en 3' de una hebra

de DNA y el OH de un fosfato en 5' de otra hebra de DNA la cataliza el enzima

A) DNA-polimerasa I
B) DNA-polimerasa III
C) DNA-ligasa
D) helicasa

Pregunta nº 6 (Múltiple Elección): El enzima primasa cataliza la s�ntesis de

A) fragmentos de Okazaki
B) DNA circular
C) RNA cebador
D) RNA de transferencia (RNAt).

Pregunta nº 7 (Múltiple Elección): Los fragmentos de Okazaki

 A) tienen un tama�o que oscila entre 1000 y 2000 nucle �tidos
B) se sintetizan sin necesidad de cebador
C) se van soldando unos con otros gracias a la RNA-primasa
D) se sintetizan �nicamente en la hebra retardada, en direcci �n
3'-->5'

Pregunta nº 8 (Múltiple Elección): Las zonas del DNA que se est�n

replicando pueden adoptar diversas estructuras como

A) horquilla de replicaci�n
B) estructura  (theta), si el DNA es circular
C) burbuja de replicaci�n
D) nucleosoma

Pregunta nº 9 (Múltiple Elección): La DNA-polimerasa I de E. coli

A) s�lo act�a en presencia de una mol�cula de DNA que act �a

como molde
B) no requiere de cebador
C) funciona como polimerasa tanto en direcci�n 5'-->3' como en
direcci�n 3'-->5'
D) funciona como exonucleasa tanto en direcci �n 5'-->3' como en
direcci�n 3'-->5'

Pregunta nº 10 (Múltiple Elección): La DNA-polimerasa I de E. coli

A) posee funci�n correctora

B) puede funcionar al mismo tiempo como polimerasa y como
exonucleasa
C) elimina los RNA cebadores utilizados durante la replicaci �n
D) es capaz de unir el OH en 3' de una hebra con el fosfato en 5' de
otra hebra

VOLVER A EMPEZAR

ipos de alteraciones del DNA

Se consideran alteraciones todos aquellos procesos en los que el DNA es sustrato de la
reacción y no molde. Además, al final del proceso el DNA resultate es distinto al DNA
inicial.
Restricción: mediante actividades metilasa y endonucleasa se protege el DNA propio
del foráneo.
Recombinación: se redistribuyen o reorganizan dos moléculas de DNA
Reparación: corrige aquellos errores introducidos en la secuencia del DNA tras la
replicación
Transposición: es un tipo especial de recombinación con el que se consigue cambiar de
posición un DNA, o sea, reordenarlo, y en otras lo que hace es amplificarlo.

Restricción
Se descubrió estudiando por qué una célula
restringe el tipo de huesped que acoge
(esencialmente virus) y la modificaciones que
sufren los DNA que han sido restringidos
(experimentos de Werner Arber en los años 60, en
los que acuñó los términos restricción y
modificación): Se vió que el fago λ infectaba muy
eficazmente la cepa K12 de E. coli, pero muy poco
la cepa B, ya que la mayor parte del DNA del fago
infectante se degradaba en las infecciones no
productivas. Sin embargo, los fagos aislados de la
cepa B sí eran capaces de infectarla con gran
eficacia, pero infectaban mal la cepa K.

Para defenderse de la restricción de su propio

DNA, los procariotas metilan las secuencias que
reconocen las restrictasas y forman las N6-metil-A
y N4-metil-C. En los años 70, Hamilton Smith
descubre que las restrictasas son endonucleasas
con sitios de corte preciso y repetible. No podía
imaginar la importancia biotecnológica de su
hallazgo.

Según la naturaleza de la metilasa y la restrictasa

se pueden definir distintos sistema de restricción.

Tipo I
 La actividad metilasa y nucleasa se encuentran en la misma molécula proteica,
formada por tres subunidades (la tercera sirve para reconocer la secuencia de
corte). El sitio reconocido es al azar y el corte se produce a bastante distancia
(hasta 1.000 pb) del sitio de reconocimiento, gastando mucho ATP.
Tipo II
Son las que más utilidad han tenido en investigación por cortar dentro de la
secuencia de reconocimiento. La metilasa y la nucleasa son proteínas distintas.
Se conoce la estructura tridimensional de muchas de ellas, como EcoRI
acomplejada al DNA que reconoce.
Tipo III
La actividad metilasa y nucleasa también residen en una única proteína, pero
formada por tan solo 2 subunidades. No gastan ATP en la hidrólisis, que se
produce más cerca del lugar de reconocimiento (a 25 pb).

También se ha descubierto un sistema de restricción distinto: se trata del sistema McrA,

McrBC y Mrr que digiere el DNA metilado siempre que la metilación no provenga de
una de la metilasas de la célula. Se ha visto que inactivar este sistema es muy
importante para introducir con eficacia fragmentos de DNA genómico grandes en las
bacterias.

1.- Metilación del DNA

En los procariotas se puede encontrar modificada menos de un 1% de las A y las C en

forma de N6-mA y N4-mC en sitios específicos. En los eucariotas hay más metilación:
se metilan entre un 3% y un 5% de las C en sitios no específicos y en relación con la
inactivación génica

El papel principal de la metilación en procariotas está ligado a los fenómenos de

restricción, y un poco a la regulación de la replicación. En eucariotas, la metilación
determina el control de la replicación y la transcripción (aunque los insectos no metilan
el DNA); así, la mayoría de los genes eucarióticos se reprimen cuando están
hipermetilados y se expresan hipometilados.

En procariotas la metilación la realizan las metilasas de los sistemas de restricción y las

dam así como las Mcr. En cambio, en eucariotas lo realizan las metilasas de
mantenimiento y algunos de los procesos de ribointerferencia.

2.- Sistema de tipo II

Descubierto por Hamilton Smith y Daniel Nathans a finales de los 60. La nucleasa tiene
una masa entre 30 y 40 kDa, necesita Mg (no ATP), y la metilasa ha de asociarse a la
nucleasa para reconocer el sitio específico. Sobre DNA hemimetilado —por ejemplo,
tras la replicación—, actúa antes la metilasa que la nucleasa; si actuara la nucleasa, sólo
cortaría en la cadena sin metilar.

El sitio reconocido es casi siempre palindrómico, dentro del que se suele producir un
corte asimétrico que provoca extremos protuberantes en 5' o en 3', que también se
denominan extremos cohesivos. A veces el corte es simétrico y se liberan extremos
romos.
En 1986 John Rosenberg cristalizó la primera enzima de restricción (EcoRI)
acomplejada a un oligonucleótido bicatenario que contenía la secuencia de
reconocimiento. La secuencia del DNA se reconoce por el surco mayor y la proteína
tiene un «brazo» N-terminal que envuelve el DNA. La secuencia es reconocida por 12
puentes de hidrógeno entre las purinas y 2 Arg y un Glu. Las dos bases centrales del
sitio reconocido sufren un empuje hacia el surco menor, lo que hace que no estén
apiladas con las demás. El otro monómero de la enzima reconoce lo mismo, pero en la
otra cadena. Esta afinidad provoca el acercamiento de los nucleótidos reconocidos
específicamente, por lo que se debilitan los enlaces fosfodiéster en esa región
facilitándose, por tanto, su corte. En el caso de EcoRV, el reconocimiento se produce
por el surco menor

3.- Aplicaciones de las enzimas de restricción

 La cartografía (mapeo) de genomas, que comenzó con el mapa físico de
pequeñas moléculas de DNA a comienzos de los 70. Sirve para localizar genes
en un genoma en distancias reales en lugar de genéticas.
 En 1973 Herber Boyer y Stanley Cohen se dieron cuenta de que podían utilizar
las enzimas de restricción para clonar un gen mediante la ligación del DNA
interesante a un plásmido que dirigiera su autorreplicación. Esto fue el origen
del DNA recombinante.
 La búsqueda de los recombinantes deseados se facilita con nuevos vectores
(plásmidos) con sitios de restricción adecuados y múltiples, marcadores de fácil
selección, y que sirven para la expresión del gen clonado.
 Producción industrial: mediante el DNA recombinante y los nuevos vectores
de expresión, se ha conseguido en la industria farmacéutica purificar insulina
humana expresada en bacterias. Se consiguió en 1977 y se consiguió
comercializar en 1982. Factores de coagulación, hormona de crecimiento o
interferones son otras moléculas que hoy en día también se fabrican así.
 Mutagénesis dirigida en la que se modifica un nucleótido en una secuencia
clonada en un pl