BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR:

Replicación-Propiedades Bioquímicas
del DNA
A fines de los años 1950… Cual era el mecanismo de replicación?
Propuestas: Conservativo, semi-conservativo y dispersivo
Mecanismo de replicación:
Propuestas: Conservativo, semi-conservativo y dispersivo
1958 El experimento de Meselson-Stahl demuestra que el ADN se
replica de modo semiconservativo.
La replicación es semiconservativa

Dispersivo
Semiconservativo

Semiconservativo
El apareamiento de bases subyace a la replicación del DNA y su reparación

En 1957 se descubrió la primer enzima polimerizadora DNA polimerasa que

cataliza la Reacción de polimerización
Análisis realizados en 1960 en cromosomas enteros revelaron una región localizada en el DNA
que se mueve progresivamente en el DNA parental

Horquillas de replicación
 Horquilla de replicación asimétrica

No existe DNA pol que polimerice en sentido 3´-5, SOLO 5´-3´

Cómo se sintetiza la hebra 3´-5´? Experimento a fines de 1960 con 3H-timidina

Hebra adelantada

Hebra retrasada

Fragmentos de OKAZAKI: 1000-2000 nt. Se polimerizan en sentido 5´-3´y luego se unen al final de la
síntesis

Figure 5-7 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Reacción de polimerización
(ADN polimerasa)

Ori: Sitio de Origen

Replicación
 Alta fidelidad (1 error cada 1x1010 nt)
 Rapidez (40 min)
 Sentido fosfato 5’ a oxidrilo 3’
 Las ADN polimerasas necesitan un molde y un oxidrilo 3 ’ libre
 La alta fidelidad de la replicación requiere varios mecanismos de chequeo de errores por la DNA pol

1 er Chequeo de la geometría exacta del par de bases que se va a unir antes de

catalizar la reacción fosfodiester: Ocurre antes de que el nt entrante sea agregado.
El nt correcto tiene mayor afinidad por la DNA pol que un nt incorrecto.
Después de la unión del nt pero antes de que sea covalentemente unido a la cadena,
La DNA pol tiene que sufrir un cambio conformacional .

2 do Chequeo Actividad exonucleasa 3´-5´de la DNA pol: ocurre inmediatamente

después de la unión covalente de un nt incorrecto.
La DNA pol es muy discriminativa en el tipo de cadena que va a elongar: requiere
un 3´OH libre de una base correctamente apareada en la hebra primer. La DNA
Pol corrige este tipo de errores recortando cualquier residuo no apareado
La necesidad de exactitud en la replicación probablemente explique porque la replicación solo puede hacerse en
sentido 5´-3´. De esta manera la DNA pol puede corregir errores. Si fuera en la dirección 3´-5´no.
Así y todo la DNA pol comete errores que la célula va a corregir mediante un proceso llamado strand-direct
missmatch repair
DNA primasa: usa ribonucleotidos trifosfatos para sintetizar
primers cortos de RNA en la hebra lagging (retrasada)

DNA primasa: sintetiza primer RNA

RNAse H: elimina RNA. Reconoce

RNA en hélices DNA/RNA

DNA ligasa: liga fragmentos de Okazaki

Para que la síntesis proceda se necesita abrir la doble hélice del DNA por delante de la horquilla de replicación para
que los dNTPs puedan entrar y aparearse DNA HELICASAS

DNA helicasa: hidroliza ATP cuando

esta unida a DNAss y puede desplazarse
Cuando encuentra una región de DNAds
separa las hebras

Hay 2 DNA helicasas distintas que se mueven en direcciones opuestas (tienen distinta polaridad) una en la hebra
continua y la otra en la retrasada
 Mas proteínas que participan en la replicación

Single-strand DNA-binding proteins (SSB) o hélix desestabilizing proteins: se unen y exponen el DNA simple
cadena. Ayudan a estabilizar la hélice desenrollada y la estiran
 Unos anillos deslizantes sostienen a la DNA pol mientras se desplaza por el DNA

Por si sola la DNA pol sintetiza solo una corta hebra de nucleótidos antes de desprenderse del DNA.
Hebra retrasada Hebra continua Regulated sliding clamp (“broche deslizante regulado”)
Esta propiedad Esta propiedad Mantiene a la DNA pol en el DNA cuando se mueve pero la suelta
es beneficiosa para NO es beneficiosa para Cuando la DNA pol pasa por una región de DNAds
la síntesis rápida de la síntesis de la hebra
los fragmentos de continua.
Hidroliza ATP
Okazaki en la hebra
retrasada
Proteína «gancho» (PCNA)
• Antígeno Nuclear de Células Proliferativas
• Le otorga procesividad a la polimerasa. De otro modo se
liberaría antes de terminar de replicar.
• Participa en reparación.

Cargador de PCNA

PCNA
MODELO COOPERATIVO DE PROTEINAS PARA FORMAR MAQUINARIA DE REPLICACION
Este modelo es tanto para procariotas

Figure 5-19a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

 Replisoma
Proteínas que participan en la replicación:
Helicasa
Proteínas de unión a cadena sencilla (SSB – RPA)

Topoisomerasas I y II (girasas):
DNA Primasa
Rnasa H1: Corta dúplex DNA/RNA
Endonucleasa flap 1 FEN1/RTH1
Ligasa
Telomerasa
Antígeno nuclear de células en
proliferación (PCNA)
ADN polimerasas
 En eucariotas

La DNA primasa esta incorporada en un complejo enzimático llamado DNA polimerasa α primasa.

La DNA polimerasa α empieza a polimerizar la hebra retrasada con RNA, luego extiende un primer de RNA con una
secuencia corta de DNA.

Dos DNA pol: DNA polimerasa δ, DNA polimerasa ε

La DNA polimerasa δ sintetiza la hebra retrasada.

La DNA polimerasa ε la hebra continua

La replicación tiene que ocurrir a través de los nucleosomas………

 Otro proceso de corrección de errores: Strand directed mismatch repair system
Procariotas

-Se lo encontró a partir de un screen realizado en bacterias en el que buscaban los genes encargados de
corregir errores. Buscaban cepas que tuvieran aumentadas la velocidad de mutaciones espontaneas (ej uno de esos
mutantes tenia alterado el gen de la DNA pol, su actividad 3´-5´exonucleasa)

-Detecta la distorsión en la hélice de DNA que se genera entre dos bases no complementarias apareadas.
Cual hebra arregla? Como sabe cual es la nueva?

-En E. coli depende de la metilación de residuos A en la secuencia GATC. Entonces las únicas secuencias GATC que
no están metiladas son aquellas que fueron recién sintetizadas (hebras nuevas).

Que hace el sistema de reparación? Reconoce las bases mal apareadas, corta el segmento DNA de la hebra nueva y
resintetiza
Hay 2 proteínas: MutS: se une específicamente al par de bases mal apareadas
MutL: escanea el DNA cercano para ver cual es la hebra nueva

-
 Eucariotas

Las nuevas hebras recién sintetizadas se re-

conocen porque tienen pequeños cortes en
la hebra recién sintetizada
 ¿Donde empieza la replicación?

Origen de replicación: Sitios reconocidos por proteínas iniciadoras

que palanquean las dos hebras rompiendo los pte de H de las hebras.
En general son zonas ricas en A y T
 REPLICACION EN PROCARIOTAS
Replicación Monofocal (un punto de inicio: Ori): zonas ricas en AyT reconocidas
por proteínas de iniciación

La iniciación de la replicación esta altamente regulada: solo ocurre cuando la bacteria tiene suficientes
nutrientes disponibles para poder realizar una vuelta entera de replicación.
Un origen de replicación utilizado tiene un período refractario causado por el atraso generado por la metilación
de las A y solo puede recomenzar cuando las A se hayan metilado
 Replicación de ADN circular

E. coli
 Origen de replicación (300 pb)
 Proteína iniciadora principal: dnaA
 Primasa: dnaC
 3 ADN pol: I, II y III
 ADNpol III: es la principal en la horquilla, Actividad
correctora (exonucleasa 3’--> 5’)
 Helicasa (dependiente de ATP): dnaB
 SSBPs
 ADNpol I:saca el primer y lo reemplaza por ADN (exo 5’
-->3’)
 Ligasa
 REPLICACION EN EUCARIOTAS
Humanos: 30.000-50.000 ORIC usados/división celular
• Cadena mucho más larga y lineal, se requieren Levaduras: 346
múltiples orígenes de replicación.
1- Unidades de replicación: los orígenes
de replicación tienden a ser activados en
clusters (20-80 orígenes que están cerca).
2- Las unidades de replicación se activan
en distintos momentos durante el ciclo
celular
3-Dentro de las unidades de replicación
los orígenes están separados entre
30000 a 300000 nt
4-Al igual que en bacterias, las horquillas
de replicación se forman de a pares y
Horquilla replicación Velocidad de replicación forman burbujas de replicación en
500 nt/s bacterias direcciones opuestas
50 nt/s mamíferos
~11 pb
Fragmentos de Okazaki
1000-2000 nt en bacterias
ADN molde
100-200 nt en mamíferos
La replicación del DNA en eucariotas SOLO ocurre en la fase S del ciclo celular (en mamíferos 8
hs, en levaduras 40 min)

Distintas regiones en el mismo cromosoma se replican a distintos tiempos

durante la fase S.

El orden en el cual se activan los orígenes de replicación depende en parte de

la estructura de la cromatina.

La heterocromatina se replica tarde en la fase S, sugiriendo que el momento en

que se replica esta relacionado al empaquetado de la cromatina
 Iniciación de la replicación en eucariotas

En levaduras

Las secuencias que pueden servir como origen de replicación

contienen:
1- Sitio de unión para un gran complejo iniciador formado por
múltiples subunidades llamado ORC (origin recognition complex)
2-secuencias de DNA ricas en A y T
3- Por lo menos un sitio de unión para proteínas que facilitan la
unión a ORC

Como se aseguran las células eucariotas que el DNA es replicado una sola vez?
Solo se pueden usar ORI en los que se haya formado un complejo de pre-replicativo
En G1 las helicasas se unen cerca del ORC generando un complejo pre-replicativo
Luego después del pasaje de G1 a S: proteínas quinasas activan helicasas y
DNA se abre y se pueden unir el resto de las proteínas incluyendo la DNA pol
A la vez las proteínas quinasas fosforilan ORC y previenen la formación de nuevos
complejos pre-replicativos
Fases de la REPLICACION

INICIO

Reconocimiento de la posición/posiciones de inicio de replicación (ORI)

ELONGACION
Eventos en la horquilla de replicación, donde se copian los polinucleotidos
parentales.

TERMINACION
Finalización de la replicación
• Al llegar al final de cada cadena atrasada, la primasa no tiene dónde colocar el
primer.
• Llegado un punto, regiones codificantes o de importancia reguladora serían
eliminadas por falta de copia en las células hijas.
• Los eucariotas tienen en los extremos secuencias llamadas telómeros que contienen
secuencias repetidas en tandem (protozoos, hongos, plantas, mamíferos)
• En humanos la secuencia es GGGTTA y se repite miles de veces en cada telomero
 SOLUCIÓN:TELOMERASAS
• Las telomerasas son ribonucleoproteínas,
transcriptasas inversas, que sintetizan ADN a partir
de un molde de ARN.
• Reconocen secuencias repetidas GGGTTA en tandem
• En su estructura poseen la secuencia RNA templado
ACCCCAAC
Telomerasa: complejo proteína y ARN
 Los telomeros tienen que poder ser diferenciados como telomeros

Estructura T loop de cromosoma

humano enlazado

• Nucleasa degrada el extremo 5´dejando un extremo protruyente 3´

• Shelterin: proteínas que reconocen el extremo protruyente y secuencias repetidas GGTTA y le ponen una
protección
 Reparación del DNA

- 10 a 10000 cambios al azar creados en el DNA al azar Solo el 0,02% se acumula como mutación permanente

-La célula posee muchos genes que codifican para enzimas de reparación. Cuando se mutan estos genes aumenta
muchísimo la tasa de mutación.

-Estudios recientes en humanos muestran una relación entre la disminución de la capacidad del DNA de reparar
sus errores y el aumento de tener enfermedades hereditarias y cancer
Lesiones que se producen en el DNA
 Alteraciones espontáneas del DNA que requieren reparación

Oxidación espontánea
Ataque hidrolítico

Metilación
Cambios químicos espontáneos mas frecuentes que crean serios daños en las bases del DNA

Depurinación y deaminación Dímeros de Timina

Se forman en DNAs expuestos

a luz UV
 ¿Cómo las modificaciones químicas de los nucleótidos generan mutaciones?

Si no se corrigen estas modificaciones generadas espontaneamente cuando el DNA se replique va a generar

deleciones de una o mas bases o sustituciones de un par de bases en la cadena “hija” de DNA. Estas
mutaciones se van a propagar a la siguiente generación.
 Dos mecanismos principales de reparación del daño al DNA

Ambos se basan en: sacar las bases dañadas, restablecer la secuencia original de DNA (DNA pol usa la hebra
de DNA como molde) y el corte de la doble hélice del DNA es sellado por una DNA ligasa
Métodos de estudio
 Propiedades fisicoquímicas
de los ácidos nucleicos

 Absorbancia
 Medio ácido y alcalino
 Densidad de flotación
(ultracentrifugación en gradientes de densidad)

 Temperatura de
desnaturalización
(estabilidad de la doble hélice a medida que se incrementa la temperatura)
El DNA absorbe luz UV en un rango entre 240 nm-280 nm

La absorción es máxima en 260 nm

La absorción se monitorea usando un espectrofotómetro

Los cálculos de concentración se hacen utilizando la ley de Lambert-Beer A=ECI

La absorbancia=1 a 260 nm es equivalente a 50 µg/ml de DNA

DNA simple cadena tiene una absorbancia 40% mayor que la doble hebra
Cuantificación y análisis por espectrofotometría del ADN

Unidades O.D.= A260 X volumen del stock X factor de dilución

260/280 ratio ~ 1,8 (ADN) y ~ 2,0 (ARN) - Depende del pH y fuerza
iónica del buffer usado (contaminación proteína).
260/230 ratio. Pureza: 1.8-2.2
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO

Efecto hipercrómico
Las bases nitrogenadas que forman parte de la estructura del DNA tienen la propiedad de absorber luz UV,
con un máximo de absorción a260 nm. La doble hélice de DNA, que tiene las bases ocultas en el interior,
absorbe menos luz que el DNA de cadena sencilla que tiene las bases más expuestas al exterior. Debido a
esto si se mide la absorción producida por un DNA de cadena doble y después de separar las dos cadena se
vuelve a medir se observa un aumento de esta. Este fenómeno se llama “Efecto hipercrómico”
 Densidad de los ácidos nucleicos
Existe una relación lineal entre el contenido en G+C y la densidad del DNA determinada en un
gradiente de densidad. A mayor contenido en G+C, mayor densidad.

DNA Densidad (g/cm3) % (G+C)

Polímero A-T 1.675 0

Diplococcus pneumoniae 1.700 42

Escherichia coli 1.710 51

Serratia marcescens 1.716 55

Mycobacterium phlei 1.732 73

Basándose en múltiples estudios de la densidad de los DNAs de diferentes organismos y de su

composición en bases nitrogenadas, se ha establecido una fórmula empírica que relaciona la
densidad de flotación () con el contenido en G+C expresado en %:

 = 1,660 + 0,00098(G+C)G+C)
La centrifugación en gradiente de densidad permite separar moléculas basado en forma, tamaño y densidad
 Desnaturalización del DNA
Cuando las dos hebras del DNA se separan en dos hebras simple cadena

Doble cadena (G+C)ds)

Simple cadena (G+C)ss)

Tm= 4(C+G)+2 (A+T) (funciona bien hasta 30 pb)
 Varios factores afectan la desnaturalización del DNA

Temperatura

Acidos

Bases
 DESNATURALIZACION POR CALOR

Desnaturalización del DNA

Condiciones que favorecen la desnaturalización

Alta temperatura
Baja fuerza iónica (repulsión de fosfatos)
Alto pH (desprotonación de bases, rompe pte H)

Monitoreo de la desnaturalización
Los enlaces conjugados de las bases generan absorción en el UV a 260nm

Nucleótidos libres> ssADN> dsADN

La temperatura a la cual la A260 alcanza la mitad de su valor máximo es

denominada Tm (temperatura de melting)

La Tm depende de la concentración salina, pH, composición, longitud

Oligonucleótidos cortos: Tm (oC) = (A+T)x2 + (C+G)x4

Cálculo de Tm Oligonucleótidos largos:

Tm = 81.5 +16.6Log [Na+] + 0.41 (%CG) – (625/N)
(N=longitud del oligo)
Parámetros que intervienenen en la desnaturalización del DNA

 Parámetro  Efecto sobre Tm Efecto sobre la velocidad de renaturalización

Composición de Incremento de Tm con el No ejerce efecto

bases aumento del %G-C

<150 bp; incremento de Incrementa la velocidad con la longitud

Longitud Tm con el incremento de
longitud; >500 bp no hay
efecto 

Fuerza iónica Incremento de Tm con el Optimo a 1.5 M Na+

aumento de [Na+] 

% bp mismatch  Disminuye Tm con el Disminuye la velocidad con el aumento de

aumento de %mismatch %mismatch

Concentración  No ejerce efecto Aumenta la velocidad con el aumento de [DNA]

Agentes disminuye Tm con el Optimo a 50% formamida

denaturalizantes aumento de
[formamide], [urea]

Temperatura - Optima a 20°C por debajo de Tm

 Renaturalización
 La desnaturalización es un proceso reversible
 Reanealling: reasociación de las cadenas de DNA

Algunos usos experimentales

de la hibridación de ácidos
nucleicos:

PCR
Southern blot
Northern blot
in situ hybridization
D-loop or R-loop mapping
Cot curves

Reassociación ADN-ADN
 PCR – Un ejemplo de como aprovechar el conocimiento
PCR: Polimerase Chain Reaction

 La capacidad de generar alto número de copias

idénticas de ADN fue posible a partir de 1970 por
métodos de recombniación genética (Clonado).

 Clonado de ADN es laborioso y caro, y la ubicación

de regiones/genes es muy difícil.

 PCR, se inventó en 1983 por Kary Mullis, permite la

amplificación (o duplicación) de millones de copias
de secuencias cortas de ADN con regiones
flanqueantes conocidas.
1993: Premio Nobel
Química
 PCR – Un ejemplo de como aprovechar el conocimiento

 Requiere solo ingredientes simples y económicos y un

par de horas.

ADN templado
Primers (cebadores Fw y Rv)
DNA polimerasa
dNTPs
Mg2+
Buffer

 Posteriormente se construyeron termocicladores

Problema: temperaturas de desnaturalización de ADN
afecta a la ADN polimerasa
Hot water bacteria:
Thermus aquaticus
Taq DNA polymerase
PCR – Un ejemplo de como aprovechar el conocimiento

Phusion High-Fidelity DNA Polymerase

schematic. The doublestranded DNA
binding domain (orange) is fused with a
novel Pyrococcus-like enzyme (yellow)
forming a unique high performance
polymerase.
Example thermal cycler protocol used in lab:

Step 1 7 min at 94C̊ Initial Denature

Step 2 45 cycles of:

20 sec at 94C̊ Denature

20 sec at 52C̊ Anneal
1 min at 72C̊ Extension

Step 3 7 min at 72C̊ Final Extension

Step 4 Infinite hold at 4C̊ Storage

(DNA doble cadena)

(secuencias palindrómicas)
 ENZIMAS DE RESTRICCION

Una secuencia palindrómica, o

palíndromo, es una secuencia de Extremos romos
ácido nucleico (ADN o ARN) que
es lo mismo si se lee de 5' a 3' en
una cadena o de 5' a 3' en la
cadena complementaria, con el
cual forma una doble hélice Extremos cohesivos

3 Familias:

I) Corte lejos (1000pb) de zona reconocimiento. Metilación

II) Corte en sitio restricción, uso en Tecnología ADN recombinante. Ausencia metilación
III) Corte cerca (apprx. 200pb) de sitio restriccion. Metilación
FIN