Microbiología General Lecturas complementarias – TP2

EL MICROSCOPIO

El microscopio es un instrumento óptico que amplifica la imagen de un objeto

pequeño. Es el instrumento que más se usa en los laboratorios que estudian los
microorganismos.
Mediante un sistema de lentes y fuentes de iluminación se puede hacer visible un
objeto microscópico. Los microscopios pueden aumentar de cien a miles de veces
el tamaño original.
Actualmente existen dos tipos de microscopios: el óptico y el electrónico. En el
microscopio óptico el aumento del objeto se consigue usando un sistema de lentes
que manipula el paso de los rayos de luz entre el objeto y los ojos. El microscopio
electrónico utiliza un rayo de electrones controlado por un campo magnético.

1. MICROSCOPIO OPTICO

Los microscopios de este tipo generalmente producen un aumento de 1000 veces el

tamaño original. El límite lo tienen en unas 2000 veces.

Las lentes de un microscopio óptico son: el condensador, el objetivo y el ocular.

La luz que entra en el sistema debe enfocarse sobre la preparación, y para ello se
utiliza el condensador. Elevando o bajando el condensador puede alterarse el plano
del foco de luz y elegirse una posición que consiga el foco preciso.
El objetivo es la lente situada cerca del objeto que se observa. El aumento primario
del objeto es producido por la lente del objetivo y la imagen se transmite al ocular,
donde se realiza el aumento final.

Los microscopios que normalmente se usan en microbiología están equipados con

tres objetivos: uno de bajo poder, uno de alto poder y un objetivo de inmersión.
Estos objetivos están montados sobre una pieza que se llama revólver y que puede
rotarse para alinear el objetivo deseado con el condensador.

La imagen formada por el objetivo es finalmente aumentada por el ocular. El

aumento total de un microscopio compuesto es el producto del aumento de su
objetivo y de su ocular. El microscopio compuesto es capaz de conseguir aumentos
considerablemente mayores que el microscopio construido con una sola lente. Este
último, llamado microscopio simple, se usa principalmente como lupas y cristales de
aumento.

Además de aumento, una propiedad muy importante de un microscopio es su poder

resolutivo; esto es la capacidad de mostrar distintos y separados dos puntos muy
cercanos. Cuanto mayor sea el poder resolutivo, mayor será la definición de un
objeto.

Los microscopios de gran poder de resolución son especialmente buenos para ver
pequeñas estructuras. El poder de resolución de un microscopio compuesto
depende de la longitud de onda utilizada y de una propiedad óptica de la lente
conocida como apertura numérica.

Como los microscopios ópticos utilizan luz visible, la longitud de onda está fijada y
es por lo que la resolución de un objeto es función de la apertura numérica. Cuanto
mayor sea la apertura, el objeto resuelto será más pequeño.
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Poder de resolución: 1/d = N sen a d: distancia entre puntos

0,5 l l: longitud de onda
a: mitad del ángulo de la lente objetivo
N: índice de refracción del medio
N sen a: apertura numérica

Un factor que afecta la apertura numérica, además de la construcción de la lente, es

el medio a través del cual pasa la luz. Mientras que el objetivo esté separado del
objeto por el aire, su apertura numérica nunca será mayor que 1,0. Para conseguir
aperturas numéricas mayores, el objetivo debe estar inmerso en un medio con
mayor índice de refracción que el aire. A estos líquidos se les denomina aceites de
inmersión; se utilizan con el objetivo de inmersión y permiten obtener una apertura
numérica entre 1,2 y 1,4.
Aún así, al utilizarse luz visible, estos microscopios llegan a tener un poder de
resolución de aproximadamente 0,25 µm, lo que significa que las partículas con un
tamaño menor a 0,25 µm no pueden distinguirse una de otras.

1.1 MICROSCOPIA OPTICA

Además del microscopio de campo claro, existen otros microscopios ópticos: de

campo oscuro, de fluorescencia y de contraste de fases.

1.1.a Microscopio de campo claro: usa como fuente de luz directa una bombilla o
bien la luz solar. Dado que los microorganismos son transparentes, es difícil
distinguirlos con este tipo de microscopía y es por ello que se los suele teñir.

1.1.b Microscopio de campo oscuro: está equipado con un condensador y

objetivo especial que iluminan a los microorganismos presentes en la muestra frente
a un fondo oscuro. Este microscopio se utiliza para visualizar microorganismos
vivos sin teñir.

1.1.c Microscopio de fluorescencia: para su empleo se requiere teñir la muestra

con una sustancia fluorescente, que absorbe energía de las ondas cortas de la luz
(azul). Se lo utiliza en inmunofluorescencia, técnica en la cual una sustancia
fluorescente se une a un anticuerpo específico de ciertos microorganismos. Si el
anticuerpo fluorescente se une al microorganismo, éste emite fluorescencia y se
puede identificar.

1.1.d Microscopio de contraste de fases: es un microscopio óptico modificado

que permite contrastar sustancias de diferente densidad o partículas de distinto
grosor. Mediante un condensador y un objetivo especial, se controla la iluminación
de tal manera que vaya en diferentes direcciones a través de las distintas partes del
objeto que se quiere observar. El resultado es una imagen con diferentes grados de
brillo y oscuridad. Con este método, el material denso aparece brillante, mientras
que las partes con densidad cercana a la del agua aparecen oscuras. Se utiliza para
visualizar estructuras celulares sin necesidad de teñir o matar los microorganismos.

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2. MICROSCOPIO ELECTRONICO

Los microscopios electrónicos utilizan rayos de electrones en lugar de la luz, lo que

les permite tener un poder de resolución muy elevado. La longitud de onda de los
rayos de electrones es de 0,005 a 0,0003 nm, muy corta comparada con la de la luz
visible (426 a 750 nm, violeta a rojo).
Con el microscopio electrónico es posible resolver objetos separados por una
distancia de 0,003 µm, comparado con los 0,25 µm de uno óptico. Los aumentos
pueden llegar a ser de un millón de veces.

A causa de la naturaleza de éste instrumento, sólo pueden examinarse objetos muy

delgados. Incluso una sola bacteria es muy gruesa para ser observada
directamente, por lo que para preparar muestras para el microscopio electrónico, se
requieren técnicas especiales de cortes ultrafinos.
Para seccionar las células, primero deben ser fijadas y deshidratadas (en etanol o
acetona). Después de la deshidratación, la muestra se incluye en una resina y es
aquí donde se realizan los cortes finos, con un ultramicrótomo generalmente
equipado con una cuchilla de diamante.
Una sola célula bacteriana puede cortarse en cinco o seis secciones finas. Si sólo
tiene que observarse el contorno de un microorganismo, se montan las células
enteras y se recubren de una fina capa de un metal pesado (oro). El rayo de
electrones es dirigido sobre la preparación y los electrones dispersados por el metal
pesado activan una pantalla de observación produciendo una imagen.
A la primera técnica se la denomina Microscopía electrónica de transmisión (MET) y
a la segunda Microscopía electrónica de barrido (MEB).

MORFOLOGÍA MICROSCOPICA DE MICROORGANISMOS

Tamaño y formas bacterianas

Las bacterias pueden presentar diversos tamaños y formas, pero existen tres
formas básicas:

- esféricas (cocos)
- bastoncitos o cilíndricas (bacilos)
- helicoidales (espirilos)

Los cocos libres aparecen como células esféricas aisladas. Pero después de la
división celular muchas células bacterianas no se separan totalmente, originando
distintos agrupamientos. Según el plano de división se pueden distinguir: cocos en
pares o diplococos, en cadena o estreptococos, en tétradas, en racimos o
estafilococos, o en cubos o sarcina.
Los bacilos pueden ser muy cortos (cocobacilos) o tener una longitud de 2 a 10
veces su diámetro. Sus extremos pueden ser redondeados, cuadrados o
agudizados.
Los bastones bacterianos curvos pueden ser pequeños microorganismos en forma
de coma (vibrios) o levemente helicoidales en una sola curvatura o espiroquetas
largas y sinuosas.
La mayor parte de las bacterias tienen una longitud media de 1 a 5 μm.
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Técnicas de tinción

La morfología bacteriana se puede observar de dos maneras:

- en estado vivo
- muertas y coloreadas.

Las bacterias en estado vivo son en general incoloras y carentes de suficiente

contraste con el agua en la que se encuentran en suspensión como para ser
claramente vistas.
Por lo tanto se hace necesario el uso de sustancias químicas coloreadas, llamadas
colorantes, que poseen afinidad por algún componente celular, dando su color a las
células.
Al teñir el microorganismo con los colorantes se aumenta el contraste y se hacen
más visibles. En el mercado, el bacteriólogo tiene una amplia gama de colorantes.
La mayoría son sales en los que uno de los iones es coloreado. Por ej: el colorante
simple azul de metileno en realidad es un cloruro que se disocia de la siguiente
manera:

AMC ↔ AM+ + Cl-

El color del colorante está en el ión AM+.

Las bacterias tienen una carga neta negativa cuando el pH que las rodea es
cercano a neutralidad. Las bacterias cargadas negativamente se combinan con el
ión AM+ y la célula aparece coloreada de azul.

Los colorantes se clasifican en:

- básicos o catiónicos si el ión coloreado es el positivo (catión). Estos

colorantes se combinan con intensidad con los constituyentes celulares
cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los
polisacáridos. Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno,
el cristal violeta y la safranina.
- ácidos o aniónicos si el ión coloreado es el negativo (anión). Estos
colorantes se combinan con los constituyentes celulares cargados
positivamente, tales como muchas proteínas. Estos colorantes incluyen la
eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo.

Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles: los colorantes de este

grupo se combinan con los materiales lipídicos de la célula, se usan a menudo para
revelar la localización de gotas o depósitos de grasa. Un ejemplo de colorante
liposoluble es el negro Sudán.
Algunos colorantes tiñen mejor sólo después de que la célula haya sido tratada con
otra sustancia química, que no es un colorante por sí misma. Esta sustancia se
denomina mordiente, un mordiente habitual es el ácido tánico.

Clasificación de las tinciones

De acuerdo con la metodología de la coloración, existen dos tipos de tinciones:

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1) Positivas: cuando lo que se colorea es el microorganismo a observar. Las

tinciones positivas a su vez pueden ser:

a) Simples cuando se utiliza un único colorante para incrementar el contraste

de las células para la microscopía. El azul de metileno es un buen colorante
que actúa sobre todas las células bacterianas rápidamente. Es
especialmente útil para detectar bacterias en muestras naturales, puesto que
la mayor parte del material no celular no se tiñe.

b) Diferenciales cuando se utilizan dos o más colorantes y sirve para

diferenciar a las bacterias entre sí por alguna propiedad en particular, es
decir, que no todas las células se tiñen igualmente. Por ej.: Tinción de Gram,
Tinción de Ácido Resistencia.

c) Estructurales cuando se utilizan dos o más colorantes para poner de

manifiesto una determinada estructura de la bacteria. Por ej.; cápsulas,
esporas, flagelos.

2) Negativas: cuando lo que se colorea es el fondo y queda el microorganismo

sin teñir. Lo que se observa es el perfil de las células.
La sustancia utilizada para la tinción negativa es un material opaco que no
tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las
células, como la tinta china (que es una suspensión de carbono coloidal) o la
nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). Se practica mezclando la
suspensión bacteriana con tinta china o nigrosina, extendiéndola en película
fina sobre el portaobjeto y dejando secar. En la observación aparecen las
bacterias transparentes y perfiladas sobre fondo oscuro.
La ventaja que presenta este procedimiento para el estudio de la morfología
es que las células no reciben tratamiento físico o químico enérgico. Es muy
apropiada para los organismos capsulados. La fijación de la extensión antes
del teñido y la subsiguiente exposición a una serie de reactivos, como se
practica en los demás métodos ocasiona alguna deformación en la célula, lo
que es menos probable que ocurra con el teñido en negativo.

Bibliografía

- Vullo D, Wachsman M, Alche L. 2000. Microbiología en Práctica. Ed. Atlante s.r.l.

Pág. 25 a 32.