INGENIERIA BIOMÉDICA Y TELECOMUNICACIONES. ASIGNATURA BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR.

UPNA

PRÁCTICA 2
PURIFICACIÓN DE ADN GENÓMICO A PARTIR DE BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS.

Para ello utilizaremos el kit

“Genomic DNA PURIFICATION” de
QIAGEN. Diseñado para purificar
directamente DNA cromosómico
de 20-150 kb de tamaño. La
extracción puede realizarse a partir
de distintos tipos de muestras
como son sangre, linfocitos, células
en cultivo, bacterias gran negativas,
bacterias gran positivas etc…

La purificación del ADN en este kit

en concreto está basada en tecnología de adsorción-desorción utilizando membrana de gel de
sílice. El ADN en presencia de sales o iones caotrópicas a altas concentraciones pierden la capa
hidratante de moléculas de agua, creando un entorno hidrofóbico alrededor del ADN. Bajo estas
condiciones el ADN es atraído hacia la membrana de gel de sílice. En esas mismas condiciones
las proteínas no se unen a la membrana y migrarán hacia el fondo de la columna con los pasos
de lavado. Al final el ADN se eluye utilizando soluciones alcalinas con baja concentración de
iones o agua ya que permiten recuperar la capa de agua, liberándolos así de la membrana

En resumen, la tecnología está basado en tres pasos:

1) Una lisis alcalina de las bacterias. El lisado se neutraliza en presencia de una elevada
concentración salina que favorece en siguiente paso;

2) La adsorción del DNA a la membrana de gel de sílice en presencia de una elevada

concentración salina.

3) Lavado y elución del DNA en una solución amortiguadora de baja concentración salina o en
agua destilada. Ello garantiza que sólo se purificará el DNA siendo eliminados el RNA, proteínas
y otros metabolitos.

Con este sistema pueden prepararse de 1 a 24 muestras simultáneamente en menos de 30

minutos; utilizando una microcentrífuga. Cada membrana es capaz de adsorber 20 µg de dsDNA,
con una recuperación del 85–95% (dependiendo del volumen de elución). El DNA que se eluye
en solución amortiguadora Tris o en agua está listo para emplearse en reacciones de restricción
o PCR.

ATENCIÓN: Por norma, deben manipularse todos los reactivos de biología molecular con
guantes. Por dos motivos:

1) Para proteger a la muestra de contaminantes humanos (DNA, RNasa, etc);

2) Para protegernos a nosotros de posibles sustancias tóxicas o entidades infecciosas
(sustancias tóxicas, irritantes, mutágenos, virus, etc)
CARACTERÍSTICAS DE LAS CÉLULAS LÁCTICAS Y CÓMO RECOGER CÉLULAS BACTERINANAS.

1) Las bacterias ácido lácticas (entre ellas la cepa L.plantarum) se caracterizan por ser bacterias
(Gram +) que significa que poseen una pared celular exterior que las recubre muy gruesa de
aproximadamente 20-80 nm de espesor. Debido a esta característica son difíciles de lisar y
requieren de procedimientos específicos (por ejemplo, una lisis mecánica previa) que permitan
inicialmente romper dicha pared celular para luego poder extraer el ADN genómico.

Para ello será necesario:

2).-Centrifugar de 1,5 ml del cultivo de bacterias lactobacillus plantarum a 6.000 g durante 10

para precipitar las células. Eliminar el sobrenadante por decantación.

3) Disolver el pellet de células con 100 ul del Buffer AE del kit (Buffer de elución final).

LISIS CELULAR

3).-Transferir los 100 ul de células bacterianas resuspendidas en Buffer AE a un tubo que

contiene bolitas de cristal de 0.1 mm (nos servirán para romper la pared de las bacterias y liberar
el contenido intracelular por fricción de las bolitas con las bacterias a alta velocidad).

4).-Añadir 10 ul de proteinasa K (para seguir lisando las bacterias, específicamente soltar el ADN
de su unión a proteínas o histonas) y añadir también 40 ul del Buffer AL (Buffer de lisis celular,
que contiene agentes caotrópicos y promueve que el ADN se una posteriormente a la membrana
de sílica).

5).-Poner en el agitador orbital a máxima velocidad durante 12 minutos.

6).-Añadir otros 60 ul de Buffer AE y vortex durante 15 segundos.

7).-Añadir otros 100 ul de Etanol al 96% (para estabilizar la unión del ADN a la membrana de
sílica), vortex durante 15 segundos.

8).-Centrifugar a 11.000 g durante 30 segundos.

UNIÓN DEL ADN:

8).-Unir una columna de sí lica en un tubo de recolección de 2 ml.

9).-Aplicar el sobrenadante del paso anterior (“8”) a la columna, mediante una pipeta.

10).-Centrifugar a 6.000 g (8000 rpm) durante 1 minuto. Eliminar el flujo obtenido en el tubo de
recolección. Nos quedaremos con la columna que ha retenido el ADN.

LAVAR LA MEMBRANA DE SÍLICA:

11).-Lavar la columna añadiendo 500 µl de solución Buffer AW1. Centrifugar a 6.000 g (8000
rpm) durante 1 minuto. Eliminar el flujo obtenido en el tubo de recolección. Y volver a colocar
la columna dentro del tubo de recolección vacío.

12).-Lavar la columna añadiendo 500 µl de solución Buffer AW2. Centrifugar a 6.000 g (8000
rpm) durante 1 minuto. Eliminar el flujo obtenido en el tubo de recolección. Y volver a colocar
la columna dentro del tubo de recolección vacío.
SECAR LA MEMBRANA DE SÍLICA:

11).-Centrifugar de nuevo a 11.000 rpm durante 1 min y eliminar el tubo de recolección. Nota:
Restos del Buffer de lavado con etanol podría inhibir futuras reacciones enzimáticas.

ELUCIÓN DEL ADN

12).-Colocar la columna sobre un tubo limpio de 1,5 ml. Para eluir el DNA plasmídico, añadir 50
µl de Buffer AE al centro de cada columna. Incubar durante 1 min. Nota: es importante añadir
el agua directamente en el centro de la membrana, para asegurar el máximo rendimiento.

13).- Centrifugar a 6.000 g (8000 rpm) durante 1 minuto.

14).-Comprobar la concentración del DNA mediante espectrofotometría a 260 nm y su pureza

mediante la relación 260 nm/280 nm.