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OBJETIVOS
Comparar los métodos de cuantificación de proteínas.
Determinar el rendimiento y pureza de una proteína: Caseína.
Apreciar el uso de las técnicas espectrofotométricas para la cuantificación de material
biológico.
FUNDAMENTO TEÓRICO
Para el estudio de la estructura de una proteína, de la actividad de una enzima o el contenido
proteínico de un alimento, es necesario conocer cuantitativamente la concentración de las
proteínas.
Entre los métodos que se basan en la formación de complejos colorimétricos entre las proteínas
y reactivos específicos se encuentran:
Método de Bradford
Está basado en el cambio de color del colorante azul brillante de Coomassie en respuesta a
diferentes concentraciones de proteínas. Este compuesto interacciona con aminoácidos básicos
(especialmente arginina) y aromáticos. Esta unión del colorante con las proteínas provoca un
cambio en el máximo de absorción del colorante desde 465 a 595 nm. Por lo tanto, este método
se basa en la propiedad del Azul Brillante de Coomasie G-250 de presentarse en dos formas con
colores diferentes, rojo y azul. La forma roja se convierte en azul cuando el colorante se une a la
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proteína. Experimentalmente se mide la diferencia de Absorbancias entre 595 y 465 nm (595-
465nm).
Método de Biuret
La reacción de Biuret es una reacción coloreada (violeta) debida a la formación de un complejo
de Cu, en un medio alcalino, con compuestos que poseen más de un enlace peptídico, como las
proteínas:
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Figura 2. Reacción de Biuret.
La curva de patrón es un método en química analítica empleado para medir la concentración de
una sustancia en una muestra por comparación con una serie de compuestos de concentración
conocida. Se basa en la existencia de una relación en principio lineal entre un carácter medible
(por ejemplo la absorbancia en los enfoques de espectrofotometría) y la variable a determinar
(la concentración). Para ello, se efectúan diluciones de una muestra patrón cuya concentración
es conocida y se registra la lectura del analito presente en cada dilución, estableciendo una
función matemática que relacione las dos variables “concentración vs variable de respuesta”.
Esto se denomina curva de calibración la cual, será útil para determinar la concentración de la
muestra problema.
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MATERIALES Y REACTIVOS
Materiales Reactivos
15 tubos de ensayo Reactivo de Bradford
Micropipetas de 100 y 1000 µL Reactivo de Biuret
Gradilla para tubos de ensayo Reactivo de Lowry
Agitador Vortex Reactivo de Folin-Ciocalteu 1.0 N.
Espectrofotómetro Albúmina sérica bovina (BSA) 10 mg/mL
Agua destilada
NaCl al 1% (p/p)
NaOH 1.0 M
Muestras problema: M1 y M2
PROCEDIMIENTO
1. Método de Bradford
Preparación del reactivo de Bradford
Para 500mL de reactivo de Bradford
Mida 25mL de etanol al 95% (v/v) en una probeta y protéjalo de la luz con papel aluminio
Pese 50 mg de azul de Coomassie G-250
Mida 50 mL de ácido orto fosfórico al 85% (v/v)
Agregue los 50 mg de azul de Coomassie G-250 al etanol lentamente en agitación constante
Preparar una solución inicial del albumina (BSA) de 1mg/mL utilizando agua destilada como
disolvente.
Prepare los patrones de acuerdo a la tabla 1.
Tabla 1. Especificaciones para la preparación de los patrones de BSA
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Preparar el blanco: 1mL de Buffer o H2O y 1 mL de reactivo de Bradford
Pasar el blanco en el espectrofotómetro a 595nm y establecer 0 o línea base
De cada uno de los patrones preparados agregue 50 µL, 950 µL de agua y mezclar con 1 mL
de Bradford, como se muestra en la tabla 2.
2. Método de Biuret
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Prepare los patrones de BSA de acuerdo a la tabla 3.
De cada uno de los patrones preparados en la tabla 3, mezclar 500 µL con 750 µL del
reactivo de Biuret (ver tabla 4). Prepare el blanco mezclando 500 µL de agua (o buffer) con
750 µL del reactivo de Biuret.
Mezcle por inversión, y caliente por 5 minutos a 37 °C o deje actuar por 30 minutos.
Leer la absorbancia a 545 nm del blanco y ajustar a cero.
Leer la absorbancia de cada patrón a la longitud de onda seleccionada.
Construya la curva de calibración: Y=mX+b, donde los datos de concentración de proteína
son los valores de x y los datos de absorbancia corresponden a los valores de y.
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Determine la concentración de M1 y M2 por este método. Si la muestra se encuentra fuera
del rango de la curva estándar, el estudiante realizará diluciones 1:10, 1:100 y 1:1000, de
tal manera que se garantice que la absorbancia de la muestra problema se encuentre dentro
del rango de los datos obtenidos en la curva de calibración.
3. Método de Lowry
Preparación del reactivo de Lowry
La preparación del reactivo de Lowry se debe realizar al momento de utilizarse para garantizar
mejores resultados. Para ello, se deben preparar tres soluciones:
Solución A: carbonato sódico al 2% p/v en NaOH 0.1M y guardar a temperatura ambiente.
Solución B: Sulfato cúprico al 1% p/v y guardar a temperatura ambiente.
Solución C: Tartrato de sodio-potásico al 2% p/v y guardar en el refrigerador.
Concentración
#Patrón mL de BSA (1 mg/mL) mL sln Buffer o H2O mL reactivo Lowry
(mg/mL )
Mezclar por inversión cada tubo y dejar reposar durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Cubrir el tubo con papel aluminio o mantener en la oscuridad.
Agregar a cada tubo 0.5 mL de reactivo de Folin-Ciocalteu 1.0 N.
Mezclar por inversión y dejar en reposo durante 30 minutos en la oscuridad.
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Calibrar el espectrofotómetro a una longitud de onda de 580 nm y ajustar a cero con el
blanco.
Construya la curva de calibración: Y=mX+b, donde los datos de concentración de proteína
son los valores de x y los datos de absorbancia corresponden a los valores de y.
Determine la concentración de M1 y M2 por este método. Si la muestra se encuentra por
fuera del rango de la curva estándar, el estudiante realizará diluciones 1:10, 1:100 y 1:1000,
de tal manera que se garantice que la absorbancia de la muestra problema se encuentre
dentro del rango de los datos obtenidos en la curva de calibración.
Determine el coeficiente de extinción molar para los tres métodos utilizados.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Lehninger A, Nelson DL, Cox M (1997). “Principles of Biochemistry”, Worth Publishers, 2º
edición.
2. D. Voet, JG Voet, CW Pratt. “Fundamentos de Bioquímica”. Editorial Médica Panamericana. 2ª
Ed.Bioquímica, Madrid, 2007.
3. Bradford MM (1976): A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72: 248-
254.
4. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., and Randall, R. J. (1951) Protein measurement
with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, 265-275).
5. Gornall A, Bardawill CJ, David MM (1949). Determination of serum proteins by means of the
biuret reaction. J Biol Chem. 177: 751–766.
6. Determinación de proteínas por el método de Lowry. (Online)
https://acasti.webs.ull.es/docencia/practicas/4.pdf (Consultada el 15 de octubre de 2017).