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Se llevó a cabo la cuantificación de la proteína contenida en una muestra problema por medio de la elaboración de una curva estándar a partir de albúmina sérica bovina (BSA). Se empleó el método de Lowry que consiste en la formación de un color azul dado por iones metálicos en solución reducidos por los grupos fenólicos de los residuos de tirosina presentes en la proteína estudiada. Se midió la absorbancia de las disoluciones en un espectrofotómetro a 750 nm
Título original
Determinación cuantitativa de proteína en muestra problema por medio de métodos espectrofotométricos
Se llevó a cabo la cuantificación de la proteína contenida en una muestra problema por medio de la elaboración de una curva estándar a partir de albúmina sérica bovina (BSA). Se empleó el método de Lowry que consiste en la formación de un color azul dado por iones metálicos en solución reducidos por los grupos fenólicos de los residuos de tirosina presentes en la proteína estudiada. Se midió la absorbancia de las disoluciones en un espectrofotómetro a 750 nm
Se llevó a cabo la cuantificación de la proteína contenida en una muestra problema por medio de la elaboración de una curva estándar a partir de albúmina sérica bovina (BSA). Se empleó el método de Lowry que consiste en la formación de un color azul dado por iones metálicos en solución reducidos por los grupos fenólicos de los residuos de tirosina presentes en la proteína estudiada. Se midió la absorbancia de las disoluciones en un espectrofotómetro a 750 nm
mtodos espectrofotomtricos Bioqumica Experimental Grupo 5 Equipo 5
vila Jaimes Vernica
Becerril Romn Mara del Mar J.
Toro Jaimes Jorge Oswaldo.
Corona Ortega Luis ngel
Romn Resumen Se llev a cabo la cuantificacin de la protena contenida en una muestra problema por medio de la elaboracin de una curva estndar a partir de albmina srica bovina (BSA). Se emple el mtodo de Lowry que consiste en la formacin de un color azul dado por iones metlicos en solucin reducidos por los grupos fenlicos de los residuos de tirosina presentes en la protena estudiada. Se midi la absorbancia de las disoluciones en un espectrofotmetro a 750 nm Introduccin La colorimetra es cualquier anlisis que permita el clculo de una concentracin a partir de la medicin de la absorbancia de un cromforo coloreado, es decir, que absorba en la regin del visible y rena unas caractersticas tales que se pueda aplicar la ley de Lambert-Beer. Una de las colorimetras ms utilizadas en Bioqumica es aquella conocida como mtodo de Lowry. Se basa en que los grupos fenlicos de las tirosinas presentes en las protenas reducen al reactivo de Folin-Ciocalteau (una mezcla de sales de tungstato y molibdato que, en su forma oxidada, es de color amarillo). Adems, se aade cobre para que: a) desdoble a la protena al formar enlaces de coordinacin y b) acelere la reaccin entre los grupos fenlicos (que son oxidados a quinonas) y el reactivo de Folin-Ciocalteau (que al reducirse es de color azul plido). Variables Variables controladas: cantidades de reactivo A y B, longitud de onda empleada (750 nm).
Variable independiente: cantidad de BSA.
Variable dependiente: absorbancia a 750 nm. Hiptesis Si el producto derivado de la reaccin de la BSA con el reactivo de Folin- Ciocalteau cumple con la ley de Lambet-Beer, entonces el valor de la absorbancia ser directamente proporcional a la cantidad de BSA en la muestra. Objetivos Realizar una curva patrn de Albmina Srica Bovina (BSA), utilizando el espectrofotmetro. Determinar la concentracin de protenas en una muestra problema, utilizando los datos de la curva patrn. Materiales y reactivos Material: Celdas de metacrilato grado UV para espectrofotmetro Tubos de microfuga 1 gradilla para tubos de microfuga 1 caja con puntas de 200 L (amarillas) para micropipeta. 1 caja con puntas de 1000 L (azules) para micropipeta. 1 Micropipeta 10 L 1 Micropipeta 20-200 L 1 Micropipeta 200-1000 L Vrtex Espectrofotmetro (por grupo)
Materiales y reactivos Reactivos: Albmina de suero bovino (BSA) a una concentracin de 1 mg/mL. Solucin problema de protenas (los profesores la proporcionarn) Solucin de carbonato-tartrato-cobre (CTC; 10% Na 2 CO 3 , 0.1 % CuSO 4 y 0.2 % de tartrato de Na + y K + ) 10% Dodecilsulfato de sodio (SDS) 0.8 N NaOH Reactivo A. Se prepara inmediatamente antes de usarse con partes iguales de CTC, 10% SDS, 0.8 N NaOH y H 2 Odestilada. Reactivo B. Dilucin del reactivo de Folin- Ciocalteu. 1 volumen de reactivo + 5 volmenes de H 2 O. Guardar en frasco mbar. Preparar preferentemente poco antes de usarse.
Procedimiento Tabla 1. Reactivos y cantidades para realizar la determinacin de protenas utilizando el mtodo de Lowry.
Resultados Tubo HO (L) BSA (1mg/mL) Reactivo A (L) Reactivo B (L) A 750nm 1 450 0 500 250 0 2 445 5 500 250 0.119 3 440 10 500 250 0.13 4 435 15 500 250 0.149 5 430 20 500 250 0.212 6 425 25 500 250 0.322 7 420 30 500 250 0.348 8 415 35 500 250 0.456 Cantidad de protena (g) 9 425 25 500 250 0.203 16.25 10 400 50 500 250 0.277 22.4 Tabla 1.1 Reactivos y cantidades aadidos para realizar la curva patrn de BSA y la determinacin de la concentracin de protenas de una muestra problema, utilizando el mtodo de Lowry. Resultados y = 0.0116x + 0.0744 R = 0.9335 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 0 5 10 15 20 25 30 35 A b s o r b a n c i a
Cantidad de Protena (g) Curva Estndar de BSA Grfica 1.1 Valores de absorbancia de las muestras de BSA en funcin de la cantidad de protena para la construccin de una curva estndar. Resultados Algoritmo de clculo
Discusin
Conclusin Escribe un breve resumen de los descubrimientos en funcin de los resultados de los experimentos. Es necesario indicar si los datos refuerzan la hiptesis y explicar las razones para que lo hagan o no. Obras citadas Badui, S. D.: Qumica de los alimentos 3ed. Alambra Mexicana, Mxico D.F: 2004.188-189 Garca-Segura, Juan Manuel et al. :Tcnicas instrumentales de anlisis en Bioqumica 3reimp. Sntesis, S.A. Madrid, Espaa: 2007. 110-111