PRÁCTICA 1

UEA: Laboratorio integral de

ingeniería bioquímica

Integrantes:

Cenobio Calixto Lizeth Vanessa

Colín Martínez Humberto
Morales Olvera Luis Armando
Ríos Lorenzo Roció

PROFESORA: Anne-Claire Texier

FECHA DE ENTREGA: 20 DE JUNIO

DEL 2019
INTRODUCCIÓN

Para determinar la estructura de una proteína, la actividad enzimática o el contenido

proteico de un alimento, es necesario conocer cuantitativamente la concentración
de éstas, es por ello que se han desarrollado diferentes técnicas basadas en la
formación de complejos coloridos entre proteínas y reactivos específicos (Segal., et
al 2005).

Los azúcares reductores son biomoléculas que funcionan como agentes

reductores; esto es, que pueden donar electrones a otra molécula con la que
reaccionan. En otras palabras, un azúcar reductor es un carbohidrato que contiene
un grupo carbonilo (C=O) en su estructura. Este grupo carbonilo está formado por
un átomo de carbono unido a un átomo de oxígeno a través de un enlace doble.
Este grupo se puede encontrar en distintas posiciones en las moléculas de
azúcares, dando como resultado otros grupos funcionales como aldehídos y
cetonas.

Un método para la determinación de azucares reductores es el conocido como DNS,

haciendo referencia al reactivo utilizado el ácido 3,5-dinitrosalicílico. Este método se
basa en una reacción de óxido reducción cuantificable por técnicas colorimétricas,
el DNS (color amarillo) es reducido por un azúcar reductor produciendo el ácido 3-
amino-5-nitrosalicílico (color rojo), cuya presencia puede detectarse por
espectrofotometría a una longitud de onda que va de los 540nm a los 570 nm
(Chaplin, 1986).

Por otra parte la cuantificación exacta de proteínas es esencial para todos los
experimentos relacionados con proteínas en una multitud de temas de
investigación. Se han desarrollado diferentes métodos para cuantificar proteínas
totales, o alguna en particular.

Los métodos de cuantificación de proteínas totales incluyen métodos tradicionales

tales como la medición de la absorbancia a 280 nm, los ensayos de Bradford, así
como métodos alternativos como el de Lowry o novedosos ensayos desarrollados
por los proveedores comerciales. Los métodos para cuantificar proteínas
individuales incluyen el ELISA, el Western blot y, más recientemente, la
espectrometría de masas, entre otros.

Entre las técnicas cuantitativas más comunes para la determinación de proteínas

solubles se encuentra, la espectrofotometría UV, el método de Lowry, el método de
Biuret y el método de Bradford. El ensayo de Bradford, originalmente descrito por la
Dr. Marion Bradford en 1976, es una de los métodos más populares para la
determinación de la concentración de proteínas y está basado en la diferencia de
coloración del reactivo Coomassie brilliant blue G-250, ya que varea según la
concentración de proteínas solubles, el compuesto interacciona con aminoácidos
básicos, especialmente arginina y aromáticos. El Coomasie G-250 se presenta en
dos formas, cada una con colores diferentes, rojo y azul, la forma roja se convierte
en azul cuando el colorante se une a la proteína provocando un cambio en la
absorción. Experimentalmente se mide la diferencia de Absorbancias entre 595nm
y 465 nm (Bradford, 1976).

Los métodos utilizados en esta práctica serán el método DNS y método de Bradford,
obteniendo así una curva patrón o curva de calibración utilizando disoluciones que
contienen concentraciones conocidas de analito, llamadas disoluciones patrón o
estándar. Los estándares o disoluciones patrón para construir la recta de calibrado
deben ser preparadas en forma independiente, a partir de una o varias soluciones
madre; el número de puntos a escoger dependerá del uso que se dé a la recta de
calibrado.

Una curva de calibración es la representación gráfica de una señal que se mide en

función de la concentración de un analito. La calibración incluye la selección de un
modelo para estimar los parámetros que permitan determinar la linealidad de esa
curva.

La etapa de calibración analítica se realiza mediante un modelo de línea recta que

consiste en encontrar la recta de calibrado que mejor ajuste a una serie de “n”
puntos experimentales, donde cada punto se encuentra definido por una variable
“x” (variable independiente, generalmente concentración del analito de interés) y
una variable “y” (variable dependiente, generalmente respuesta instrumental). La
recta de calibrado se encuentra definida por una ordenada al origen (b) y una
pendiente (m), mediante la ecuación y = mx + b .

A partir de la curva de calibración (conjunto de concentraciones que describen el

intervalo en el cual se deberá cuantificar el compuesto por analizar) y a fin de
asegurar que la recta encontrada con los puntos experimentales se ajuste
correctamente al modelo matemático de la ecuación se calculan los valores de la
ordenada al origen, la pendiente y el coeficiente de determinación (r2). (Dosal, 2008)
OBJETIVO
Que el alumno conozca la técnica para la determinación cuantitativa de azucares
reductores y proteína soluble por método colorimétrico y lo aplique para conocer la
concentración de cada una de ellas en una muestra.

METODOLOGÍA
 Azucares reductores

Disolver 10 g (DNS) en 900 ml

Preparacion del reactivo DNS
de una solución de NaOH 1%.

Aforar a 1000 ml con la

1 g de sulfito de sodio anhidro
misma solución de NaOH 1%.

Aforar a 1000 ml con la Guardar en un frasco ámbar

misma solución de NaOH 1%. en la Oscuridad
 AZUCARES Se preparó 100 ml de una Con la solución anterior,
REDUCTORES solución patrón de glucosa se prepararon por
con una concentración de triplicado curvas patrón
Método DNS 1.0 g/L (Tabla A1)

Transcurrido el Posteriormente se
Se les agregó 1ml de
tiempo se enfriaron colocaron en un baño de
reactivo DSC a cada
en agua corriente agua en ebullición
tubo y se agito
durante 5mim

Y se les agregaron Se leyó la densidad óptica en

8ml de agua cada tubo a 575nm, con el
destilada a cada espectrofotómetro
tubo y se volvió previamente calibrado con el
agitar blanco

Tabla A1” Elaboración de curva patrón de azúcares reductores”

Tubo Volumen de la Volumen de agua Concentración de

solución patrón (mL) glucosa (mg/L)
(mL)
1 0.0 1.0 0

2 0.1 0.9 100

3 0.2 0.8 200
4 0.3 0.7 300
5 0.4 0.6 400
6 0.5 0.5 500
7 0.6 0.4 600
8 0.7 0.3 700
9 0.8 0.2 800
10 0.9 0.1 900
11 1.0 0.0 1000
  Proteínas solubles: método de Bradford

Proteínas solubles
Método de Bradford

Se preparó 100ml de
solución patrón de
albumina de huevo
(100mg/L)
Con la solución
anterior se preparó Se adiciono a cada
por triplicado la curva uno de los tubos 0.2
patrón de proteínas ml del reactivo de
solubles (Tabla A2) Bradford

Se leerán los datos a Se dejara reposar los La mezcla se

595nm, con el tubos a temperatura homogenizo con
espectrofotómetro ambiente durante ayuda del vortex
previamente calibrado 5mim
con el blanco

La muestra problema a analizar

(0.8ml), se someterá al mismo
tratamiento que la curva patrón.
Si el valor de DO supera el valor
más alto de la curva patrón,
deberá repetirse la determinación
haciendo una dilución de la
muestra
 Tabla 2. ” Elaboración de curva patrón de proteína soluble”
Tubo Volumen de la Volumen de agua Concentración de
solución patrón (µL) albúmina (mg/L)
(µL)
1 0.0 800 0

2 20 780 2
3 40 760 4
4 60 740 6
5 80 720 8
6 100 700 10
7 120 680 12
8 140 660 14
9 160 640 16
10 180 620 18
11 200 600 20
 RESULTADOS
Los cálculos y gráficos se realizaron utilizando el software Excel contenido en el
paquete Microsoft office 2016, el cual sigue el algoritmo:
Absorbancia promedio (Densidad óptica)
∑𝑛1 𝐷𝑂𝑛
𝑋̅ =
𝑛
Desviación estándar

∑𝑛(𝐷𝑂𝑛 − 𝑥̅ )2
𝑆=√ 1
𝑛−1

Porciento del Coeficiente de variación

𝑆 ∗ 100
𝐶𝑉% =
𝑥̅
Dónde: DO es la densidad óptica (absorbancia) de cada muestra y n es el número
de muestras.
Azucares reductores
Una vez realizado el procedimiento descrito anteriormente, se obtuvo la
absorbancia (DO) de cada muestra y con ello se calculó para cada dilución el
promedio de densidad óptica, desviación estándar y porciento de coeficiente de
variación. (Tabla 1):

CONCENTRACIÓN ABSORBANCIA PROMEDIO DE DESVIACION C. V. (%)

(mg/L) 1 2 3 ABSORBANCIA ESTANDAR
0 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
100 0.0780 0.0700 0.0760 0.0747 0.0042 5.5759
200 0.0980 0.0940 0.0950 0.0957 0.0021 2.1760
300 0.1300 0.1450 0.1390 0.1380 0.0075 5.4709
400 0.1560 0.1450 0.1420 0.1477 0.0074 4.9917
500 0.1690 0.1520 0.1560 0.1590 0.0089 5.5901
600 0.1770 0.1920 0.1980 0.1890 0.0108 5.7231
700 0.2300 0.2110 0.2210 0.2207 0.0095 4.3071
800 0.2680 0.2860 0.2960 0.2833 0.0142 5.0080
900 0.3170 0.2990 0.2860 0.3007 0.0156 5.1775
1000 0.3380 0.3790 0.3380 0.3517 0.0237 6.7312
Tabla1. Absorbancia (DO) de los estándares de glucosa tratadas pon el método DNS,
absorbancia promedio, desviación estándar y porciento de variación (CV%).
Utilizando los datos de absorbancia promedio, se realizó una regresión lineal
tomando a la absorbancia como variable respuesta (dependiente) y concentración
como variable explicativa (independiente), obteniendo la estimación de los
coeficientes regresión (Grafica 1):

Curva patrón de glucosa por el método DNS

0.4000

0.3500
y = 0.0003x + 0.0222
R² = 0.9711
0.3000

0.2500
Absorbancia

0.2000

0.1500

0.1000

0.0500

0.0000
0 200 400 600 800 1000 1200
Concentración de glucosa (mg/L)

Grafica1. Grafico del comportamiento de la absorbancia en función de la concentración de

glucosa y representación de la ecuación estimada para el método DNS.

De acuerdo a la Grafica 1 se puede decir que la relación entre densidad óptica y

concentración se explica según la siguiente ecuación (Ecuación 1):
𝒍 𝒎𝒈
𝑨𝒃𝒔𝒐𝒓𝒃𝒂𝒏𝒄𝒊𝒂 = 𝟎. 𝟎𝟎𝟎𝟑 (𝒎𝒈) ∗ 𝒄𝒐𝒏𝒄𝒆𝒏𝒕𝒓𝒂𝒄𝒊𝒐𝒏( ) + 𝟎. 𝟎𝟐𝟐𝟐 Ecuación 1
𝒍
 Proteína Soluble.
De igual manera al procedimiento anterior, después de obtener la absorbancia (DO)
de cada estándar proteico, se calculó para cada dilución el promedio de densidad
óptica, desviación estándar y porciento de coeficiente de variación. (Tabla 2):

CONCENTRACIÓN ABSORBANCIA PROMEDIO DE DESVIACION C. V. (%)

(mg/L) 1 2 3 ABSORBANCIA ESTANDAR
0 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
2 0.0380 0.0350 0.0370 0.0367 0.0015 4.1660
4 0.0570 0.0500 0.0540 0.0537 0.0035 6.5439
6 0.0780 0.0710 0.0750 0.0747 0.0035 4.7034
8 0.1280 0.1300 0.1270 0.1283 0.0015 1.1903
10 0.1790 0.1710 0.1770 0.1757 0.0042 2.3700
12 0.2050 0.1870 0.1890 0.1937 0.0099 5.0942
14 0.2020 0.2030 0.2000 0.2017 0.0015 0.7575
16 0.2270 0.2170 0.2120 0.2187 0.0076 3.4928
18 0.2460 0.2510 0.2560 0.2510 0.0050 1.9920
20 0.3240 0.3040 0.2960 0.3080 0.0144 4.6825

Tabla R1. Absorbancia de los estándares de proteína tratadas con el método de Bradford,
promedio de su absorbancia (DO), desviación estándar y porciento de imprecisión (CV%).

Al realizar el ajuste lineal se obtuvo la estimación de los coeficientes regresión

(Grafica 2):

Curva patrón de proteína por método de Bradford

0.3500
0.3000 y = 0.0146x + 0.0033
0.2500
Absorbancia

R² = 0.978
0.2000
0.1500
0.1000
0.0500
0.0000
0 5 10 15 20 25
Concentación de proteína (mg/L)

Grafica 2. Grafico del comportamiento de la absorbancia en función de la concentración de la

proteína, y representación de la ecuación estimada para el método de Bradford.
A partir de la Grafica 2 se puede decir que la relación entre densidad óptica y
concentración se explica según la siguiente ecuación (Ecuación 2):
𝒍 𝒎𝒈
𝑨𝒃𝒔𝒐𝒓𝒃𝒂𝒏𝒄𝒊𝒂 = 𝟎. 𝟎𝟏𝟒𝟔 (𝒎𝒈) ∗ 𝒄𝒐𝒏𝒄𝒆𝒏𝒕𝒓𝒂𝒄𝒊𝒐𝒏( ) + 𝟎. 𝟎𝟎𝟑𝟑 Ecuación 2
𝒍
ANÁLISIS DE RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Encontrar desviaciones estándares pequeñas en los resultados de ambos métodos;
nos indica que son reproducibles, y que presentan un margen de error mínimo.
Mismo que lo avala el porcentaje de coeficiente de variación, que en la mayoría de
los resultantes fueron menores al 5%. El margen de error presente en cada método
es derivado por a) número de pasos del método, b) interacción de reactivos con
biomoléculas de no interés, c) calibrado del equipo, d) manipulación del equipo, e)
factores externos (temperatura ambiental, presión atmosférica, porcentaje de
humedad, etc).
En el caso del método DNS para azucares reductores, en el grafico absorbancia vs
concentración los datos presentan un comportamiento lineal como lo confirma el
coeficiente de determinación del grafico r2 =0,9711. Esto nos permitió que a través
de la ecuación de la recta encontrar una expresión para calcular concentraciones
de muestra de glucosa, las cuales presenten una absorbancia menor a 0.3517
𝒍 𝒎𝒈
𝑨𝒃𝒔𝒐𝒓𝒃𝒂𝒏𝒄𝒊𝒂 = 𝟎. 𝟎𝟎𝟎𝟑 ( ) ∗ 𝒄𝒐𝒏𝒄𝒆𝒏𝒕𝒓𝒂𝒄𝒊𝒐𝒏( ) + 𝟎. 𝟎𝟐𝟐𝟐
𝒎𝒈 𝒍
Para el caso del método de Bradford para proteínas, en el grafico absorbancia vs
concentración los datos presentan un comportamiento lineal como lo confirma el
coeficiente de determinación del grafico r2 =0,9780. Esto nos permitió que a través
de la ecuación de la recta encontrar una expresión para calcular concentraciones
de muestra de albumina, las cuales presenten una absorbancia menor a 0.3080
𝒍 𝒎𝒈
𝑨𝒃𝒔𝒐𝒓𝒃𝒂𝒏𝒄𝒊𝒂 = 𝟎. 𝟎𝟏𝟒𝟔 ( ) ∗ 𝒄𝒐𝒏𝒄𝒆𝒏𝒕𝒓𝒂𝒄𝒊ó𝒏 ( ) + 𝟎. 𝟎𝟎𝟑𝟑
𝒎𝒈 𝒍
Es de destacar, que algo que se pudo observar en ambos métodos, a
concentraciones altas de los estándares los datos pasan de un comportamiento
lineal a exponencial y el margen de error aumenta. Por lo cual, en el análisis
cuantitativo de muestras ya sea de glucosa o proteína, esta se debe someter a
dilución.

CONCLUSIÓN.
A través de esta práctica se pudo observar la importancia de los métodos analíticos
colorimétricos para la cuantificación de biomoléculas como son carbohidratos
(azucares reductores) y proteínas presentes en muestras biológicas, a través de la
estandarización de una curva patrón. Si bien estos métodos muestran cierto grado
de error producto a diversos factores ya señalados en la discusión. Este error no es
suficiente para no hacerlos confiables, así que siempre estarán presentes en el
mundo del análisis cuantitativo por su facticidad en tiempo y economía
respectivamente a otros métodos.
CUESTIONARIO
1.¿Cuál es el fundamento de la determinación de azucares reductores por el
método DNS? ¿Cuál es la reacción que se lleva a cabo entre los reactivos y
el azúcar reductor?
El método DNS determina la presencia de grupos carbonilo libres (C=O) de los
azucares reductores. El procedimiento se basa en una reacción equimolar redox,
que ocurre en la utilización de ácido 3,5-dinitrosalicílico para provocar la oxidación
de los azucares y al mismo tiempo su propia reducción endotérmica a 3-amino-5-
nitrosalicílico. La reacción es de tipo colorimétrica, donde el ácido 3.5 dinitrosalicílico
es de color amarillo, mientras que la aparición de ácido 3-amino, 5-nitrosalicílico
provoca un viraje a rojo-marrón, cuya intensidad es proporcional a la concentración
de azucares reductores, cuya determinación se realiza a través de lecturas de
absorbancia en el espectrofotómetro en un rango de 540 - 575 nm.

2.-Explique en que consiste la ley de Lambert y Beer y por qué se debe leer
la densidad óptica en un intervalo de transmitancia menor a 1.

Ley de Lambert: Establece que cuando pasa luz monocromática por un medio
homogéneo, la disminución de la intensidad del haz de luz incidente es proporcional
al espesor del medio, lo que equivale a decir que la intensidad de la luz transmitida
disminuye exponencialmente al aumentar aritméticamente el espesor del medio
absorbente.

Ley de Beer: La intensidad de un haz de luz monocromática disminuye

exponencialmente al aumentar aritméticamente la concentración de la sustancia
absorbente, cuando este haz pasa a través de un medio homogéneo.
Ley de Lambert – Beer: la absorbancia está relacionada linealmente con la
concentración de la especie absorbente (c) y con la longitud de la trayectoria (b) de
la radiación con el medio absorbente.

A = log Po / P = - log T=abc

Donde:
A = absorbancia
Po/P = T = transmitancia
a = absortividad
b = paso óptico
c = concentración

Para contestar la segunda parte es necesario definir absorbancia y transmitancia.

Absorbancia se define como la cantidad de energía radiante absorbida por una
sustancia pura o en solución. Matemáticamente, corresponde al logaritmo negativo
de la transmitancia (T). La transmitancia es la razón entre la luz monocromática
transmitida (P) por una muestra y la energía o luz incidente (Po) sobre ella. Los
valores de transmitancia pueden ir de 0 a 1, cero si no pasa nada de luz y uno si
pasa toda la luz. Ante esta relación, y ya que lo que mide el espectrofotómetro es la
transmitancia, es por eso que se debe leer la DO en un intervalo de transmitancia
menor a 1.

3.- ¿Cuáles son los fundamentos de los métodos de Lowry y de Bradford para
la determinación de proteínas? ¿Cuál es la reacción que se lleva a cabo entre
los reactivos y las proteínas en ambos métodos?

El método de Lowry es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de las

proteínas, el cual consta de dos etapas 1) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se
unen a las proteínas formando complejos con los átomos de nitrógeno de los
enlaces peptídicos. Estos complejos Cu2+-proteína tienen un color azul claro.
Además, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína,
exponiéndose los residuos fenólicos de tirosina que van a participar en la segunda
etapa de la reacción. El Cu2+ se mantiene en solución alcalina en forma de su
complejo con tartrato. 2) La reducción, también en medio básico, del reactivo de
Folin-Ciocalteau, por los grupos fenólicos de los residuos de tirosina, presentes en
la mayoría de las proteínas, actuando el cobre como catalizador. El principal
constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el ácido fosfomolibdotúngstico, de
color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenolicos da lugar a un complejo
de color azul intenso, el cual absorbe luz a 750 nm.

El método de Bradford se basa en la unión específica del colorante azul de

Coomassie brillante G250 (CBBG) a los residuos de Arg, Trp, Tyr, His y Phe de las
proteínas, produciendo una absorbancia máxima a 595 nm.
4.- Diga cuales son las limitantes de las técnicas de Lowry y de Bradford y que
compuestos químicos interfieren con ellas.

En el caso del método de Lowry, las ventajas de este ensayo son su sensibilidad, y
lo más importante, su exactitud. Sin embargo, dentro de sus desventajas
encontramos que requiere de más tiempo que otros ensayos, y muchos compuestos
comúnmente utilizados en búferes de preparación de proteínas (tales como
detergentes, carbohidratos, glicerol, tricina, EDTA, Tris) interfieren con el ensayo
formando precipitados. No obstante, el efecto de estas substancias puede ser
reducido diluyendo la muestra, pero sólo si la concentración de proteínas es lo
suficientemente alta. Además, se ha demostrado que el tiempo para realizar este
ensayo puede reducirse al aumentar la temperatura.

En el caso del método de Bradford las ventajas de este método se encuentran su

compatibilidad con agentes reductores utilizados para estabilizar las proteínas en
solución, los cuales no son compatibles con el ensayo de Lowry. Mientras que su
desventaja radica en su incompatibilidad con detergentes, los cuales se utilizan de
rutina para solubilizar proteínas de membrana. Sólo un nivel de detergente no iónico
muy bajo, tal como Triton X-100 a una concentración final de 0,008 % (v/v), puede
mejorar la sensibilidad y variabilidad del ensayo. Los detergentes pueden ser
eliminados por cromatografía de exclusión molecular o por diálisis, lo que lleva a la
dilución de la muestra; o por precipitación con fosfato de calcio o acetona, ambos
métodos que permiten recuperar como mucho el 70 % de la cantidad inicial de
proteína.

REFERENCIAS
 Bradford MM (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of
protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry
72: 248- 254.
 Chaplin MF (1986) Monosaccharides. En Chaplin MF, Kennedy JF (eds.):
“Carbohydrate Analysis: A Practical Approach”. IRL Press (Oxford, England)
pp. 1-36. Descripción muy simple pero bastante completa de los principales
métodos de análisis de monosacáridos. adford, M.M. (1976) Analytical
Biochem. 72, 248-254.
 Segal Kischinivzky, Claudia., Ortega Lule, Gustavo., y Rodarte Muirguía,
Beatriz. (2005). Manual de prácticas de biología molecular de la célula I.
México: Pubdisa.
 Dosal, Maria Antonia. (2008). Introducción a la metrología química: curvas
de calibración en los métodos analíticos. Recuperado el 04 de Febrero de
2018 de:
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/CURVASDECALIBRACION_234
98.pdf