MÉTODOS PARA LA DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS EN MUESTRAS BIOLÓGICAS

Nicole Sofia Ocola Peñaloza, Fiorela Adriana Rueda Anchante, Mayela Lujan Ojeda Cosi,
Gustavo Adrian Calcina Machado.

Universidad Católica de Santa María, Escuela Profesional de Ingeniería Biotecnológica,

Facultad de Ciencias Farmacéuticas, Bioquímicas y Biotecnológicas.

1. FUNDAMENTO:

Algo importante sobre los métodos para la determinación de proteínas en muestras biológicas
es comprender los principios detrás de la interacción entre las proteínas y los reactivos
utilizados en estos métodos.

Cuando se trata de métodos de cuantificación de proteínas, es fundamental tener en cuenta

que las proteínas son moléculas biológicas complejas con una variedad de estructuras y
propiedades físico-químicas. Sin embargo, existen ciertos grupos funcionales comunes en
todas las proteínas que pueden ser explotados en los métodos de análisis. Uno de estos grupos
es el grupo amino (-NH2), presente en los residuos de aminoácidos que componen las
proteínas.

La mayoría de los métodos de cuantificación de proteínas se basan en la capacidad de los

grupos amino de las proteínas para reaccionar con ciertos reactivos, produciendo un cambio
detectable que se puede medir y correlacionar con la cantidad de proteínas presentes en la
muestra.

Entender este principio fundamental de interacción entre las proteínas y los reactivos
utilizados en los métodos de cuantificación es crucial para comprender cómo funcionan estos
métodos y cómo interpretar los resultados obtenidos. Además, permite a los investigadores
seleccionar el método más apropiado para sus muestras específicas y comprender las
limitaciones y consideraciones asociadas con cada método (1).

2. MÉTODOS

Método de Bradford

Principio

El método de Bradford se basa en la capacidad de las proteínas para unirse al azul de

Coomassie brillante en una solución ácida. Cuando las proteínas se unen al azul de
Coomassie, hay un cambio en el color del azul de Coomassie, lo que resulta en un cambio en
la absorbancia de la solución. La cantidad de cambio de absorbancia es proporcional a la
cantidad de proteínas presentes en la muestra.

Pasos del procedimiento:

1. Preparación de las muestras: Las muestras biológicas que se van a analizar deben ser
diluidas en un tampón compatible con el ensayo, como tampón de Tris-HCl.

2. Preparación de la curva estándar: Se preparan soluciones estándar de proteínas con

concentraciones conocidas. Estas soluciones se mezclan con el azul de Coomassie y se
utilizan para construir una curva estándar de absorbancia versus concentración de proteínas.

3. Preparación de las muestras y estándares para la reacción: Se añaden alícuotas de las

muestras y estándares a tubos de ensayo o placas de microtitulación.

4. Adición del reactivo de Bradford: Se añade una cantidad medida del reactivo de Bradford a
cada muestra y estándar. El reactivo de Bradford puede ser una solución de azul de
Coomassie brillante en ácido sulfúrico concentrado.

5. Mezcla e incubación: Las muestras y los estándares se mezclan bien con el reactivo de
Bradford y se incuban durante un período de tiempo específico, generalmente de 5 a 10
minutos.

6. Medición de la absorbancia: Después de la incubación, se mide la absorbancia de cada

muestra y estándar a una longitud de onda específica, generalmente alrededor de 595 nm,
utilizando un espectrofotómetro.

7. Construcción de la curva estándar y cuantificación de las muestras: Se utiliza la curva

estándar para calcular la concentración de proteínas en las muestras, utilizando la absorbancia
medida y la ecuación de la línea de regresión obtenida a partir de la curva estándar (2).

Método de Lowry

Principio

El método de Lowry se basa en la reacción de los grupos amino de las proteínas con el
reactivo de Folin-Ciocalteu en presencia de un agente reductor (como el tartrato de sodio y
potasio) y el carbonato de sodio. Esta reacción produce un complejo de color que puede ser
medido espectrofotométricamente. La intensidad del color formado es proporcional a la
cantidad de proteínas presentes en la muestra.

Pasos del procedimiento

1. Preparación de las muestras: Las muestras biológicas que se van a analizar deben ser
diluidas en un tampón compatible con el ensayo, como tampón de fosfato.

2. Preparación de las soluciones reactivas: Se preparan las soluciones del reactivo de

Folin-Ciocalteu y del agente reductor, generalmente en álcali y se mantienen en condiciones
adecuadas para estabilidad.

3. Preparación de la curva estándar: Se preparan soluciones estándar de proteínas con

concentraciones conocidas. Estas soluciones se mezclan con el reactivo y el agente reductor
para producir el complejo de color.

4. Preparación de las muestras y estándares para la reacción: Se añaden alícuotas de las

muestras y estándares a tubos de ensayo o placas de microtitulación.

5. Adición de las soluciones reactivas: Se añaden alícuotas de las soluciones reactivas de

Folin-Ciocalteu y del agente reductor a cada muestra y estándar.

6. Incubación: Las muestras y los estándares se incuban durante un período de tiempo

específico, generalmente de 10 a 30 minutos, para permitir que se produzca la reacción y se
forme el complejo de color.

7. Medición de la absorbancia: Después de la incubación, se mide la absorbancia de cada

muestra y estándar a una longitud de onda específica, generalmente entre 500 y 750 nm,
utilizando un espectrofotómetro.

8. Construcción de la curva estándar y cuantificación de las muestras: Se utiliza la curva

estándar para calcular la concentración de proteínas en las muestras, utilizando la absorbancia
medida y la ecuación de la línea de regresión obtenida a partir de la curva estándar.

El método de Lowry es ampliamente utilizado debido a su sensibilidad y precisión en la

cuantificación de proteínas, especialmente en muestras que contienen concentraciones bajas
de proteínas o en muestras con matrices complejas (3).

Método de Biuret:

Principio:

En este proceso, las proteínas de la muest͏ra interactúan con el͏reactivo de Biuret en un

entorno básico creando un ͏compuest͏o col͏oreado. La intensidad del color producido ͏está
relacionada con la cantidad de proteína ͏y pue͏de analizarse mediante espectrofotómetro.

Reacción con Cu͏(II): Las pro͏t͏eína͏s tienen enla͏ces͏peptídicos que interact͏úan con el ͏io͏n
cúprico (Cu^2+) en ͏un ͏reactivo de Biuret. E͏ste reactivo ͏provoca la creación de un compuesto
azul-violeta entre proteínas y cobre en cond͏iciones básicas.
Cuantificación del Complejo: La formación del complejo proteína-cobre resulta en un
cambio de color en la muestra, que es proporcional a la concentración de proteínas presentes.
Este cambio de color puede ser cuantificado espectrofotométricamente a una longitud de
onda específica, generalmente alrededor de 540 nm.

Procedimiento:

1.- Preparación de la Muestra: La muestra que contiene proteínas se diluye o se ajusta a

una concentración adecuada para la medición. Es importante que la muestra esté en un medio
acuoso y que no contenga sustancias que puedan interferir con la reacción de Biuret.

2.- Preparación del Reactivo de Biuret: El reactivo de Biuret se prepara mezclando

soluciones acuosas de sulfato cúprico y tartrato de potasio con hidróxido de sodio (NaOH).
La solución resultante es alcalina y contiene iones Cu(II) listos para reaccionar con las
proteínas presentes en la muestra.

3.- Mezcla de Muestra y Reactivo: Se agrega una cierta cantidad de la muestra a una
cantidad conocida de reactivo de Biuret. La mezcla se agita adecuadamente para asegurar una
reacción completa entre las proteínas y el reactivo.

4.- Incubación: La mezcla de muestra y reactivo se incuban durante un período de tiempo

específico, generalmente entre 10 y 30 minutos, a temperatura ambiente o a una temperatura
específica según el protocolo utilizado.

5.- Medición Espectrofotométrica: Después de la incubación, se mide la absorbancia de la

muestra a una longitud de onda específica (generalmente alrededor de 540 nm) utilizando un
espectrofotómetro. La absorbancia medida está directamente relacionada con la
concentración de proteínas presentes en la muestra.

6.- Construcción de una curva de calibración: Para determinar la concentración de

proteínas en la muestra desconocida, se utiliza una curva de calibración construida con
estándares de proteínas de concentración conocida. La absorbancia de los estándares se mide
y se traza en función de su concentración conocida. La concentración de proteínas en la
muestra se determina interpolando su absorbancia en la curva de calibración.

7.- Cálculo de la Concentración de Proteínas: Utilizando la relación entre la absorbancia y

la concentración de proteínas establecida por la curva de calibración, se calcula la
concentración de proteínas en la muestra desconocida.
Cromatografía:

Principios:

Fase Estacionaria: La fase estacionaria es un material inmóvil que puede ser sólido o
líquido, recubierto sobre un soporte sólido. Los componentes de la muestra interactúan de
manera diferente con esta fase estacionaria según sus afinidades químicas, lo que resulta en
una separación de los componentes en la mezcla.

Fase Móvil: La fase móvil es un líquido o gas que se mueve a través de la fase estacionaria,
arrastrando consigo los componentes de la muestra. La velocidad de migración de los
componentes depende de sus interacciones con la fase estacionaria y la fase móvil.

Interacciones Moleculares: La separación se basa en las diferentes afinidades de los

componentes de la muestra por la fase estacionaria y la fase móvil. Las interacciones
moleculares como la adsorción, partición, intercambio iónico, tamaño molecular, entre otras,
influyen en la distribución de los componentes y, por lo tanto, en su separación.
La cromatografía se puede utilizar para separar y cuantificar proteínas en una muestra. La
cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) separa las proteínas según su tamaño
molecular, mientras que la cromatografía de afinidad utiliza ligandos específicos para
capturar proteínas diana. La cromatografía de intercambio iónico (IEX) separa las proteínas
según su carga superficial.

Cromatografía y Concentración de Proteínas Totales:

Cromatografía de Exclusión por Tamaño (SEC): En la SEC, las proteínas se separan
según su tamaño molecular. Este método puede utilizarse para evaluar la concentración de
proteínas totales al medir la cantidad de proteínas que eluyen de la columna cromatográfica.
La intensidad de la señal detectada (por ejemplo, absorbancia UV) puede correlacionarse con
la concentración de proteínas en la muestra.

Cromatografía de Intercambio Iónico (IEX): En la IEX, las proteínas se separan según su

carga superficial. Este método puede utilizarse para la concentración de proteínas totales si se
mide la concentración de proteínas en el flujo de elución después de lavar la columna. La
intensidad de la señal detectada se correlaciona con la concentración de proteínas.

Cromatografía de Afinidad: Algunos tipos de cromatografía de afinidad utilizan matrices

que se unen específicamente a proteínas. Después de la elución, la concentración de proteínas
se puede determinar mediante métodos como la medición de la absorbancia o mediante
ensayos de detección específica.

Cromatografía y Evaluación de Proteínas Específicas:

Cromatografía de Afinidad: La cromatografía de afinidad puede utilizarse específicamente
para purificar proteínas específicas de una mezcla compleja. Los ligandos unidos a la matriz
de la columna tienen afinidad por la proteína de interés, lo que permite su captura selectiva.
La elución posterior permite recuperar la proteína específica purificada.

Cromatografía de Intercambio Iónico (IEX): La IEX puede utilizarse para separar

proteínas específicas basadas en sus cargas superficiales. Los cambios en las condiciones de
elución, como el gradiente de sal, pueden permitir la elución selectiva de proteínas
específicas.

Cromatografía de Afinidad de Anticuerpos (IAC): Este método implica la inmovilización

de un anticuerpo específico en una matriz de columna. Las proteínas de interés en la muestra
se unen al anticuerpo, mientras que otras proteínas se lavan. Luego, las proteínas específicas
se eluyen selectivamente de la columna.

Cromatografía de Inmunoprecipitación (IP): Similar a la IAC, la IP utiliza anticuerpos

para capturar proteínas específicas de una mezcla compleja. Después de la captura, las
proteínas se pueden eluir y analizar

Procedimiento:
1. Preparación de la Muestra:Si es necesario, la muestra se prepara según el protocolo
específico. Esto puede incluir la extracción de proteínas de células, tejidos u otros materiales
biológicos.Se puede llevar a cabo un proceso de purificación previo si se requiere separar la
proteína de interés de otras proteínas o contaminantes.

2. Elección de la Cromatografía y Preparación de la Columna:Se elige el tipo específico

de cromatografía adecuada para la muestra y el objetivo del análisis (por ejemplo,
cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de afinidad, etc.).
Se prepara la columna cromatográfica de acuerdo con el protocolo específico de la técnica
elegida. Esto incluye cargar la fase estacionaria apropiada y empacarla uniformemente en la
columna.

3. Equilibración de la columna:La columna se equilibra con un buffer o solvente adecuado

para asegurar condiciones estables antes de cargar la muestra. Esto puede implicar el uso de
una bomba de cromatografía para pasar el buffer a través de la columna.

4. Carga de la Muestra:La muestra se carga en la columna cromatográfica utilizando un

inyector o una jeringa según el método utilizado. La cantidad de muestra cargada se ajusta
según la sensibilidad del método de detección y la concentración esperada de proteínas en la
muestra.

5. Elución:Se inicia el flujo de la fase móvil a través de la columna cromatográfica. La fase

móvil arrastra los componentes de la muestra a diferentes velocidades según sus interacciones
con la fase estacionaria.
Se puede aplicar un gradiente de elución para separar los componentes de la muestra en
diferentes fracciones.Las proteínas eluidas se recogen en tubos de recolección en función del
tiempo o del volumen de elución.

6. Detección y Análisis:Se detectan los componentes de interés eluidos de la columna

utilizando un detector adecuado. Esto puede implicar la medición de la absorbancia UV, la
fluorescencia, la conductividad, o la detección de masa, según el tipo de cromatografía
utilizada.Se analizan los datos obtenidos del detector para identificar y cuantificar los
componentes de la muestra. Esto puede implicar la comparación con patrones de referencia o
la integración de picos.

7. Interpretación de Resultados:Los resultados se interpretan teniendo en cuenta los

objetivos del análisis y las características de los componentes separados.Se pueden realizar
cálculos adicionales para determinar la concentración de proteínas totales o específicas en la
muestra, si es necesario.

Método del Ácido Bicinconínico:

Principios:
Basado en el ácido bicinconínico (BCA) para la detección y cuantificación colorimétrica de
proteínas totales, este método combina la reducción del Cu+2 a Cu+1 en medio alcalino
(reacción de Biuret) con la detección selectiva del catión Cu+1 utilizando el ácido
bicinconínico.
Es un compuesto capaz de formar un complejo púrpura intenso con iones Cu1 +. Este
reactivo forma la base de un método analítico capaz de monitorizar el ión cuproso producido
en una reacción entre las proteínas con Cu2 + en medio alcalino (reacción de Biuret). La
estabilidad del reactivo y el cromóforo proporciona un método para la cuantificación de
proteínas que es sencillo, rápido, muy sensible, y que muestra una gran tolerancia a
compuestos que afectan a otros métodos.

Procedimiento:

1. Preparación de reactivos: Se preparan las soluciones de trabajo del reactivo BCA, que
contienen ácido bicinconínico, sulfato cúprico y otros agentes estabilizadores.

2. Preparación de muestras: Las muestras que contienen proteínas se diluyen si es necesario

para que la concentración de proteínas se encuentre dentro del rango de detección del
método.

3. Preparación de blancos: Se prepara un blanco que contiene agua destilada o una solución
de tampón similar a la de las muestras, pero sin proteínas.

4. Mezcla de reactivos y muestras: Se añaden volúmenes específicos de reactivo BCA a las

muestras, el blanco y los estándares de proteínas (si se utilizan).

5. Incubación: Las mezclas se incuban a una temperatura específica (generalmente a

temperatura ambiente) durante un tiempo determinado (usualmente 30 minutos) para permitir
que se desarrolle el color.

6. Lectura de absorbancia: Se mide la absorbancia de la luz a 562 nm de cada mezcla en un

espectrofotómetro.

7. Cálculo de concentración de proteínas: Se utiliza una curva estándar de proteínas para

relacionar la absorbancia medida con la concentración de proteínas en las muestras.

Absorción ultravioleta (UV):

Principios:

La absorción ultravioleta (AU) es un fenómeno físico en el que la radiación electromagnética

de longitud de onda ultravioleta (UV) es absorbida por átomos o moléculas. Esta absorción
ocurre cuando la energía de los fotones UV coincide con la energía de transición entre
estados electrónicos de los átomos o moléculas.
 Procedimiento:
1. Preparación de la muestra: La muestra se disuelve en un disolvente adecuado y se
coloca en una cubeta.
2. Medición de la absorbancia: Se mide la absorbancia de la solución a una longitud de
onda específica utilizando un espectrofotómetro UV-Vis. La absorbancia es el
logaritmo de la relación entre la intensidad de la luz incidente y la intensidad de la luz
transmitida.
3. Cálculo de la concentración: La concentración del compuesto se calcula utilizando
la ley de Beer-Lambert, que establece que la absorbancia es directamente
proporcional a la concentración del absorbente y a la longitud del camino óptico.

3. VENTAJAS Y DESVENTAJAS:

Ventajas:

Método de Bradford:
● Sensible: Puede detectar pequeñas cantidades de proteínas.
● Rápido: Se puede completar en menos de una hora.
● Simple: Requiere pocos reactivos y pasos.
● Versátil: Se puede usar para cuantificar una variedad de proteínas.
● Compatible con detergentes: Se puede usar para cuantificar proteínas en soluciones que
contienen detergentes.
Método de Lowry:
● Altamente sensible: Puede detectar cantidades muy pequeñas de proteínas.
● Específico: Es específico para proteínas y no reacciona con otros compuestos.
● Lineal: La absorbancia es lineal con la concentración de proteínas.
● Compatible con una amplia gama de proteínas: Se puede usar para cuantificar una
variedad de proteínas.
Método de Biuret:
● Simple: Requiere pocos reactivos y pasos.
● Rápido: Se puede completar en menos de 30 minutos.
● Sensible: Puede detectar cantidades moderadas de proteínas.
● Barato: Los reactivos son económicos.
Cromatografía:
● Alta resolución: Puede separar proteínas con pesos moleculares muy similares.
● Puede usarse para purificar proteínas: Las proteínas individuales se pueden eluir de la
columna en fracciones separadas.
● Versátil: Se puede usar para separar proteínas en función de una variedad de propiedades,
como el tamaño, la carga y la afinidad por los ligandos.
● Puede usarse para analizar mezclas complejas de proteínas: Se puede identificar y
cuantificar las proteínas individuales en una mezcla.
Método del ácido bicinconínico (BCA):
● Sensible: Puede detectar pequeñas cantidades de proteínas.
● Específico: Es específico para proteínas y no reacciona con otros compuestos.
 ● Lineal: La absorbancia es lineal con la concentración de proteínas.
● Compatible con una amplia gama de proteínas: Se puede usar para cuantificar una
variedad de proteínas.
● Compatible con detergentes: Se puede usar para cuantificar proteínas en soluciones que
contienen detergentes.
Absorción ultravioleta (UV):
● Rápido: Se puede completar en cuestión de minutos.
● Simple: Requiere poco equipo y reactivos.
● No destructivo: La muestra no se altera durante la medición.
● Sensible: Puede detectar cantidades moderadas de proteínas.
● Puede usarse para cuantificar proteínas puras o en mezclas: La absorbancia a 280 nm es
proporcional a la concentración de triptófano y tirosina, dos aminoácidos que se encuentran
en la mayoría de las proteínas.

Desventajas:

Método de Bradford :

➢ El reactivo de Bradford también puede reaccionar con otros compuestos que no sean
proteínas, como detergentes o ácidos nucleicos, lo que puede producir resultados
falsos.
➢ El método de Bradford no es tan sensible como otros métodos de determinación de
proteínas, como el método de Lowry o el método de Biuret.
➢ Algunos colorantes, como el azul de Coomassie R-250, pueden interferir con la
reacción de Bradford, lo que puede producir resultados falsos.
➢ El método Bradford tiene un rango de trabajo limitado, y solo funciona bien para
muestras con concentraciones de proteínas entre 10 y 100 μg/mL.

Método de Lowry:

➢ El método de Lowry puede reaccionar con otros compuestos que no sean proteínas,
como carbohidratos , lo que puede dar resultados falsos.
➢ El método de Lowry es más complejo que el método de Bradford y requiere más
pasos y reactivos.
➢ El método Lowry es menos específico para proteínas que el método Bradford, y puede
reaccionar con otros compuestos que contienen grupos aromáticos o aminoácidos.

Método de Biuret:

➢ El método Biuret no es adecuado para proteínas que contienen grupos aminoácidos

básicos, como la lisina o la arginina, ya que estos grupos pueden reaccionar con el
colorante Biuret y dar lugar a resultados inexactos.
➢ Algunos detergentes pueden interferir con la reacción de Biuret, lo que puede
producir resultados falsos.
 ➢ El método de Biuret no es tan sensible a algunas proteínas como el método de
Bradford o el método de Lowry.

Cromatografía:

➢ La cromatografía puede ser un método lento, especialmente para separar grandes

cantidades de proteínas.
➢ La cromatografía requiere equipo especializado, como columnas cromatográficas y
detectores, que pueden ser costosos.
➢ La optimización de las condiciones cromatográficas para una proteína específica
puede ser difícil y requiere experiencia.

Método del Ácido Bicinconínico:

➢ El método BCA no es adecuado para proteínas que contienen grupos reductores, ya

que estos grupos pueden reaccionar con el colorante BCA y dar lugar a resultados
inexactos.
➢ El método BCA es sensible a la presencia de ciertos metales, como el cobre o el
hierro, que pueden interferir con la reacción y dar lugar a resultados inexactos.
➢ Los reactivos para el método BCA pueden ser costosos.

4. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

1. Walker, J. M. (2009). The protein protocols handbook (3rd ed.). Humana

Press.
2. Bradford, M. M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.
Analytical Biochemistry, 72(1-2), 248-254.
3. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., & Randall, R. J. (1951). Protein
measurement with the Folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry,
193(1), 265-275.
4. Bal, B. C. (Ed.). (2011). M Thode Du Biuret. Cede Publishing.

5. Dabrio, M. V. (1999). Cromatografia y electroforesis en columna. Springer

Iberica.