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PRÁCTICA No.

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CUANTIFICACIÓN PROTEICA POR EL MÉTODO DE BRADFORD
INTRODUCCIÓN

En trabajos de bioquímica y de alimentos, frecuentemente es necesaria la determinación de la


concentración de proteínas. Para tal objetivo existen diversos métodos y para la elección de uno de
ellos habrá que tener en cuenta lo siguiente:

 La cantidad total de proteína disponible


 La concentración de la solución
 La presencia de compuestos que interfieran en el ensayo
 La rapidez con la que se necesita el resultado

En 1972, Folin y Ciocalteau pusieron a punto un reactivo que lleva su nombre y que fue la base del
método descrito después de Lowry en 1951. En el primer paso se forma el complejo de Biuret, dando la
reducción de Cu2+ del complejo, para obtener Cu+ y enlaces peptídicos oxidados. En el segundo paso, el
Cu+ reduce el reactivo de Folin-Ciocalteau, dando lugar a varios compuestos de color azul que se
detectan a una longitud de onda de 750nm. El componente activo de este reactivo es el ácido mixto
fosfomolibdotúngstico. La reducción de este reactivo se manifiesta por la pérdida de uno, dos o tres
átomos de oxígeno del tungstato y del molibdato, obteniéndose las especies de color azul. Además de
la reacción del complejo Biuret formado en la primera etapa, también contribuyen a la reducción del
reactivo las cadenas laterales de algunos aminoácidos (Tyr, Trp y en menor medida Cys-Cys, y Cys-His).
La susceptibilidad a la composición aminoacídica de las proteínas es una desventaja del método,
además algunos agentes reductores utilizados en las preparaciones de las proteínas (-mercaptoetanol,
ditiotreitol, EDTA) interfieren en el ensayo. El procedimiento de Lowry esta sujeto a la interferencia por
compuestos como el ión potasio, magnesio, EDTA, Tris, reactivos con grupos tiol y carbohidratos. Otros
métodos para cuantificar la cantidad proteica es el método de Biuret, que es sensible a todos los
anteriores compuestos además de amonio y glicerol. Un procedimiento que elimina los problemas que
los dos métodos anteriores, además del tiempo del proceso, es el método de Bradford, que esta
basado en las propiedades químicas del principal compuesto, que es el azul brillante de Coomassie G-
250, y el cual forma un complejo colorido azul al unirse a las proteínas y rojo en su forma libre. El
complejo tiene un alto coeficiente de extinción molar y que se forma rápidamente (2 min) y que es
estable por 1 h, lo cual provoca que no exista un tiempo crítico en el ensayo.

OBJETIVO
Que el alumno analice y aplique el fundamento de la técnica de la determinación cuantitativa de
proteínas Bradford, además de cuantificar la cantidad de proteína en un extracto crudo y se familiarice
con la elaboración de una curva patrón.

MATERIALES 1 Espectrofotómetro Biomate 3


14 Tubos de ensaye 2 Celdas de acrilico
1 Gradilla para tubos 1 Palangana
1 Probeta de 100 mL REACTIVOS
2 Matraz aforado de 50 mL NaCl
2 Vasos de precipitados de 100 mL Reactivo de Bradford
1 Micropipeta de 1000 y 200L, Albumina de Huevo
1 Piceta con agua destilada Agua destilada
1 Vortex Alumnos
1 Agitador magnético Seta (equipo 1 y 2)
1 Mortero con pistilo Champiñon (equipo 3 y 4)
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES

A. 500 mL de solución de NaCl 0.15 M


B. Preparación de 50 mL de solución estándar de Seroalbumina de huevo (SAB) a 1 mg/ mL en NaCl
0.15 M
C. Tomar un ejemplar del hongo y macerarlo con 20 mL de NaCl 0.15 M y aforarlo a 50 mL con la
misma solución.

PROCEDIMIENTO:

Adicionar al tubo 1, 800µL de solución patrón SAB y 800 µL de NaCl 0.15 M, agitar y tomar de este tubo
800µL y adicionarlo al tubo 2, al cual se le adicionaran 800 µL de NaCl 0.15 M, agitar. Efectuar este
proceso hasta el tubo número 11 del cual se desecharan 800µL. Por otro lado tomar 800µL de la
solución de hongos y efectuar 2 diluciones más.

Tubo Sol. albumina (µL) NaCl 0.15M (µL) Vol. Total (µL) Albumina
[mg/mL]
0 0 800 800
1 800 800 800
2 800 800 800
3 800 800 800
4 800 800 800
5 800 800 800
6 800 800 800
7 800 800 800
8 800 800 800
9 800 800 800
10 800 800 800
11 800 800 800

Una vez efectuadas las diluciones, se adicionan 200µL de Reactivo de Bradford a todos los tubos y
después de 10 minutos. Tomar el tubo No 6 y mediante la comparación de un blanco (tubo 0), efectuar
un barrido espectrofotométrico desde una longitud de 400 a 700 nm. Posteriormente tomar la lectura
de la absorbancia de cada uno de los 11 tubos en la longitud, de onda de 595 nm, previamente
ajustando el espectrofotómetro con el blanco preparado con solución de NaCl (tubo 0). Después tomar
la absorbancia de las soluciones de hongos, previamente con el tratamiento del Reactivo de Bradford a
595 nm.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
o Reportar una tabla con los datos de las absorbancias, el promedio, la desviación estándar y el % de
error grupal. Graficar los promedios de la absorbancia contra la concentración y calcular por
regresión lineal el coeficiente de correlación, la pendiente y la ordenada al origen de la recta del
equipo y grupal. Calcule además por intrapolación la concentración proteica en mg/L y en mg/g
hongo de las soluciones de hongos.
CUESTIONARIO

1. Investigue la estructura química del principal componente del reactivo de Bradford


2. Analizando la estructura química, ¿Cuál sería el fundamento de la reacción de Bradford?
3. Enliste que reactivos son compatibles con el reactivo de Bradford
4. Efectúe una tabla de la comparación de la sensibilidad del método de Lowry, Biuret y Bradford al
cuantificar una serie de proteínas.

BIBLIOGRAFÍA

Bradford M. M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of
protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72: 248-254.

Bio-Rad Protein assay: Guide Bio-Rad assay. 2005, USA.