UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA EN ACUICULTURA

“PRUEBA DE PCR EN MUESTRA DE ARTROPODO”

DOCENTE:
Oscar Garcia Minalla

CURSO:
Biología Molecular

ALUMNO:
Anhuamán Laureano David

CICLO:
III

NUEVO CHIMBOTE
PERÚ 2023
 INTRODUCCIÓN

A tres décadas de su aparición, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus

siglas en inglés) es una de las herramientas tecnológicas más innovadoras para el
estudio de los ácidos nucleicos. Se caracteriza por ser una técnica de alta sensibilidad,
reproducibilidad y eficiencia, que genera resultados confiables en poco tiempo y fáciles
de analizar. Por ello, se ha convertido en el método de elección de muchos
investigadores para los estudios genéticos y de biología molecular. En esta revisión
nuestro objetivo es introducir al lector a los fundamentos de la reacción en cadena de la
polimerasa, así como a la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real; dos
técnicas que parten de un principio similar, pero que son metodológicamente diferentes;
la primera genera resultados cualitativos mientras la segunda cuantitativos.

Uno de los descubrimientos más importantes de la historia que marcó el inicio de una
nueva era en el estudio y conocimiento de los ácidos nucleicos fue el de Watson y
Crick, al descifrar la estructura del ADN (ácido desoxirribonucleico). Desde entonces,
varios grupos han mostrado un gran interés por desarrollar métodos sensibles y
reproducibles que les permitan estandarizar protocolos experimentales para estudiar los
ácidos nucleicos. Es así como han ido apareciendo diferentes tecnologías cuyos
protocolos están dirigidos al estudio del ADN; probablemente, la más importante sea la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés), desarrollada por
Kary Mullis y que revolucionó la biología molecular y la forma en cómo se estudiaban
los ácidos nucleicos en ese momento.

Actualmente sabemos que la misión de la PCR es copiar millones de veces una

secuencia específica de ADN blanco mediante una poderosa catálisis llevada a cabo por
una enzima conocida como ADN polimerasa, de tal manera que cantidades pequeñas de
ADN pueden ser sintetizadas y copiadas fielmente para analizarse con diferentes fines.
El desarrollo de esta técnica permitió estudiar y manipular mejor al ADN, facilitando el
establecimiento de protocolos experimentales en biología molecular. El progreso de esta
técnica ha sido muy notable y ha ido en paralelo con los nuevos retos para estudiar y
comprender mejor el rol de los genes, tanto en condiciones fisiológicas como
patológicas. Es por ello que una de las formas recientes para detectar y cuantificar a los
ácidos nucleicos es a través de la PCR en tiempo real, la cual es una modalidad de la
PCR considerada como una técnica cuantitativa.

La reacción en cadena de la polimerasa es una reacción enzimática in vitro que

amplifica millones de veces una secuencia específica de ADN durante varios ciclos
repetidos en los que la secuencia blanco es copiada fielmente. Para ello, la reacción
aprovecha la actividad de la enzima ADN polimerasa que tiene la capacidad de
sintetizar naturalmente el ADN en las células. En la reacción, si usamos como sustrato
ADN genómico, entonces típicamente hablamos de una PCR, pero si usamos ADN
complementario (ADNc) proveniente del ARNm (ácido ribonucleico mensajero) se le
conoce como RT-PCR (Reverse Transcription-PCR, por sus siglas en inglés). Esta
conversión se logra mediante una reacción conocida como transcripción reversa y
controlada por la enzima transcriptasa reversa, capaz de convertir el ARNm en una
molécula de ADNc. Este método fue copiado de los retro virus que usan una
transcriptasa reversa para convertir su genoma de ARN en ADN duplicarse en millones
de partículas virales. El ADNc se utiliza cuando analizamos la expresión del ARNm de
algún gen de interés.

Los elementos importantes en la reacción son el templado o molde (ADN o ADNc), la

enzima, los oligonucleótidos o primers, los desoxirribonucleótidos trifosfatados
(dNTPs: adenina, timina, citosina y guanina), el ión magnesio (Mg +), una solución
amortiguadora o buffer y H2O. Todos estos elementos interactúan en tres etapas
principales de las que se compone la PCR: desnaturalización, hibridación y extensión.

Hoy en día, la PCR se aplica en diferentes áreas de las ciencias biológicas y de la salud,
formando parte del quehacer científico de muchos laboratorios de investigación que la
utilizan principalmente para expresión génica, genotificación, detección de patógenos y
análisis de mutaciones. En esta revisión se hace una descripción de los fundamentos de
la PCR convencional o también conocida como punto final; además se explica qué se
necesita para que la reacción sea exitosa, cómo se lleva a cabo y cómo se analizan los
resultados.
2. PRUEBA DE PCR EN MUESTRA DE ARTROPODO

2.1. MATERIALES Y MÉTODOS

 Tubos
 Micro pipetas
 Puntas de micro pipeta (Tips)
 Gradilla para tubos de PCR
 Muestras de ADN de
Macrobrachium (1 μL por tubo)
 Agitador vórtex (eppendorf)
 Termociclador (Applied
Biosystems Veriti Dx)
 Foto documentador (UVITEC
HD6)
 Parafilm
 Agarosa 1%
 Fuente de poder (Cleaver
Scientific - CS 300V)
 Cámara de electroforesis
 Cabina de gases (BIOBASE)

Reactivos 5x 1x
H2O 50,8 μL 10,16 μL
Buffer Taq 10x 7,5 μL 1,5 μL
Cloruro de magnesio (25 μM) 5,7 μL 1,14 μL
dNTPs (2,5 μM) 3,75 μL 0,75 μL
Primer 1472 F (So) (50 μM) 0,75 μL 0,15 μL
Primer 1471 R (So) (50 μM) 0,75 μL 0,15 μL
Taq Polimerasa 0,75 μL 0,15 μL
Cantidad total 70 μL 14 μL

2.2. FUNCION DE MATERIALES:

 El BUFFER nos servirá como amortiguador de pH que afecta la

concentración de los iones de hidrógeno.
 Los dNTP’s son las bases que se unirán a una hebra para hacer replicación.
 Los primers son secuencias de oligonucleótidos que flanquean y delimitan
la secuencia blanco que se desea amplificar y son complementarios a ésta.
 TAq ADN Polimerasa es la enzima más usada que proviene de una bacteria
termófila llamada Thermus aquaticus,capacidad, la cual vive en condiciones
de temperatura muy altas y por eso su ADN polimerasa es capaz de soportar
ese tipo de temperaturas manteniendo su funcionalidad a temperaturas altas,
por lo que se le considera una enzima termoestable.
  CEBADORES: Pequeña molécula de RNA, complementaria a una de las
hebras del DNA molde, que sintetiza la primasa durante el proceso de
replicación del DNA de E. coli.
 VORTEX: Es un equipo de laboratorio que agita las muestras.
 TERMOCICLADOR: Aparato de laboratorio que se utiliza para amplificar
segmentos de ADN a través de la reacción en cadena de la polimerasa.
 AGAROSA: Es un polisacárido formado por galactosas alfa y beta que se
extrae de las algas de los géneros Gellidium y Gracillar.
 El MgCl2 actúa como catalizador en la reacción de PCR, la enzima necesaria
para replicar el ADN necesita del magnesio para funcionar.

2.3. Procedimiento de reacción de la mezcla.

Como paso inicial se sometió a rayos UV los tubos donde se añadirían las
muestras a utilizar. Posteriormente para preaprar la mezcla, los reactivos
utilizados se colocarán dentro de la cámara de gases uitilizando una
micropipeta intercambiando tips para cada reactivo utilizado. Se vertió en un
tubo 50,8 μL de agua y 7,5 μL de Buffer Taq, dándole una apariencia espesa,
así mismo se agregó 5,7 μL de cloruro de magnesio (25 μM), 3,75 μL de
dNTPs (2,5 μM), 0,75 μL de Primer 1472 F (50 μM), así como 0,75 μL de
Primer 1471 R (50 μM) para el gen 16s y 0,75 μL de Taq Polimerasa, la cual
estuvo refrigerada hasta el momento de usarla. Posteriormente el tubo se pasó a
homogenizar en el agitador vórtex (eppendorf), luego la mezcla obtenida
distribuyo en cuatro tubos (14 μL para cada uno) y finalmente a un quinto tubo
se vertió solo 1 μL de agua, ya que fue el blanco, posicionándolos en la gradilla
para facilitar el protocolo. Por otro lado, se retiró la muestra de ADN de la
especie Macrobrachium que se encontraba refrigerada a -20°C, se extrajo 1 μL
de este y se vertió en cada uno de los cuatro tubos que contenían la mezcla de
reactivos. Posteriormente se verificó que no existiera la formación de burbujas
y se llevó nuevamente los tubos al agitador vórtex (eppendorf) por 15
segundos, para homogenizar la mezcla.
 2.4. Ampliación del ADN
Introducimos los tubos dentro de la placa del termociclador (Applied
Biosystems Veriti Dx) y programándolo con los parámetros de amplificación
necesarias, permitiendo que las reacciones corran a una temperatura de 94°C
por tres minutos donde ocurriría la desnaturalización del ADN, siendo 35
ciclos de 95°C por treinta segundos, 40°C por 25 segundos y 72°C por 25
segundos para la replicación del ADN, finalmente una extensión de 72°C por
siente minutos, y luego se mantuvo a 4°C (elongación). Todo este proceso duró
una hora y media.

2.5. Electroforesis y cuantificación

Transcurrido el tiempo programado se preparó el gel de agarosa al 1% para
determinar el tamaño del amplificado y la efectividad de la PCR, con la ayuda
de una micro pipeta y un tip se agregó a una lámina extensible de parafina las
muestras de los cinco tubos para que corran en la cámara de electroforesis, se
conectaron los electrodos a la fuente de poder (Cleaver Scientific - CS 300V) a
noventa de voltaje, cien de corriente, durante 30 a 45 minutos. Después de este
proceso se capturó la imagen del gel mediante un fotodocumentador (UVITEC
HD6), donde se observó la integridad y amplificación de las bandas de ADN,
comparándolas con un Ladder determinado para determinar el tamaño y
concentraciones más exactas.

3. RESULTADOS

Figura 1: Resultados de la amplificación por PCR del Gen 16S de ADN de

Macrobrachium en gel de agarosa. Datos obtenidos del fotodocumentador (UVITEC
 HD6)
 Los resultados de acuerdo al gel de agarosa con respecto a la amplificación del ADN
de Macrobrachium, presentados en la figura 1, demostraron una banda limpia y sin
contaminantes, se usó un ladder de 10 000 pares de bases para comparar y determinar
el tamaño de amplificación de la muestra, en la primera banda se reveló una
coloración bien definida y marcada, se encontró dentro de los 3 000 pares de bases,
para la segunda banda se indicó una cantidad de 1 000 pares de bases y en la tercera
banda se encontró dentro del rango de 500 pares de bases. La última muestra es el
blanco debido a eso no hay nada, ya que solo contenía agua, se logró observar solo
una banda, demostrándonos que no existe contaminación alguna en los reactivos ni
del agua utilizada, a partir de ello podemos deducir la efectividad e integridad de los
resultados de la amplificación de las otras muestras. En general la banda de
amplificación de las cuatro muestras de Macrobrachium se encontró entre los 1000 y
500, es decir aproximadamente de 600 – 650 pares de bases.

4. DISCUSIÓN:

 Bolivar, Rojas y García (2013) en su artículo exponen que diversos estudios de PCR
han demostrado que la calidad y fidelidad de la técnica se ve afectada por sus tres
componentes principales: la mezcla de reacción, el régimen de ciclos y la ADN
polimerasa. Lograr un equilibrio entre estos parámetros es crucial al planificar una
metodología. En el caso de la mezcla de reacción, los reactivos, concentración,
selección y cantidad se vieron estrechamente relacionados con el resultado final de
nuestro trabajo, el cual se mostró limpio y sin contaminantes, para ello se usó 50,8
μL de agua y 7,5 μL de Taq, 5,7 μL de cloruro de magnesio (25 μM), 3,75 μL de
dNTPs (2,5 μM), 0,75 μL de Primer 1472 F (50 μM), así como 0,75 μL de Primer
1471 R (50 μM) y 0,75 μL de Taq Polimerasa. Rodríguez y Barrera (2004)
mencionan que variaciones en la concentración dNTPs afectan especificidad y
fidelidad, en altas concentraciones pueden reducir la actividad de la enzima e incluso
inhibirla. Asimismo, que los dNTPs pueden captar iones de magnesio, por lo tanto,
las concentraciones de ambos deben estar relacionadas.
 Por otra parte, Sint, Raso y Traugott (2014) indican que el cloruro de magnesio en
concentraciones insuficientes da lugar a bajo rendimiento mientras que el exceso
tiende a producir amplificaciones inespecíficas. Además, hace mención que los
primers son el componente más sensible que determina el éxito de un ensayo y que lo
ideal es que deben carecer de estructuras secundarias, así como de
complementariedad entre sí, para evitar la creación de dímeros, de igual forma deben
estar relacionados con el gen de interés. En el caso de nuestro trabajo se determinó
primers para el gen 16S, específicamente del ADN de la especie Macrobrachium, la
cual se extrajo y conservó en el laboratorio de Genética de la Universidad Nacional
Del Santa. Rodríguez y Barrera (2004) aluden que el agua es usada como solvente y
requiere al menos que sea desionizada y purificada. En el caso de nuestra muestra el
agua fue previamente UVeada para eliminar agentes contaminantes y que la mezcla
de reactivos de un resultado positivo.

 En cuanto a régimen de ciclos el termociclador (Applied Biosystems Veriti Dx) se

programó adecuadamente, en donde las reacciones corrieron a una temperatura de
94°C por tres minutos, 35 ciclos de 95°C por treinta segundos, 40°C por veinticinco
segundos y 72°C por veinticinco segundos, posteriormente una extensión final de
72°C por siente minutos, y luego se mantuvo a 4°C, este proceso tuvo una duración
de hora y media. Espinosa, L. (2007) alude que la desnaturalización, alineamiento y
extensión son tres pasos esenciales a seguir y repetir por cada ciclo de la PCR. La
fase de desnaturalización es de suma importancia, para que comience la síntesis de
una nueva cadena complementaria, es crucial que el ADN molde esté completamente
desnaturalizado, esto se consigue mediante la exposición a temperaturas de 94ºC
durante un mínimo de un minuto. Es importante señalar que la actividad de la enzima
disminuye rápidamente por encima de los 95ºC. Es por ello que es habitual comenzar
con un período de 5 minutos a 94 ºC para garantizar la desnaturalización completa de
toda la molécula de ADN. Por otro lado, el alineamiento específico de ambos primers
se produce a una temperatura determinada por composición de bases y oscila entre
40 y 70°C. Un aumento favorece la especificidad, ya que disminuye uniones
incorrectas de los primers con sitios apócrifos del ADN molde, por último, la
extensión debe realizarse a una temperatura alta, coincidente con la máxima
actividad de la enzima para evitar alineamientos inespecíficos. El tiempo depende del
 tamaño de la amplificación, es común que al finalizar todos los ciclos se realice un
último alargamiento por 5 min. a 72ºC para asegurarse que todos los productos de
amplificación estén terminados y presenten la misma longitud.

 En la Figura 1, se detallan los resultados del gel de agarosa sobre la amplificación

del ADN de Macrobrachium. Se utilizó un ladder de 10.000 pares de bases como
referencia para determinar el tamaño de amplificación de las muestras. La primera
marcó dentro de los 3000 pb. La segunda banda 1000 pb y la tercera 500 pb. La
última muestra, fue el blanco, ya que contenía solo agua. De tal modo, que la banda
de amplificación para las cuatro muestras de Macrobrachium fue de
aproximadamente 600 a 650 pares de bases. En la tesis presentada por Andrés
Ramírez (2019), se presenta el número de muestras de ADN genómico de M.
americanum amplificadas mediante PCR. Las secuencias limpias y alineadas del 16S
rADN tuvieron una longitud de 506 pb y las secuencias de COI ADNmt tuvieron una
longitud de 681 pb. La amplificación de regiones específicas del ADN, como el gen
mitocondrial COI (Citocromo c Oxidasa I), ha permitido discriminar de manera
confiable entre diferentes especies de camarones de agua dulce. Esto es de gran
importancia para la taxonomía y la conservación de la biodiversidad, ya que algunas
especies de Macrobrachium están en peligro de extinción o son de importancia
económica.
5. CONCLUSIONES
 Los retos que se presentan día a día en la investigación biomédica nos abren la
posibilidad de conocer nuevas herramientas tecnológicas para afrontarlos
experimentalmente. Es por eso que la PCR es una de esas herramientas que se ha
desarrollado para ofrecer una alternativa para el estudio de los ácidos nucleicos.

 Tal fue su impacto en la comunidad científica que hoy en día es una técnica que
se usa a diario en muchos laboratorios y que se incrementó cuando apareció la
modalidad de PCR en tiempo real, permitiendo el establecimiento y la aplicación
de nuevos protocolos experimentales más precisos que generan resultados
confiables y reproducibles. Por todo ello, difundir los fundamentos de la PCR es
un primer paso para conocer una de varias herramientas tecnológicas con las que
se cuenta para el estudio de los ácidos nucleicos.
 La PCR es un método importante en biología molecular que ha transformado la
investigación y el diagnóstico en varios campos. Su alta sensibilidad,
especificidad y versatilidad lo convierten en una herramienta invaluable para la
detección, amplificación y análisis de ADN. A pesar de sus limitaciones, la PCR
sigue siendo una técnica fundamental en la investigación y la medicina, y su
continuo desarrollo promete interesantes aplicaciones futuras.
6. ANEXOS:

7.

RECOMENDACIONES
 Cerciorar los Primers a utilizar de manera adecuada. Deben adaptarse a la región
específica que requiere amplificación y no deben contener ninguna
complementariedad interna ni formar dímeros de cebadores.
 Mantener la integridad de los resultados es imperativo en la investigación. Una
forma de garantizar la integridad de las muestras de ADN, es fundamental
trabajar en un entorno libre de contaminantes. Una forma de evitar la
contaminación cruzada entre muestras de ADN es utilizar tubos y pipetas
desechables. Esto evitará que el ADN residual contamine las muestras. Además,
es importante manipular las muestras con guantes y utilizar una estación de
trabajo dedicada para la amplificación de ADN.
 Para detectar posibles contaminaciones o impurezas que podrían producir
resultados positivos erróneos, se debe incorporar un control negativo a la mezcla
de reacción en la que no se añade ADN molde.

 Para mantener la integridad de las muestras de ADN, se recomienda

almacenarlas a temperaturas más bajas, como -20 °C. También es importante
evitar exponer las muestras a ciclos repetidos de congelación y descongelación.

 Una vez finalizado el proceso de PCR, es fundamental validar los productos

amplificados mediante métodos de análisis como electroforesis en gel. Para
determinar el tamaño de los fragmentos amplificados
8. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Khan Academy. (2023). Khanacademy.org. https://es.khanacademy.org/science/ap-

biology/gene-expression-and-regulation/biotechnology/a/polymerase-chain-

reaction-pcr

‌Tamay de Dios L,* Ibarra C,** Velasquillo C*. (n.d.).

https://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2013/ir132d.pdf

‌Introducción a la PCR | Redes de tecnología. (2021). News-Courier.com.

http://www.news-courier.com/genomics/articles/an-introduction-to-pcr-345445