UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA MÉTODOS FÍSICO-QUÍMICOS EN BIOTECNOLOGÍA PCR ALUMNOS: CORTAZAR MARTÍNEZ ADRIANA

SILVA RINCÓN ELSA PATRICIA JUNIO, 2004

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ÍNDICE Introducción Historia y Desarrollo Metodología básica Componentes de la reacción Nucleótidos Primers Especificidad Secuencias complementarias Contenido de G/C Secuencia de los extremos 3’ Temperatura de asociación Cálculo de la temperatura de fusión (Tm) Programas de Diseño de Primers Templado Polimerasa Concentración de Magnesio Otros componentes de la reacción Parámetros de la reacción Desnaturalización Alineamiento Extensión Número de ciclos Termocicladores Identificación de los productos de PCR RT PCR PCR en tiempo real Técnicas de detección SYBR greenTM Hydrolysis probes Hairpin probes (Molecular BeaconsTM) Hybridization probes Scorpions Cuantificación Genes estándares El efecto de limitar los reactivos PCR competitivos cuantitativos Máquinas para PCR en tiempo real Ventajas del tiempo Real Primers Degenerados Uso de los primers degenerados Diseño de los primers degenerados Alineación de la secuencia Información de la secuencia terminal de aminoácidos Degeneración de primers 1 2 4 4 4 5 6 6 6 6 6 7 7 8 8 9 9 9 10 10 11 11 12 13 15 16 17 17 18 18 19 20 21 24 24 25 26 27 28 28 29 29 29 29

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La reacción de PCR El cóct el de PCR Los ciclos de PCR (el termociclador) Problemas comunes Secuenciación Controles Long PCR Aspectos Generales Programa genérico para Long PCR para el Perkin Elmer 9600 Hot Start PCR in situ Principios y Métodos Otras variantes de la PCR Multiplex PCR Nested PCR Clonación de productos de PCR Clonación TA Clonación de extremos romos Clonación direccional a través de primers modificados. Clonación de fragmentos largos de DNA Mutagénesis por PCR Mutagénesis con PCR-extensión solapada Mutagénesis sitio dirigida Aplicaciones especiales de la PCR Bibliografía

29 29 29 30 30 30 30 31 32 32 32 32 33 33 34 34 35 36 36 37 37 37 38 39 40

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INTRODUCCIÓN La biotecnología, en un sentido amplio se puede definir como la aplicación de organismos, componentes o sistemas biológicos para la obtención de bienes y servicios. La Ingeniería Genética (I.G.), conocida como tecnología del ADN recombinante in vitro, se caracteriza por su capacidad de cortar y empalmar genes o fragmentos de ADN de organismos distintos, creando nuevas combinaciones no existentes en la Naturaleza, combinaciones que ponemos a trabajar en el interior de una variedad de organismos hospederos, para nuestro provecho. No cabe ninguna duda de que la técnica más revolucionaria de los últimos 15 años ha sido la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que ha dado nuevas alas a la propia Ingeniería genética y a toda la biología molecular. Fue inventada por Kary Mullis a mediados de los años 80. Muchas de las técnicas clásicas de la Ingeniería genética estaban encaminadas a resolver el complejo problema de cómo clonar o localizar un gen o un segmento de ADN. Sin embargo, esas técnicas son a menudo largas y tediosas, y no es raro que no den resultados. La PCR ha venido a cambiar el panorama, ya que permite en principio producir in vitro grandes cantidades de una secuencia de ADN concreta sin recurrir a la clonación en un organismo huésped. Esencialmente la técnica permite la amplificación selectiva de cualquier segmento de ADN, conociendo las secuencias que lo flanquean. Como alguien ha dicho, "es una técnica que consigue encontrar la aguja en el pajar, al tiempo que produce un pajar de agujas por amplificación selectiva". Las aplicaciones de la PCR y de sus numerosas variantes son prácticamente ilimitadas:
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simplifica muchos experimentos de I.G. permite muchos estudios de expresión genética secuenciación directa de secuencias amplificadas detección de mutaciones seguimiento de la efectividad de tratamiento de enfermedades diagnósticos de enfermedades genéticas e infecciosas en ciencia forense: identificación de restos biológicos, determinación de paternidad, pruebas periciales en criminalística en arqueología y paleontología

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HISTORIA Y DESARROLLO Kary Mullis Hasta mediados de la década del ochenta. Su uso se extendió rápidamente a miles de laboratorios. uno de los cuales contendrá el gen de interés. lo que provocó un cambio cualitativo en la comprensión del funcionamiento de la célula. se pueden diseñar métodos para identificar qué bacterias llevan el vector que transporta dicho gen. la cual se une específicamente al anticuerpo. ya clásicas. etcétera. un investigador de la Corporación Cetus. han permitido el aislamiento y caracterización de decenas de miles de genes de microorganismos. Este método se basa en la introducción de fragmentos de ADN. en vectores. animales y plantas. siglas provenientes del inglés Polymerase Chain Reaction. Mullis. Éstos son moléculas de ADN (plásmidos o ADN de bacteriófagos) capaces tanto de transportar fragmentos ajenos a su estructura original como de multiplicarlos dentro de bacterias. Una vez aislado el gen no sólo resulta posible determinar con exactitud su secuencia de bases o analizar en detalle la información de la que es portador. Estas técnicas. la única estrategia posible para aislar un gen y obtener grandes cantidades del mismo en estado puro era el "clonado molecular". Este método revolucionaría en corto tiempo el conjunto de técnicas de la biología molecular. sino que también se puede estudiar su expresión (la manera en que dirige la síntesis de la proteína correspondiente) en distintos organismos y tipos celulares. Este reconocimiento también se puede realizar si se dispone de un anticuerpo contra la proteína resultante del gen que se desea clonar. inventó un método para lograr la multiplicación in vitro de fragmentos definidos de ADN sin necesidad de recurrir a los vectores y su replicación en bacterias. no sólo de investigación básica. En este caso se reconoce la bacteria portadora porque fabrica la proteína codificada por el fragmento de interés. introducido en células en cultivo o en animales de experimentación. ya muy conocida como PCR. Si se conoce un pequeño tramo de la secuencia de aminoácidos de una proteína cuyo gen se desea "clonar" (multiplicar). En 1985. 2 . K. Se trata de la reacción en cadena de la polimerasa. sino también de diagnóstico clínico.

Pero esta enzima resulta desactivada debido a la alta temperatura requerida para desnaturalizar la doble cadena del ADN. El Dr. En 1989. El tramo destinado a reproducirse puede tener desde cincuenta hasta más de dos mil nucleótidos de longitud. sino que puede ser parte de mezclas complejas. adquiere los derechos y las patentes mundiales de la PCR. los científicos alcanzan la primera amplificación y detección simultánea de las secuencias específicas de DNA usando un colorante fluorescente. Cycle" fue creada por los ingenieros de Cetus para tratar esa necesidad de agregar la enzima fresca a cada tubo de prueba después del calentamiento y del proceso de enfriamiento. En 1985. Por lo tanto. La purificación de la polimerasa de Taq dio lugar a la necesidad de una máquina que realizara un ciclo más rápidamente entre diversas temperaturas. En 1990. Sin embargo. de la ADN polimerasa de la bacteria Escherichia coli. la técnica PCR hizo uso. Para replicar el ADN. Kary Mullis comparte el premio Nobel de Química en 1993 por inventar la tecnología de PCR. en un principio. En 1991 Hoffmann-La Roche Inc. por lo cual debía agregarse enzima fresca al comenzar el tercer paso de cada ciclo. la ADN polimerasa de este microrganismo. Cetus anunció un acuerdo de colaborar con Hoffman-LaRoche en el desarrollo y la comercialización de productos de diagnóstico humanos in vitro y de servicios basados en tecnología de PCR. el término que se ha impuesto) pequeñas cantidades de ADN entre cientos de miles y millones de veces. este inconveniente fue solucionado de manera ingeniosa cuando se la reemplazó por su equivalente de la bacteria "termófila" Thermus aquaticus. La primera máquina termocicladora. denominada Taq polimerasa.Esta técnica permite multiplicar ("amplificar" es. los científicos de Cetus comenzaron a buscar las maneras de automatizar el proceso. Cuando el proceso era manual la técnica de PCR era lenta y requería de trabajo intensivo. De esta manera es posible mezclar todos los componentes de la PCR al comenzar el primer ciclo y la reacción en cadena puede llevarse a cabo mediante equipos automatizados que realizarán los ciclos térmicos programados. en realidad. En efecto. Cetus se asoció con la corporación Perkin-Elmer e introdujo la DNA Termal Cycler. El segmento de ADN que sirve de molde no requiere estar necesariamente en estado puro. actúa eficientemente entre los 75°C y los 80°C y resiste más de dos horas a 93°C. poniendo el fundamento para la PCR en tiempo real o PCR "cinético" (pruebas TaqMan). "Mr. 3 .

alicuotados y almacenados a -20 ºC. concentración final) .METODOLOGÍA BÁSICA Componentes de la reacción Los nucleótidos Los nucleótidos se diluyen en agua. un pH ácido promoverá la hidrólisis del dNTP en dNDP y dNMP y los hará inútiles para las reacciones de polimerización de la DNA enzimática.7-8. Los stocks son diluidos a 10 mM.0 . La estabilidad de los dNTP durante ciclos repetidos de PCR es tal que aproximadamente el 50% permanece como dNTP después de 50 ciclos. 4 . Si no. Es recomendado usar un stock de trabajo que contenga 1mM de cada dNTP. la solución debe ser protegida (por ejemplo con el 10mM Tris pH 7.

o secuencias promotoras en la secuencia blanco. la posición de los iniciadores debe ser relativa a los codones de inicio y terminación. 5 . un codón de inicio ATG. Los productos no específicos y los dímeros de primers son por si mismos sustratos para PCR y compiten con el producto deseado por la enzima. Por ejemplo.6 µg de DNA o 100 pM de una secuencia de 400 bp. Se debe decidir la mas baja concentración adecuad de dNTP para la longitud y composición de la secuencia blanco. Tabla 1. Pueden ser usados primers degenerados para extraer genes nuevos en base a su similitud o su secuencia de aminoácidos.Concentraciones entre 20 y 200 µM resultan en un balance óptimo entre rendimiento. En la tabla 1 se muestran los criterios principales a considerar para la selección adecuada de los primers. Primers Los oligonucleótidos iniciadores o primers son fragmentos complementarios que se van a unir a cada una de las dos cadenas separadas del templado de ADN. Criterios Principales Tamaño Base en el extremo 3' Tamaño ideal: 20-25 nucleótidos de longitud generalmente: 18-30 nucleótidos de longitud Debe ser una G o una C Temperaturas de fusión 50-65 ºC (Tm) contenido GC auto-complementariedad Similaridad 40-60% Debe ser evitada Para minimizar la formación de estructuras secundarias y los dimeros de primer Debe tener un 100% de apareamiento con el molde Cuando el objetivo a amplificar es un locus.5 µM. De este paso depende el éxito en el laboratorio. Altas concentraciones de primer pueden promover “mispriming” y acumulación de producto no específico y puede incrementar la probabilidad de generar un templado independiente llamado dímero de primer. 20 µM de cada dNTP en una reacción de 100 µl es suficiente para sintetizar 2. de la misma forma el cebador "reverse" debe localizarse 35 pb despues de la región que codifica. Es recomendable que el cebador "forward" se encuentre mas o menos a 35 pb del inicio de la secuencia que codifica. resultando en un bajo rendimiento del producto deseado. La selección de oligonucleótidos iniciadores es muy importante en la reacción en cadena de la polimerasa. especificidad y fidelidad.1 y 0. Los cuatro dNTP deben ser usados en concentraciones equivalentes para minimizar errores de incorporación de bases. Los primers pueden contener extensiones en el extremo 5’ o “mismatches” para incorporar sitios de enzimas de restricción. dNTPs y primers. Las concentraciones óptimas de los primers son generalmente entre 0.

Las regiones poliA y poliT deben también ser evitados ya que interfieren con el complejo del primer-templado. Contenido de G/C La composición base de los primers debe estar entre el 45% y el 55% de G/C. Un primer diseñado con una secuencia altamente repetida dará lugar a productos no deseados. En este caso la substitución de dGTP por 7-deazo-2’deoxiGTP ha sido muy usada Especificidad La especificidad de los primers es en parte dependiente de su longitud. Secuencias Complementarias del primer Los primers necesitan ser diseñados con menos de 3 pares de bases de homología entre ellos. ocurrirá la formación de dímeros de primer que. a menudo. Si un primer tiene tal región de homología se formarán estructuras parciales de doble cadena que interferirán con el alineamiento. Sin embargo. Esto pondrá la Tm en la gama de 56°C . La inclusión de un residuo de G o de C en el extremo 3' de los primers ayuda a asegurar el correcto enlace en el extremo terminal 3' debido al enlace de hidrógeno más fuerte de los residuos G/C. prevendrá la formación del producto deseado por competición.62°C. 6 . Secuencia de los extremos 3' Es establecido que la posición terminal 3' en primers de PCR es esencial para el control del “mispriming”. Esto puede bajar la eficacia de la amplificación. El primer tendrá un contenido de G/C del 50% y ~20 bases de largo. Existen muchos métodos para calcular la temperatura de fusión. el mismo primer puede dar una sola banda si se amplifica una sola clona de una biblioteca genómica.Una razón menos obvia por la que los primers fallan es la presencia de estructuras secundarias en el templado de DNA. Los primers deben ser elegidos de modo que tengan una secuencia única dentro del DNA que será amplificado. aproximadamente. pero siempre. Si la homología ocurre en el extremo 3' de cualquier primer. También ayuda a mejorar la eficacia de la reacción reduciendo al mínimo la respiración que pudo ocurrir. después de efectuado el cálculo es necesario ir al laboratorio y ensayar con diferentes temperaturas de asociación cercanas a la temperatura de fusión para determinar la temperatura óptima para cada reacción. Se recomienda que se emplee como temperatura de asociación la temperatura de fusión -5ºC. Temperatura de Asociación La temperatura de asociación de los primers es uno de los factores más determinantes de la reacción. La secuencia de los primers debe ser elegida de tal forma que no haya regiones de poliG o de poliC que pueden promover el reconocimiento no específico.

9M. Los cambios en la entalpía ( ) y la entropía ( ) de la formación del dúplex se calculan a partir de parámetros termodinámicos de vecindades. y [M] es la concentración de cationes monovalentes. Programas de Diseño de Primers Existen programas disponibles en la red que ayudan al diseño de primers. Para secuencias de 20 bp o menos.987 cal.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.edu/rawprimer. Se puede adicionar un segundo término a la ecuación anterior para tener en cuenta el efecto estabilizante de la sal sobre el dúplex: Los efectos de Na+ y K+ son equivalentes dentro de los márgenes del error experimental.cgi http://alces.41(%GC) . Por ejemplo: http://frodo. El método mas preciso para estimar la Tm de oligornucleótidos está basado en el análisis termodinámico del proceso de fusión del cual se puede mostrar que.wi.mit. y C es la concentración molar del oligonucleótido. R es la constante molar de los gases (1.6 log[M].500/L + 16.html 7 . donde L se refiere a la longitud del oligonucleótido.umn.5 + 0. típica de "dot blot" y otros ensayos de hibridización A continuación tenemos otra expresión para el cálculo de Tm Tm = 81. Esta fórmulas es únicamente aplicable a secuencias polinucleotídicas largas.K-1mol-1).med.Cálculo de la temperatura de fusión (Tm) Existen muchos métodos para estimar el valor de la temperatura de fusión. existe la siguiente aproximación: Tm = 2ºC (A + T) + 4ºC (G + C) donde se asume una concentración de sal de 0.

= no determinado b 8 . se recomienda probar rangos de concentración de enzima de 0. los requerimientos de enzima pueden variar con respecto a la secuencia blanco o los primers.d. Sin embargo.d. y si es muy baja se formara una cantidad insuficiente del producto deseado. Cuando se optimiza un PCR. La polimerasa Un rango de concentración recomendado para Taq polimerasa (Perkin-Elmer CETUR) es entre 1 y 2.5 a 5 unidades/100 µl.d. 30 c Tasa de Extensiónd 75 67 n. Frecuencia de error por pares de bases incorporadas. d Número promedio de nucléotidos adicionados por segundo. Tabla 2. c Número promedio de nucleótidos adicionados antes de la disociación. Características de algunas polimerasas termoestables de DNA Enzima Taq Pol Tli Pol (Vent) Pfu Pol Ruth a Eficiencia Relativaa 88 70 60 n.d.Templado Una de las características más atractivas de la PCR es que la cantidad y calidad de la muestra de DNA sujeta a amplificación no necesita ser alta. n. Tasa de errorb 2x10-4 4x10-5 7x10-7 n. El criterio esencial es que la muestra contenga al menos una cadena de DNA intacta que abarque la región que va a ser amplificada y que las impurezas sean suficientemente diluidas como para no inhibir la polimerización.d. 60 3’ a 5’ exo no si si no 5’ a 3’ exo si no no si Porcentaje de conversión de templado a producto por ciclo. Procesividad 55 7 n. Si la concentración de la enzima es muy alta se acumulan productos no específicos.5 unidades (SA = 20 unidades/pmol) por 100 µl de reacción cuando los otros parámetros son óptimos. Una sola célula o un lisado celular crudo o especimenes con una longitud promedio de unos pocos cientos de pares de bases son usualmente adecuadas para una amplificación exitosa.

que como se sabe es la enzima que dirige la síntesis de ADN. la especificidad del producto. Está basado en la acción de la polimerasa. 9 .021/ºC sin embargo el verdadero pH de una buffer 20mM de Tris (pH 8.5 mM de magnesio sobre el total de la concentración de dNTP. Tris es un buffer iónico bipolar que tiene un pKa de 8. La PCR es un proceso que consta de tres pasos. La presencia de EDTA u otros quelantes en el stock del primer o del templado puede alterar la concentración óptima aparente de magnesio. La gelatina o la albúmina bovina (100 µg/ml) y detergentes no iónicos como el tween 20 o laureth 12 (0. y desde una cadena simple de ADN sintetiza la complementaria. tanto del templado como del producto de PCR.05 a 0. se hace la amplificación del fragmento deseado.8).1% ) son incluidos para ayudar a estabilizar la enzima. si de forma voluntaria le proponemos una pequeña fracción de oligonucleótidos que sean complementarios de una porción. NaCl a 50 mM o KCl arriba de 50 mM inhibe la actividad de la Taq polimerasa. la temperatura de disociación de las cadenas. La Taq polimerasa requiere magnesio libre en la unión con el templado. Parámetros de la reacción Con la PCR se realiza in vitro el proceso de replicación del ADN.5 a 2. sin embargo muchos protocolos trabajan bien sin estos componentes. a través de la acción de la polimerasa.3 -8. Hasta 50 mM de KCl puede ser incluido en la mezcla de reacción para facilitar el alineamiento de los primers. Para ello necesita al menos una pequeña fracción de cadena doble de ADN para iniciar la síntesis.3 a 20ºC) varia entre 7. los primers y los dNTPs. la formación de dímeros de primer y la actividad y fidelidad de la enzima. se unirá después de la desnaturalización de la doble cadena y mediante el crecimiento hacia el extremo 3´ del DNA por aposición de los nucleótidos correspondientes suministrados y. Otros componentes de la reacción Un buffer recomendado para PCR es de 10-50 mM de Tris-HCl (pH entre 8.8 durante las condiciones típicas del termociclador.8 y 6. Esto hace posible. Los PCR deben contener 0.3 a 20ºC y un _ pKa de -0.Concentración de Magnesio Es benéfico optimizar la concentración del ión magnesio. ya que afecta: el alineamiento de los primers.

Alineamiento. Las temperaturas de alineamiento en el rango de 55 a 72ºC genera buenos resultados. La desnaturalización incompleta permite el apareamiento de las hebras de DNA y por lo tanto se reduce el rendimiento el producto. Las condiciones típicas de desnaturalización son 95ºC por 30 segundos. tamaño y concentración de los primers amplificadores. Para ello se baja la temperatura y las condiciones serán tales que se facilitará la unión de los primers a las cadenas. En contraste. Una temperatura de alineamiento óptima es 5ºC por debajo de la Tm de los primers. La temperatura y el tiempo requerido para el alineamiento de los primers depende de la composición. los pasos de desnaturalización a altas temperaturas o por mucho tiempo provocan perdida de la actividad de la enzima. separándose las dos cadenas por ruptura de los enlaces de hidrógeno. La segunda reacción consiste en la hibridación de los primers. El rango de actividad de las enzimas varia en dos ordenes de magnitud entre 20 y 85ºC. la extensión de los primers puede ocurrir a bajas temperaturas incluyendo el paso de alineamiento.Desnaturalización. o 97ºC por 15 segundos. sin embargo temperaturas más altas pueden ser apropiadas especialmente para templados ricos en G + C. La primera reacción consiste en la desnaturalización del DNA. Debido a que las DNA polimerasas son activas en un amplio rango de temperaturas. 10 .

según lo demostrado en la Tabla 3. tiempos mayores de extensión pueden ser útiles cuando la concentración del sustrato es muy pequeña o cuando la concentración del producto excede la concentración de la enzima.2 x 2 x 2 veces u 8 (23) veces la cantidad inicial. Un tiempo de extensión de un minuto es considerado suficiente para productos de hasta 2 kb de longitud. pH. concentración de sales y la naturaleza del templado. El número óptimo de ciclos dependerá principalmente de la concentración inicial del templado cuando los otros parámetros son optimizados. como resultado de un experimento de amplificación. Después de cada ciclo. por ejemplo. ya que esto puede incrementar la cantidad y complejidad de productos no específicos. después de N ciclos tendremos 2N. permite obtener. Las estimaciones para la tasa de incorporación de nucleótidos a 2ºC varia de 35 a 100 nucleótidos por segundo dependiendo del buffer. la cantidad de DNA es dos veces la anterior. temperatura a la cual. 11 . la polimerasa lleva a cabo su acción. La extensión del primer se realiza tradicionalmente a 72ºC. Sin embargo. después de 4 ciclos 2 x 2 x 2 x 2 veces o 16 (24). insertando los diferentes nucleótidos complementarios en el orden que le va indicando la cadena que actúa como molde. Número de ciclos. después de 3 ciclos . así que después de dos ciclos tenemos 2 x 2 veces. millones de copias del fragmento de interés. La tercera reacción se efectúa a 72º C.Extensión. La repetición de este ciclo unas 40 veces. La cantidad de DNA dobla teóricamente con cada ciclo de PCR. Así. Pocos ciclos dan como resultado un bajo rendimiento del producto. Un error común es el de ejecutar demasiados ciclos. Los tres pasos anteriores constituyen un ciclo. El tiempo de extensión depende de la longitud y concentración de la secuencia blanco y de la temperatura.

con posibilidad de programar las temperaturas y los tiempos. aunque las características principales son las siguientes: • Constan de un bloque térmico. Las rampas de subida y bajada de temperatura son importantes para trasladar los protocolos entre termocicladores. Los actuales constan. cuyo calentamiento y enfriamiento se produce a gran velocidad. gracias al denominado sistema Peltier. Los primeros termocicladores eran robots que movían una gradilla de tubos entre varios baños termostáticos a tiempos preestablecidos. Termocicladores El termociclador es el aparato que permite llevar a cabo de forma automática y reproducible la sucesión de ciclos de temperatura necesarios para la PCR. de un bloque de metal que puede ser calentado o enfriado.Tabla 3. Relación entre cantidad de DNA y el número de ciclos. y 12 . básicamente. Existen multitud de termocicladores en el mercado.

Actualmente. a un proceso de separación por difusión bajo la acción de un campo eléctrico. Es importante el perfecto ajuste del tubo en el bloque. Cada termociclador tiene su propio software. o cuando se necesitan realizar diversos protocolos de forma simultánea.2 ml aunque aún existen también para 0. Así. que actúa como soporte sólido (Southern blot). cuya secuencia de bases esté contenida en el fragmento de interés. al menos. el tamaño del fragmento multiplicado puede determinarse sometiendo los productos de la reacción a una electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida. especialmente de temperaturas de hibridación. • Tapa térmica: los más antiguos no la poseen. y luego es puesto en contacto con la sonda. Por otra parte. que se unirá al fragmento buscado ya que ha sido preparada de modo tal que resulta ser complementaria del mismo. Respecto a llegar a 100ºC o más. Software para programación de tiempos y temperaturas: se denomina programa a cada conjunto de datos térmicos y temporales de un protocolo de PCR. las rampas. Identificación de los productos de PCR • El hecho de que las moléculas de ADN obtenidas al finalizar la reacción en cadena correspondan efectivamente al fragmento de interés queda asegurado por la intervención de los primers que definen los extremos "derecho" e "izquierdo" de ese fragmento. aunque el rango habitual debe ser de 15ºC a 95ºC. Son muy útiles cuando se realiza ajuste continuo de programas de PCR. de forma habitual. Se dice que tienen función gradiente. No debe sobrecargarse al aparato con temperaturas extremas para prolongar su supervivencia. Es preferible emplear termobloques para llevar a cabo esta labor. Por ello.5 ml. se recomienda utilizar los de la misma marca que el fabricante. Existen bloques que permiten ajustar distintas temperaturas en función de las zonas del mismo. El rango de temperaturas suele abarcar de 4ºC a 110ºC. En este caso se procede así: el ADN fraccionado por electroforesis es desnaturalizado y luego transferido a una membrana de nitrocelulosa o nylon. Los 4ºC se utilizan para refrigerar muestras tras una PCR. También es posible colocar el ADN directamente en la membrana en forma de pequeñas manchas (dot blot) para su posterior hibridación con la 13 . pero 15ºC también es una temperatura apta para ello.uno de los factores de falta de reproducibilidad. pero es un elemento indispensable para evitar la evaporación de la muestra. tampoco es aconsejable. es decir. una vez que la reacción ha finalizado. la identidad del producto puede ser confirmada mediante hibridación (unión complementaria) con una sonda marcada radiactivamente. lo que hace que deban ajustarse de nuevo las condiciones de tiempos y temperaturas. Puede ajustarse también la velocidad de subida y bajada de temperaturas. están diseñados mayoritariamente para tubos de 0. es decir. al contactar totalmente con la tapa del tubo.

La determinación del tamaño al que quedan reducidos los fragmentos al ser puestos en contacto con la enzima de restricción adecuada indica que nos encontramos ante los segmentos de interés. Tres formas de analizar los fragmentos de ADN amplificados mediante la técnica PCR. Mediante el empleo de esta metodología. C: dot blot. Las muestras colocadas sobre un gel y sometidas a la acción de un campo eléctrico (electroforesis) migran de una manera característica que se puede visualizar por tinción (coloreado) del ADN. carril M: marcadores de ADN de tamaño conocido. Ésta quedará fijada donde se encuentre el tramo de ADN de interés y su presencia se revelará a través de una autorradiografía (placa fotográfica sensible a la emisión radiactiva de la sonda).) B: Southern blot. los productos amplificados poseen secuencias que son reconocidas por ciertas enzimas llamadas en endonucleasas de restricción. en ambos casos. pero practicado sobre una siembra en forma de manchas de los fragmentos de ADN a analizar previamente desnaturalizados. la filiación de los fragmentos obtenidos queda confirmada por el hecho de que poseen tamaños previsibles. conocida como nested PCR (PCR anidada). (Carriles 1-8: productos de distintas PCRs. Una estrategia distinta para confirmar la identidad del fragmento replicado consiste en realizar dos reacciones de PCR consecutivas. una alícuota de la misma es sometida nuevamente al proceso de multiplicación tras haber colocado dos primers internos. El ADN es desnaturalizado (separación de sus hebras constituyentes) y transferido a una membrana de nitrocelulosa o nylon para luego incubar la hibridación (unión) con una sonda radiactiva. En algunos casos. 14 . Al finalizar la primera.sonda. A: visualización directa. mediante autorradiografías Figura 1. La localización de las sondas radiactivas se logra. Método análogo al anterior.

En PCR en tiempo real. La transcripción reversa genera una copia de la hebra de RNA. 4. Figura 2.RT PCR Dado que el RNA usualmente es de una sola hebra y es sensible al calor. los deoxinucleótidos y un buffer conveniente. Los pasos de la RT-PCR son: 1. 15 . pero generalmente se encuentran a 100 bases de distancia especialmente cuando se usa el PCR en tiempo real A 72ª la polimerasa extiende el DNA desde los primers. Se obtienen 4 cadenas de cDNA. se obtiene la hebra del cDNA complementario al RNA. A 50 o 60º los primers específicos se alinean con el sitio complementario en cada cadena. pero esta copia es DNA complementario (cDNA) el cual es estable al calor y puede resistir la metodología PCR. se utiliza generalmente una transcriptasa reversa que tenga una actividad endo H. las dos hebras se separan. Transcripción reversa: La polimerasa rTth cataliza la extensión del primer mediante la incorporación de nucleótidos complementarios. 3. Los sitios de unión a los primers deben estar separados 400 bases. Fin de transcripción reversa. 2. PCR. El mRNA es copiado a cDNA por la transcriptasa reversa usando un primer dT (los primers al azar se pueden también utilizar)(Figura 2). Se adiciona una mezcla de PCR que incluya una polimerasa termoestable (tal como la Taq polimerasa). los primers específicos para el gen de interés. Conversión de mRNA a cDNA por la transcriptasa reversa El cDNA se desnaturaliza a mas de 90º (~94º). es necesario hacer una transcripción reversa (RT) antes de iniciar la amplificación por PCR. Esto elimina el mRNA permitiendo que la segunda hebra de DNA sea formada. Transcripción reversa: Unión del primer a la secuencia de RNA objetivo.

Figura 3. Otros colorantes. PCR EN TIEMPO REAL La RT-PCR es solamente semicuantitativa en el mejor de los casos. como el SYBR green. Hay una variedad de métodos para la cuantificación del mRNA. hay maneras más sensibles de detectar el producto). Sin embargo. los productos de reacción son analizdos usualmente por electroforesis en gel de agarosa. se utilizan en el PCR en tiempo real (Figura 3). El SYBR green fluoresce brillantemente solo cuando se une a DNA de doble cadena. Así la PCR en tiempo real fue desarrollado debido a: • • La necesidad de cuantificar diferencias en la expresión del mRNA La disponibilidad de cantidades pequeñas de mRNA en algunos procedimientos. que son mucho más fluorescentes que el bromuro de etidio.Después de 30 o 40 ciclos de síntesis de cDNA. la fluorescencia no es muy brillante. Éstos incluyen: − − − − northern blotting análisis de protección de ribonucleasa (RPA) hibridación in situ PCR 16 . El bromuro de etidio es un colorante que se une a la doble cadena de DNA intercalandose entre los pares de bases. El gel se tiñe con bromuro de etidio. Emite luz fluorescente cuando se irradia en la parte UV del espectro. en parte por la insensibilidad del bromuro de etidio (sin embargo. Los protocolos de PCR competitivos se han desarrollado para hacer el método más cuantitativo pero son a menudo complicados. Los geles de agarosa para analizar los productos de cDNA de la RT-PCR no nos permite la cuantificación ya que el bromuro de etidio es muy insensible y cuando una banda es perceptible sobrepasa la etapa logarítmica de amplificación.

cuya señal aumenta en proporción directa a la cantidad de producto de PCR en la reacción. Técnicas de detección La química de la detección está dada por: • • • • Agentes intercalantes fluorescentes (SYBR Green) Sondas hidrolizadas Hairpin probes (Molecular Beacons. pero requieren más RNA del que a veces se dispone. El northern blotting y RPAs son patrones excelentes. la PCR tradicional es solamente semicuantitativa en parte debido a las dificultades de observar la reacción durante la parte verdaderamente linear del proceso de la amplificación. Es una técnico simple pero es difícil conseguir resultados verdaderamente cuantitativos usando PCR convencional. Sin embargo durante la reacción de PCR puede unirse a dímeros de primers 17 . Una ventaja adicional de la PCR en tiempo real es la relativa facilidad y conveniencia de su uso comparadas a algunos métodos más viejos. puesto que el hecho de que la PCR implica un paso amplificación significa que es más sensible. Los productos de amplificación se observan a medida que transcurren los ciclos de la PCR. fácil de usar. Las técnicas tales como el northern blotting y los RPAs trabajan muy bien. SYBR greenTM Es un agente intercalante que se une al ADN de doble cadena dando un incremento de la fluorescencia a medida que aumenta la cantidad de producto de PCR. En contraste con la RT-PCR y el análisis de los geles de agarosa. el empleo de un termociclador que tiene acoplado un sistema de detección que es capaz de adquirir y cuantificar la señal emitida por el reportero al final de cada ciclo para cada muestra. Está basado en: • • la detección y cuantificación de un reportero fluorescente.La PCR es el método más sensible y puede discriminar entre mRNAs cercanamente relacionados. Es simple y económico. Sin embargo. sensible. Scorpions) Sondas de hibridización. la PCR en tiempo real da resultados cuantitativos. puesto que no hay amplificación implicada. mientras que la hibridación in situ es cualitativo más que cuantitativo. versátil y no se necesitan sondas específicas. Los métodos de PCR son por lo tanto particularmente valiosos cuando las cantidades de RNA son bajas.

Pero. la actividad exonucleasa de la Taq polimerasa corta al fotocromo reportero del resto de la sonda. Figura 4. permitiendo la emisión una señal fluorescente (Figura 4). Hydrolysis probes Hairpin probes (Molecular BeaconsTM) Estas sondas poseen secuencias repetidas invertidas (ITR) en sus extremos 5´y 3´. en ausencia de la secuencia blanco. Hydrolysis probes (TaqManTM) Se emplea una sonda que tiene unidos un fotocromo reportero y un fotocromo quencher.y a otros productos inespecíficos. el reportero no emite señal. cuando la sonda hibrida con la secuencia de interés durante la reacción de PCR. resultando en una sobreestimación de la concentración del DNA blanco. resultando en una eficiente separación del quencher y del reportero y la consecuente emisión de este último (Figura 5). Cuando ambos fotocromos están unidos a la sonda. La secuencia interna de la sonda es complementaria al blanco. 18 . Se monitorea la señal fluorescente del reportero que se va acumulando en los sucesivos ciclos de PCR. Este diseño permite que se forme una estructura de horquilla (hairpin) por complementariedad de las dos regiones ITR. dirigiendo así la hibridación específica.

comúnmente. Se requiere de un riguroso diseño de las regiones tallo y asa de la horquilla. siendo la distancia óptima de 1 a 5 bases entre las sondas.Figura 5. Hybridization probes El diseño implica el uso de dos secuencias de oligonucleótidos específicos como sondas. Así. 19 . Funcionamiento de las Hairpin probes (Molecular BeaconsTM) Entre sus ventajas están el que son más específicas que las sondas TaqMan (deben tener un cambio conformacional para hibridar con el blanco). Las dos sondas están diseñadas para hibridar en sus blancos específicos en un arreglo cabeza-cola que permite que ambos fluoróforos estén en estrecha proximidad entre sí. la transferencia de energía de resonancia sólo ocurre cuando ambas sondas se hibridan al blanco muy próximas entre sí. el extremo 3´de la sonda donadora con fluoresceína y el extremo 5´de la sonda aceptor con LC Red 640 o LC Red 705 (Figura 6). cada una marcada con un fluoróforo diferente. permiten distinguir dos secuencias blanco muy similares entre sí y que se pueden combinar varias Molecular Beacons en una única reacción empleando diferentes compuestos fluorescentes para identificar secuencias blanco específicas distintas (Múltiplex PCR).

La secuencia blanco se elige típicamente para estar 3 bases dentro del extremo 3' del primer scorpion. la interacción es intermolecular.Figura 6. la secuencia de la sonda en la cola del Scorpion se enrosca para hibridarse a la secuencia blanco en el producto de PCR. estas sondas están marcadas con un único fluorocromo. Esto hace que sean más fáciles de sintetizar y caracterizar. Hybridization probes En comparación con las otras dos técnicas. En la etapa apropiada del ciclo de PCR (la fase de alineamiento). los primers de scorpions se amplifican para formar productos de PCR. La estructura de tallo y asa es separada de la secuencia de del primer de PCR por una modificación química que evita que se copie la secuencia de tallo y asa del scorpion (Figura 7). Durante la PCR. Como la cola del scorpion y del producto de PCR es ahora parte de la misma hebra de DNA. y que el control de calidad sea más sencillo que para las sondas doblemente marcadas. Scorpions Los scorpions son primers de PCR con una cola tallo y asa ("Stem-Loop") que contiene un fluoróforo y un quencher. 20 .

Esto define la línea de fondo para el diagrama de la amplificación. Las reacciones son caracterizadas en el momento en el que la amplificación de un producto de PCR se detecta después de un número fijo de ciclos. Figura 8. Un diagrama de amplificación es una gráfica de la señal de la fluorescencia contra el número de ciclos. Diagrama de Amplificación 21 . Un aumento en fluorescencia sobre la línea de fondo indica la detección del producto acumulado de PCR.Figura 7. hay un pequeño cambio en señal de fluorescencia. En la figura 8 se muestra un diagrama representativo de la amplificación. más pronto se observa el aumento significativo en la fluorescencia. En los ciclos iniciales de PCR. Scorpions Cuantificación La capacidad de monitorear el progreso en tiempo real de la PCR revolucionó totalmente la manera de cuantificación basada en la PCR de DNA y de RNA. Cuanto más alto es el número de copias del blanco.

menor Ct medido. Curva Estándar 22 . El Ct está determinado en la fase exponencial de la reacción y es más confiable que las mediciones en el punto final convencionales (Figura 9). Figura 10. Figura 9. El Ct es inversamente proporcional al número de copias del DNA blanco: a mayor concentración de blanco.Se adquieren los datos cuando la amplificación está todavía en la fase exponencial. Este número de ciclo se llama ciclo umbral (Ct: threshold cycle). La cuantificación de la cantidad de blanco en muestras desconocidas es lograda midiendo Ct y usando la curva estándar para determinar el inicio del número de copias. Ciclo Umbral (Ct) La gráfica del logaritmo del número inicial de copias del blanco para un sistema de estándares contra Ct es una línea recta (Figura 10). y de la determinación del número de copias iniciales para las muestras es realizado por el software del sistema 5700 y 7700. El proceso entero de calcular los Cts. Esto está determinado por la identificación del número de ciclo al cual la intensidad de emisión del fluoróforo aumenta con respecto al ruido de fondo (background). de preparar una curva estándar.

mas pronto se detecta el producto acumulado en el proceso de PCR. 23 . usando el sistema 5700. En la fase exponencial. Los valores de Ct se trazan contra el logaritmo de la cantidad inicial de DNA genómico para dar la curva estándar mostrada en la figura 11c Figura 11. del gen humano de la β-actinia en diluciones de DNA genómico. La figura 11b muestra los mismos datos. Cuanto más alta es la cantidad inicial de DNA genómico. En esta figura. El software del sistema 5700 calcula el Ct para cada reacción. los componentes de la reacción no están limitados y las reacciones de replicación exhiben resultados reproducibles y uniformes. Se corrieron seis réplicas para cada cantidad de DNA. el cambio en la fluorescencia del SYBR Green se grafica contra el número de ciclos. y más bajo es el valor de Ct. Amplificación de la β-actinia. Los valores de Ct son reproducibles en las réplicas porque el umbral se escoge en la fase exponencial de la PCR. Esto se demuestra en la figura 11b donde el umbral intersecta la gráfica de amplificación en la región donde hay una relación lineal entre el logaritmo del cambio en fluorescencia y el número del ciclo. pero graficando el logaritmo del cambio en la fluorescencia contra el número de ciclos.La figura 11a muestra la amplificación. Estos tres diagramas ilustran los principios básicos de la cuantificación en tiempo real de PCR.

el estándar perfecto no existe. P0). Estándares usados comúnmente: • • • • • • mRNA de Gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenasa mRNA de Beta actina mRNA de MHC I (complejo de mayor histocompatibilidad I) mRNA de Ciclofilina mRNAs para ciertas proteínas ribosomales. RPPO. Un gen que puede ser usado como “loading control” (o estándar interno) debe tener varias características: • • • El gen estándar debe tener el mismo número de copias en todas las células. Por ejemplo RPLP0 (proteína ribosomal larga. 24 . se debe ser capaz de demostrar que la expresión del estándar no cambia significativamente cuando las células o tejidos son sujetos a las variables experimentales que se planean usar. consecuentemente. Arbp o fosfoproteína ribosomal ácida P0. Esto conduce a una mayor precisión en la cuantificación del DNA y del RNA. Durante la fase exponencial. P0. los valores de Ct son muy reproducibles para las reacciones que comienzan con el mismo número de copias. el índice de la amplificación del blanco disminuye hasta que se alcanza una meseta y hay poco o nada de aumento neto en producto de PCR. PRLP0. Si los componentes de la reacción llegan a ser limitantes.Genes estándares Un control interno consiste en utilizar un gen cuya expresión no cambie. que una medida de la cantidad de producto acumulado en el punto final de la PCR. Si es posible. También es conocida como 36B4. Ésta es la razón principal por la que el Ct es una medida más confiable del número de copias que comienza. rRNAs 28S o 18S (RNAs ribosomales) El efecto de limitar los reactivos Los ciclos iniciales de PCR se caracterizan por un aumento exponencial en la amplificación del blanco. proteína ribosomal L10. L10E. por tanto lo que se decida usar como estándar o estándares debe ser validado para su muestra. ninguno de los componentes de la reacción está limitado. 60S proteína ribosomal ácida P0. La detección de la fluorescencia de los sistemas 5700 y 7700 permite que el Ct sea observado cuando la amplificación de PCR esta aún en la fase exponencial. Debe expresarse en todas las células Un número de copias intermedio es ventajoso Sin embargo.

El cambio total en la señal del reportero. Si la eficiencia de amplificación del blanco y del competidor es idéntica. el cociente del blanco y el competidor seguirá siendo constante a través del proceso de PCR. la cantidad de producto de PCR observada en el final de la reacción es muy sensible a variaciones leves en los componentes de la reacción. Sin embargo. Por ejemplo.Por otra parte. Una característica distinguible es hacer al blanco y los amplicones competidores de diferentes tamaños para poder utilizar la electroforesis en gel para discriminar los dos productos. Las diferencias entre el punto final y la detección en tiempo real se ilustran gráficamente en la figura 12. varía ampliamente entre las réplicas (Figura 12a). Diferencias entre el punto final y la detección en tiempo real PCR competitivos cuantitativos Para compensar los problemas con las medidas en el punto final. Así. Figura 12. determinando el cociente del blanco y 25 . Una cantidad conocida de competidor es colocada en la muestra. las reacciones laterales. en el ciclo 40. después el blanco y el competidor son amplificados en la misma reacción. como la formación de dímeros de primer. que demuestra la amplificación de 96 muestras idénticas. se han desarrollado una variedad de técnicas de PCR competitivo cuantitativo. pero es de alguna manera distinguible del blanco. Se construye un amplicon competidor que contiene los mismos sitios de unión que el primer y tiene la misma eficiencia de amplificación que el blanco. Así. los diagramas de la amplificación son notablemente similares entre los ciclos 22 y 25. es posible que una muestra que comienza con un número más alto de copias termine con menos producto acumulado que una muestra que comienza con un número más bajo de copias. durante los cuales se determinan los valores de Ct (Figura 12b). pueden consumir los reactivos a diversos grados de tubo a tubo. Esto es porque las medidas en el punto final se hacen generalmente cuando la reacción esta más allá de la fase exponencial y una diferencia leve en un componente limitante puede tener un efecto drástico en la cantidad final de producto.

en cuanto a tiempos y temperaturas. ICycler® de BioRad El sistema ABI PRISM 7700. Esto significa que podemos mirar varias muestras simultáneamente. La máquina contiene una cámara fotográfica sensible que supervisa la fluorescencia en cada pozo de la placa en intervalos frecuentes durante la reacción de PCR. Figura 13. PCR competitivo se ha utilizado con éxito para cuantificar DNA y RNA. pero su rango dinámica se limita a un cociente del blanco/competidor cercano de 1:10 a 10:1. Para lograr esto. El funcionamiento es semejante al de un termociclador convencional. El que se muestra en la figura 13 es el ICycler® de BioRad. En el final de la reacción. que exige generalmente pasos de proceso laboriosos de post-PCR. aunque se ajusta y se controla desde un ordenador que posee el software específico. se deben probar varias diluciones para alcanzar un cociente conveniente. Máquinas para PCR en tiempo real Hay muchas máquinas para PCR en tiempo real disponibles. se deben realizar estudios cuidadosos de la validación para verificar que las eficiencias de la amplificación del blanco y del competidor son iguales antes de que la cuantificación de muestras experimentales pueda comenzar. Perkin Elmer) se basa en el empleo de placas especiales. con tapas ópticas para su adaptación al lector de fluorescencia. PCR competitivo requiere la cuantificación exacta de los amplicones del blanco y del competidor. 26 .del competidor en el final de la reacción y conociendo la cantidad inicial de competidor agregada. La mayor exactitud es obtenida encontrando el punto de equivalencia en el cual el cociente del blanco y el competidor es 1:1. Cada pocillo tiene una forma similar a la de los tubos de 0. La tapa se desliza para acomodar las muestras en una placa de formato 96-pozos (96-well).2 µL. Además. y preestablece un valor de Ct que puede ser modificado con posterioridad. de Applied Biosystems (antes. el software lo convierte posteriormente en una representación gráfica. Incluso una diferencia leve en eficiencia compromete seriamente la exactitud de la cuantificación por PCR competitivo. en función del análisis del usuario (Figura 14). Otra desventaja es la necesidad de construir y de caracterizar un diferente competidor para que cada blanco sea cuantificado. Se registran las emisiones de fluorescencia de forma continua. la cantidad de blanco puede ser calculada.

denominado carrusel. Todo ello tiene ventajas e inconvenientes. presenta un alto costo. los protocolos de tiempos y temperaturas no son intercambiables con otros sistemas de PCR cuantitativa. El calentamiento y el enfriamiento se llevan a cabo mediante un sistema de aire. en menos de 1 hora. ya que los capilares y otros materiales son específicos para este sistema. LightCycler de Roche Ventajas del tiempo Real La determinación de valores de Ct siguiendo la cinética en tiempo real de PCR elimina la necesidad de un competidor que debe de ser amplificado con el blanco. similar a una centrífuga. en muchos casos. lo que requiere de nuevas optimizaciones. Además. y bastante caros. se basa en el empleo de capilares de vidrio para la contención de las muestras. Después de una corrida de PCR el número inicial de copias se muestra para cada muestra en el pozo. La cuantificación se puede realizar por el método más básico que es preparar una curva estándar y determinar cantidad desconocida por comparación con curva estándar. Figura 15. La principal ventaja es la rapidez. 27 . donde se pueden identificar fácil y rápidamente los estándares y las muestras no conocidas. El sistema LightCycler de Roche (Figura 15). que permite obtener resultados. Comparado a las medidas del punto final. Sin embargo.Figura14 . y en un mecanismo de giro. el uso de los valores de Ct también amplía la gama dinámica de la cuantificación porque los datos se colectan para cada ciclo de PCR.El software 7700 muestra una representación de una placa con 96 pozos.

Por ejemplo: 5’-TCG AAT TCI CCY AAY TGR CCN T-3’ Y = pirimidinas = C / T (degeneración = 2X) R = purines = A / G (degeneración = 2X) I  = inosinas  = C / G / A / T  N = nucléotido = C / G / A / T (degeneración = 4X) Uso de los primers degenerados Los primers degenerados se pueden utilizar: • • Para amplificar secuencias conservadas de un gen o de genes del genoma de un organismo. También hay la posibilidad de PCR múltiplex. Las primers degeneradas se pueden utilizar para amplificar estas secuencias. Existe un amplio rango de aplicación. Para conseguir la secuencia de nucleótido después de secuenciar algunos aminoácidos de una proteína de interés Hay evidencia de regiones o motivos altamente conservados de aminoácidos que se pueden diseñar utilizando primers degeneradas. PRIMERS DEGENERADOS Son primers que tienen un número de opciones en varias posiciones en la secuencia para permitir el alineamiento y la amplificación de una variedad de secuencias relacionadas. La secuencia del aminoácido se puede 28 . El diseño de primers y sondas tiene que ser más exigente. estas regiones pueden ser conservadas entre especies. Pueden entonces ser utilizadas como sondas para amplificar el gen de interés de una biblioteca geonómica (procariótica) o de una biblioteca de DNA (eucariótica). El sistema a “tubo cerrado” sirve como control de contaminación. Se puede realizar un mayor número de reacciones por día. Con esta técnica se tiene alta precisión y exactitud.etc. El producto de PCR se cuantifica en cada ciclo. Cuando se ha aislado exitosamente una proteína de interés. No requiere de análisis posterior a la PCR (electroforesis. Esto reduce la posibilidad de contaminación y elimina fuentes potenciales de error. Las secuencias amplificadas de esta manera se pueden secuenciar para confirmar que la secuencia esté correcta.). el final de esta proteína (o algunos aminoácidos) pueden ser secuenciados.La PCR en tiempo real permite una amplificación confiable con alta especificidad y sensibilidad. Hay una alta correlación entre la señal (Ct) y la cantidad de blanco.

La alineación de la secuencia también dará el tamaño previsto del producto de PCR. Un aumento de la concentración puede ser necesario para compensar la degeneración. pueden ser utilizadas como sondas. Por lo menos 2 bloques de aminoácidos conservados deben estar presentes para permitir el diseño de los primers de PCR. Las substituciones de las bases son solamente las substituciones comunes. Sin embargo.utilizar para diseñar primers degenerados. Estas secuencias entonces se alinean. Si los primers usados son absolutamente degeneradas. El producto de PCR puede ser secuenciado. 29 . Los primers deben tener 20-30 nucléotidos de longitud. Degeneración de primers La degeneración de los primers depende de una multiplicidad de factores incluyendo el templado. simplemente se multiplican todos los valores de la degeneración incorporados en la secuencia del primer. Otra alineación se puede hacer en el nivel del nucleótido si se desea. Si los primers producen una secuencia truncada (del gen) o parcial. La degeneración se puede bajar con el uso de las inosinas para sustituir 4 bases “wobbles” en vez de usar las 4 substituciones de bases. Otro factor que se toma en consideración es que conforme la degeneración de los primers aumenta. Diseño de los primers degenerados Alineación de la secuencia Las secuencias de aminoácidos de proteínas similares u homólogas se pueden recuperar de una base de datos tal como GenBank. una excepción se observa para las concentraciones de primers. Si una base se conserva a través de la alineación se puede suponer que esta base particular será la misma en el caso de interés. Para conseguir la degeneración. se pueden utilizar 50 pmoles como punto de partida y optimizar a partir de ahí. aunque se han utilizado otras opciones dependiendo de la secuencia La Reacción de PCR El cóctel de PCR Una mezcla estándar del cóctel de PCR será un buen inicio. la concentración de un primer específico disminuirá. Información de la secuencia terminal de aminoácidos Si estos datos están disponibles pueden ser utilizados como un punto de partida para el diseño de los primers.

Problemas Comunes Algunos problemas que se pueden presentar cuando se utilizan primers degenerados son: • • • • Inhibición competitiva debido a la alta degeneración del primer (los primers se alinean al DNA correcto pero no son extendidos por la polimerasa debido a los extremos 3 ' inestables dando como resultado que los primeros ciclos de PCR sean altamente ineficaces. pueden dar lugar al apareamiento no específico dependiendo del templado. DNA templado. Aunque los primers degenerados se pueden utilizar directamente para secuenciar. 4-5 de los primeros ciclos de PCR se pueden correr con una temperatura de alineamiento 5-10 o C más bajo que la temperatura de alineamiento para amplificar los primers con múltiples “mismatches”.Los ciclos de PCR (el termociclador) Se requiere de mucha experimentación y optimización.   Controles Si se amplifica un gen usando los primers diseñadas de un alineamiento es conveniente hacer un dot blot que consiste en un control positivo. el producto se puede secuenciar o clonar directamente. Esto puede ser superado aumentando ciclos de PCR o utilizando 25-30 ciclos estándares seguidos por otra reacción de 30-35 ciclos usando el primer producto como templado Concentración baja del primer específico debido a la alta degeneración. Se debe considerar la viabilidad de la polimerasa para 50 ciclos. esto puede ser corregido fácilmente aumentando la concentración del primer La DNA polimerasa con actividad exonucleasa 3'-5’ no debe ser utilizada ya que degradan los primers (la Taq polimerasa trabajará muy bien) Apareamiento falso o no específico debido a los primers altamente degenerados o al templado que contiene muchos sitios de alineamiento. La secuenciación de los productos permite el uso de los sitios del primer situados generalmente en los flancos del vector. después se procede optimizando la temperatura de alineamiento del primer. Se comienza con las condiciones estándar. algo de gDNA relacionado y un gDNA distante para comprobar una posible contaminación. Se puede intentar la optimización de la temperatura del alineamiento o el reajuste de los primers Secuenciación Después de que la banda del tamaño previsto se haya extraído del gel de agarosa. BLASTX). Se comienza con 35 ciclos y se aumenta a 50 en caso de ser necesario. 30 . Esto debe ser hecho después de secuenciar y asegurar que se tiene la secuencia deseada haciendo un búsqueda en la base de datos (por ejemplo.

o para altas concentraciones de DNA templado. y una polimerasa que posea una actividad exonuclease 3’-5’. La concentración óptima del magnesio se puede afectar por las características y propiedades de la mezcla de reacción. Las concentraciones del primer se pueden fijar dependiendo de las características y las cantidades de DNA. el alineamiento no específico pueden superar la amplificación del producto deseado. el producto de la amplificación puede ser pobre. incluyendo concentraciones de dNTPs. en una concentración más alta. El exceso de Mg2+ tiende a causar productos no específicos que se observan como un barrido de bandas en el gel. Mientras que altas concentraciones se prefieren para templados de poca complejidad tales como DNA de plásmido. La eficiencia disminuye drásticamente cuando se incorporan las bases incorrectas. La concentración óptima de los primers está en un rango de 0.1 a 1. Por lo tanto. tal como DNA genómico humano. En una concentración más baja que la óptima. la amplificación de fragmentos largos de DNA puede llevarse a cabo (Figura 16). de los primers y los agentes quelantes que contenga el templado. que esté presente en una concentración más baja. Figura 16. Long PCR Aspectos Generales Al usar la PCR para amplificar fragmentos de más de 10 kbp es esencial la preparación de muestras intactas (libre de mellas) y completamente purificadas con varios pasos de extracción y purificación. Por otra parte. mientras que el Mg2+ escaso puede generar menos productos amplificados.LONG PCR Para llevar a cabo esta técnica de manera eficiente es necesario el uso de dos polimerasas: una polimerasa principal en la reacción que no tenga actividad de proofreading. o para cantidades limitadas de DNA templado. 31 . Bajas concentraciones de primer se recomiendan para DNA altamente complejo. La actividad exonucleasa 3’-5’ elimina estos errores en las bases y hace que la reacción posterior proceda.0 mM.

Cada fracción contiene la misma concentración de buffer. La temperatura óptima de alineamiento experimental se determina en un rango de 45-68°C. El número óptimo de ciclos es alrededor 25 a 30 ciclos considerando la cantidad o la complejidad del DNA templado y la longitud de los fragmentos amplificados de la DNA. Ciclos 1-15 94ºC 10 segundos. PCR in situ La hibridación in situ (ISH) ha demostrado ser una herramienta molecular muy importante en diagnóstico y la investigación y ha avanzado perceptiblemente el estudio de la estructura y de la expresión del gen a nivel de células individuales. Una tercera estrategia que emplea la PCR es la amplificación basada en las 32 . para desnaturalizar. las estrategias para mejorar los límites de detección en estudios de ISH han incluido protocolos que amplifican la detección de la señal. un obstáculo de la detección que pueda ahora ser superado gracias a las nuevas tecnologías. Después se agrega la fracción de la polimerasa durante el primer paso de alineamiento y extensión. la utilidad de ISH es limitada por la sensibilidad de cerca de 20 copias del mRNA por la célula. Programa genérico para Long PCR para el Perkin Elmer 9600 • • • Inicial desnaturalizando a 94ºC durante 10-15 segundos. La reacción se divide en dos partes: una fracción de templado/primer que es 3/4 o 4/5 del volumen de la reacción. Se recomiendan condiciones de desnaturalización de 20 segundos en 98°C o 30 segundos en 94°C. Se pone la fracción de templado/primer en el tubo y se calienta en la máquina de PCR a 94ºC por 10 segundos. y una fracción de la polimerasa que constituye el resto. En años recientes. Un tiempo de la desnaturalización demasiado largo o una temperatura de la desnaturalización demasiado alta puede no generar ningún producto identificable. Un tiempo de la desnaturalización demasiado corto o una temperatura demasiado baja puede causar una eficiencia pobre en la amplificación. Hot Start Se puede utilizar el método de hot start para hacer una Long PCR.Para establecer la concentración de enzima deben ser consideradas la cantidad o la complejidad del DNA templado y de la longitud del fragmento amplificado. 68ºC por n minutos (15 veces) Ciclos 16-30 94ºC. La eficacia de la amplificación puede ser disminuida cuando la concentración de la enzima es baja. o incrementando la cantidad de sondas de hibridación usando cócteles del oligonucléotido o múltiples sondas de cRNA. el buffer y agua. el resto de los componentes se incluyen en la fracción de templado/primer. Sin embargo. La fracción de la polimerasa contiene solamente la polimerasa. 10 segundos. Exceso de la enzima puede causar reacciones no específicas. 68ºC por n minutos +15 segundos/ciclo (15 veces) Los 15 segundos por ciclo para los ciclos 16-30 puede ser necesaria para solamente fragmentos más largos (20 Kb).

La PCR in situ en las laminillas de cristal es realizada sobreponiendo las muestras con la mezcla de PCR debajo de una tira que se sella con cera o aceite mineral para prevenir la evaporación de la mezcla de reacción. La amplificación de PCR de las secuencias blanco se realiza después en las células intactas en tubos micro-Eppendorf o directamente en preparaciones citocentrifugadas o secciones del tejido fino en laminillas de cristal (Figura 17). un mecanismo para ciclación y el material celular en la solución o en laminillas de cristal Antes de llevar a cabo la PCR in situ.secuencias de nucleótidos del blanco. PCR in situ Las células en la mezcla de reacción de PCR son termocicladas en tubos microEppendorf usando cicladores convencionales de bloque. 3H-CTP o biotina-16-dUTP) que se han incorporado en los productos de PCR (PCR in situ directa) 33 . las células o las muestras del tejido fino son fijadas y permeabilizadas para preservar la morfología y permitir el acceso de los reactivos de PCR a las secuencias intracelulares que se quieren amplificar. Un ciclo térmico se completa poniendo las laminillas de cristal sobre los bloques de calentamiento de un termociclador convencional o diseñado especialmente o usando hornos que completan un ciclo térmico. Después de la PCR las células son citocentrifugadas sobre las laminillas de cristal con la visualización de los productos intracelulares de PCR por ISH o inmunohistoquímica. fluoresceina-dUTP. Figura 17. Esta estrategia fue desarrollada independientemente por varios laboratorios en 1980 Principios y métodos Los aspectos importantes para la PCR in situ incluyen la fijación y la permeabilización durante la preparación de la muestra. La detección de los productos de PCR intracelular se realiza por dos técnicas diferentes: 1) Indirectamente por ISH con sondas específicas para el producto de PCR (PCR in situ indirecto) 2) Sin ISH con la detección directa de los nucleótidos etiquetados (digoxigenina-11dUTP.

Nested PCR CLONACIÓN DE PRODUCTOS DE PCR Para conseguir una mayor eficiencia en varios usos del “downstream” (por ejemplo. preparación de sondas marcadas para hibridización) los productos de PCR se clonan a menudo en vectores apropiados (Figura 19). Se usa frecuentemente en diagnóstico médico. el producto de amplificación de la primera PCR es el molde de la segunda.OTRAS VARIANTES DE LA PCR Multiplex PCR Es una PCR en la cual hay múltiples pares de primers (hasta 8) lo que da una serie de productos. Éstos pueden verse como múltiples bandas en un gel de azarosa. especialmente en el caso de muestras de baja calidad o con un pequeño númerode copias de la secuencia a amplificar. secuenciación. apareciendo un barrido. de forma que en la segunda PCR se utilizan unos primers contenidos en la secuencia amplificada en la primera reacción (Figura 18). Ahorra templado. A veces 1 ronda de PCR no da un producto único a partir de un templado complejo. Requiere una cuidadosa optimización Nested PCR Consiste en dos procesos de amplificación sucesivos. tiempo y gastos. Es decir. la expresión de genes. 34 . la transcripción in vitro. Se aplica cuando se quiere mejorar la sensibilidad y especificidad de la técnica. Figura 18. Se obtiene un producto único porque solo el fragmento correcto de ADN posee los sitios correctos de hibridización para el segundo par de primers. Se puede resolver utilizando un segundo par de primers que hibriden un poco más internamente que los primeros.

Los productos de PCR con esa extensión del adeninas en el extremo 3' se pueden clonar en un vector que contiene timidinas 3' complementarias (clonación TA). el tipo de polimerasa usado. para la expresión de proteínas. la Tth polimerasa) tienen estas características y por lo tanto se pueden utilizar para la clonación TA. Por otra parte. Para elegir un método. Las polimerasas usadas para el método de clonación TA deben exhibir actividad de transferasa terminal y carecer de actividad exonucleasa 3'-5’. y la longitud del producto de PCR. como el propósito de la clonación. Por ejemplo. Para facilitar la clonación de los productos de PCR. el sitio de restricción de Xcm I tiene que ser introducido por inserción de un oligonucleótido sintético en el sitio de clonación. Clonación de productos de PCR La clonación del DNA amplificado es a menudo un paso difícil en el análisis de los productos de PCR. se han desarrollado varias técnicas. un método que permita la clonación direccional es útil. Alternativamente. Sin embargo. Clonación TA La Taq polimerasa tiene una actividad transferasa terminal que agrega preferencialmente adenina a los extremos 3' de los productos de PCR. se deben considerar varios factores. Además de la Taq polimerasa. Los vectores T pueden ser hechos usando una enzima de restricción como la XcmI. debido a que Xcm I tiene una secuencia de reconocimiento poco común. la clonación en vectores con extremos romos (blunt end) puede ser conveniente. si se utiliza una polimerasa con actividad de “proofreading” para un estudio mutagénesis sitio-dirigido. varias DNA polimerasas (por ejemplo.Figura 19. los vectores T se pueden preparar por la adición enzimática de un solo residuo de timidilato con la transferasa terminal y el ddTTP o la Taq polimerasa y el dTTP. 35 .

la enzima de restricción elegida podría potencialmente reconocer y cortar los sitios dentro del producto. puesto que la secuencia del producto de PCR es a menudo desconocida. Otro método que utiliza los primers modificados es la clonación con ligaduraindependiente En la clonación mediada por la uracil glicosilasa. Los extremos 3' de una sola cadena que resultan se pueden entonces alinear a los extremos complementarios del vector y las moléculas quiméricas de DNA que resultan se transforman sin ligación in vitro. Existen técnicas que permiten remover una sola extensión de nucleótidos de los productos de PCR generados con la Taq polimerasa. Después de que los residuos de dUMP sean quitados por uracil DNA glicosilasa. Algunas enzimas de restricción no pueden cortar en las secuencias localizadas cerca de los extremos del DNA de doble cadena lineal. La incorporación de estos primers durante la PCR da lugar a la colocación selectiva de los residuos de dUMP en el extremo 5' de los productos de la amplificación. estos productos de PCR se pueden también clonar por la ligación de extremos romos en un vector conveniente. Los productos de PCR generados por estas polimerasas se pueden clonar en vectores con extremos romos. Después de la PCR. el fragmento de DNA amplificado se digiere con la enzima de restricción apropiada y se liga en un vector linearizado. Varios métodos de clonación requieren la modificación de los primers de PCR para mejorar la eficacia de la clonación y facilitar la clonación direccional de los productos de PCR. 36 . Generalmente la clonación de extremos romos de los productos de PCR (o de cualquier DNA) en plásmidos es menos eficiente que la clonación extremos cohesivos. Clonación direccional a través de primers modificados. una enzima de restricción poco común se agrega a la mezcla de ligación para linearizar cualquier vector ligado a sí mismo formado durante la reacción. Mientras que procede la amplificación.Clonación de extremos romos Las DNA polimerasas con actividad exonucleasa 3'-5' remueve los nucleótidos mal apareados de los extremos 3' del DNA de doble cadena y genera productos con extremos romos. los lados apirimídicos que resultan son susceptibles a ser cortados por las condiciones alcalinas. los extremos 5' de los primers de PCR son parcialmente complementarios a las secuencias del vector y contienen varios residuos de dUMP. Por lo tanto se ha desarrollado una variación más eficiente del método de clonación de extremos romos. En este método. estos primers se incorporan en el producto de PCR. Un método común para una clonación direccional eficiente es introducir sitios de restricción adicionales en el extremo 5' de cada uno de los primers. Además.

Figura 20. Se utilizan los productos en otra reacción para producir el ADN mutado de longitud completa. El producto modificado de PCR que resulta se puede clonar fácilmente en un vector linearizado con las bases complementarias. Mutagénesis con PCR-extensión solapada El método de extensión solapada (Figura 20) requiere 2 primers mutagénicos y otros 2.Un ejemplo de clonación direccional que no requiere primers especiales es la clonación direccional basada en la Exonucleasa III. Recientemente. Amplifica un fragmento 5´ y un fragmento 3´ que se solapan. Método de extensión solapada 37 . Bajo condiciones controladas de reacción. Ambos portan la mutación. MUTAGÉNESIS POR PCR Consiste en introducir cambios de secuencia dentro de fragmentos (clonados) de ADN. un método basado en cósmidos se ha desarrollado para clonar fragmentos de hasta 36 KB con alta eficiencia. La clonación eficiente de fragmentos largos de DNA se puede alcanzar solamente con vectores cosmidos y sistemas de empaquetado. Clonación de fragmentos largos de DNA Usando mezclas de diversas polimerasas se ha podido amplificar blancos largos de DNA. Para la clonación de productos grandes de PCR (mayor de 10 KB) el uso de vectores basados en plásmidos es difícil porque la capacidad de clonación en vectores es limitada. la actividad exonucleasa 3'-5' de la Exonucleasa III se puede utilizar para degradar el producto de PCR de los extremos 3' de ambas cadenas.

se genera con un primer degenerado. El gen de interés es amplificado con una ADN polimerasa en condiciones donde la fidelidad transcripcional es baja y se introducen errores en las copias generadas. Dado que la mayoría de las mutaciones no son beneficiosas. La solución a este problema es usar trinucleótidos presintetizados (codones) para todos los 20 aminoácidos como bloques de construcción para la síntesis de ADN de los oligonucleótidos. Los métodos de PCR sitio-dirigidos permiten así que las mutaciones sitio-específicas sean incorporadas en cualquier plasmido de doble cadena. en lugar de utilizar los mononucleótidos convencionales. ha sido históricamente la necesidad de separar los filamentos complementarios para evitar el realineamiento. Desafortunadamente. Este proceso se asemeja al “crossingover” que tiene lugar en los cromosomas de los organismos vivientes. solamente con baja probabilidad y muchas mutaciones beneficiosas serán enmascaradas por las deletéreas. siendo también difícil evitar la incorporación de un codón de terminación. un conjunto de aminoácidos al azar. Luego. la expresión del gen y la modificación del vector. Para introducir mutaciones solamente en una región particular de un gen. por ejemplo. una enzima que corta en forma inespecífica. donde el conjunto de fragmentos de ADN generado por la PCR es digerido por DNasa I. el aminoácido serina es codificado por seis codones diferentes. dos mutaciones favorables se acumularán en el mismo gen. en esta posición particular. se utiliza un segundo método. mientras que triptofano está codificado por un solo codón). En principio. Varios métodos de los métodos reportados requieren de DNA de una sola cadena como templado. puede utilizarse la mutagénesis en cassette por PCR. El fragmento de ADN conteniendo el punto mutado es recortado en dos sitios de restricción flanqueantes. Estos bloques pueden ser mezclados en cualquier proporción y solamente se necesita agregar aquellos trinucleótidos que el investigador desea en esta posición en la secuencia proteica (Figura 21). que puede ligarse exactamente en estos sitios de restricción. La razón de esto. 38 . El uso de PCR en mutagénesis sitio-dirigida logra la separación de las hebras usando un paso de desnaturalización que separa las hebras complementarias y permitiendo la polimerización eficiente de las primers de PCR. un producto de PCR. por lo tanto. Este iniciador se sintetiza químicamente para llevar una mezcla al azar de nucleótidos en uno o más codones y la proteína codificada lleva. cada mutación puede ser recombinada y propagada individual e independientemente de otras mutaciones.Mutagénesis sitio dirigida La mutagénesis sitio-dirigida in vitro es una técnica invaluable para estudiar relaciones de la estructura-función de proteínas. y se reensamblan los trozos por PCR. Para combinar varias mutaciones deseables. un codón completamente formado al azar exhibirá una fuerte desviación hacia algunos aminoácidos que son codificados por más de un codón.

El panel (C) muestra el principio de PCR utilizando un “primer degenerado”. Estrategias para mutagénesis. Amplificar e identificar las secuencias blanco in situ. mediante PCR. por la presencia de las desfavorables. por lo tanto. Una posible solución a este problema. Así. Genere sondas de hibridación específicas para cromosoma. generalmente. la PCR lo ha hecho posible: • • • • Usar las secuencias repetidas en el genoma como marcadores genéticos. subsecuentemente. las moléculas contendrán alguna de cualquier tipo. Estudiar la evolución de las secuencias de un gen y los efectos de variabilidad de la secuencia en la función del cromosoma. cruzadas y los genes con el mayor número de mutaciones favorables pueden ser enriquecido por selección. Este “primer” o iniciador contiene una mezcla de todos los cuatro posibles nucleótidos (abreviados en la letra N) en una posición determinada o. alternativamente. El producto de PCR se corta en pequeños trozos. En ciclos sucesivos de PCR. un grupo “randomizado” de aminoácidos en esta posición. Las mutaciones quedan. se introducen más mutaciones de cada tipo y. 39 . las favorables (cuadrados) y las desfavorables (círculos). una mezcla de codones ensamblados a partir de trinucleótidos. utilizando la enzima ADNasa I y se reensamblan.Figura 21. En el panel (A) se muestra en forma esquemática el proceso de PCR “sujeto a error”. con el fin de obtener las modificaciones localizadas o en genes enteros. Por ejemplo. Además de generar cantidades grandes de templado para secuenciar. Se muestran dos tipos de mutaciones. Las proteínas sintetizadas a partir de este gen llevarán. se muestra en el panel (B) y se conoce como “mezclado de ADN”. completamente.   APLICACIONES ESPECIALES DE LA PCR Durante los últimos años. la PCR se ha utilizado para el mapeo de cromosomas y para analizar cambios grandes y pequeños en estructura cromosómica. como una estrategia para la distribución no dirigida de mutaciones en un gen de interés. la PCR se ha convertido en una herramienta importante para analizar el genoma humano. por lo tanto. el efecto benéfico de las mutaciones favorables puede ser opacado.

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