Fundamentos de la reacción en cadena de la polimeraza y la de tiempo real

¿Qué es la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR punto final)?

La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR, Polymerase Chain Reaction) amplifica una

secuencia de DNA mediante ciclos repetidos de separación de cadenas y replicación del DNA.

Con la PCR cada DNA recién sintetizado se convierte en una molécula molde para generar más,
creando así una reacción en cadena que genera copias de DNA de manera exponencial.

La PCR ha revolucionado la biología debido a su capacidad de utilizar cantidades

infinitesimalmente pequeñas de DNA y amplificarlo en cantidades susceptibles de análisis
utilizando a la enzima DNA polimerasa, que es la encargada de sintetizar nuevas copias de
DNA.

¿Cómo funciona la PCR?

La PCR típica en realidad, amplifica solo una región o secuencia diana elegida dentro de una
muestra compleja de DNA mediante dos pequeñas moléculas de DNA monocatenario llamados
iniciadores (primers o cebadores) de PCR.

Los iniciadores de PCR son la clave para amplificar solo una secuencia diana definida de una
muestra compleja, incluso tan compleja como una muestra de DNA aislada de suelo o agua,
que puede contener millones de fragmentos diferentes de DNA de los microbios que habitan
estos entornos.

El primer paso en la PCR es mezclar los siguientes componentes o ingredientes en un tubo:

1. La molécula de DNA original o el DNA diana en una pequeña cantidad es suficiente. El

DNA diana puede ser parte de una muestra de DNA compleja, que contiene múltiples
genomas de diferentes organismos, pero también podría ser tan simple como un
fragmento de DNA previamente amplificado por PCR.

2. Se necesitan dos iniciadores de PCR para comenzar la síntesis de DNA. Estos son
fragmentos cortos de DNA monocatenario que son complementarios a las secuencias
en cada extremo del segmento de DNA diana. Estos iniciadores se obtienen mediante
síntesis química de DNA.

3. Se necesita DNA polimerasa para sintetizar las copias de DNA. La PCR implica varios
pasos de alta temperatura, por lo que se requiere una DNA polimerasa resistente al
calor. Las polimerasas termoestables se aíslan de bacterias que viven en ambientes a
temperaturas de hasta 90 ºC o más. La DNA polimerasa Taq de Thermus aquaticus es
la más usada, pero muchas especies diferentes de bacterias termófilas han
proporcionado características mejoradas para realizar copias de una secuencia de DNA
diana durante la PCR.

4. La DNA polimerasa necesita un suministro de nucleótidos, o bloques de construcción

para el nuevo DNA, con el objetivo de sintetizar las nuevas copias. Estos se suministran
como desoxinucleósidos trifosfatos (dNTP).

5. Una solución amortiguadora o tampón que contiene las concentraciones adecuadas de

iones y pH que garantizan las condiciones óptimas.
El segundo paso de la PCR es colocar el tubo con los ingredientes en una máquina especial
llamada máquina de PCR o termociclador, que es capaz de alternar la temperatura del tubo de
reacción de PCR de forma rápida y precisa.

Aplicaciones de PCR punto final

No es sorprendente que la PCR haya encontrado aplicaciones en todos los campos de la

biología molecular y la biotecnología, tanto básica como aplicada. Estos incluyen análisis y
manipulación de DNA, construcción de plantas y animales transgénicos, ciencia forense,
diagnóstico médico, terapia génica y análisis ambiental.

En teoría, la PCR amplifica el DNA de manera exponencial, duplicando el número de moléculas

diana con cada ciclo de amplificación. Cuando se desarrolló por primera vez, los científicos
razonaron que el número de ciclos y la cantidad de producto final de la PCR podrían usarse
para calcular la cantidad inicial de material genético en comparación con un estándar
conocido. Para abordar la necesidad de una cuantificación sólida, se desarrolló la técnica de
PCR en tiempo real.

Actualmente, una aplicación principal de la PCR de punto final es amplificar DNA específico
para secuenciar, clonar y usar en distintas técnicas de biología molecular.

PCR en tiempo real

La prueba se basa en la reacción en cadena de la ADN polimerasa (PCR por sus siglas en inglés)
donde un fragmento de ADN conocido es copiado y amplificado billones de veces. El producto
del PCR (punto final) es posteriormente visualizado en un gel de agarosa y proporciona
evidencia cualitativa de la presencia de ese fragmento de ADN en la muestra.

La PCR en tiempo real es una modalidad del PCR de punto final, donde la acumulación de ADN
amplificado es detectado y cuantificado a medida que la reacción avanza, es decir: “En tiempo
real” esto se logra incorporando una molécula fluorescente que se asocia al ADN amplificado,
donde el incremento de esta fluorescencia es la proporcional al incremento de la cantidad de
moléculas de ADN amplificadas en la reacción.

Aplicaciones tecnológicas

Si bien el uso más ampliamente difundido de la Q-PCR consiste en la evaluación de la

expresión génica de genes concretos de forma relativa (empleando ARNm de la muestra y
retrotranscribiéndolo a ADNc, que se mide mediante esta técnica), se han desarrollado otras
aplicaciones fuera del entorno puramente académico. Las aplicaciones de impacto en la
industria incluyen la cuantificación de carga microbiana en alimentos o en material vegetal, la
detección de OGM (organismos genéticamente modificados) y la cuantificación y genotipado
de patógenos virales en humanos.

Usos en diagnóstico

La PCR cuantitativa se utiliza para el diagnóstico de enfermedades, tales como enfermedades

infecciosas, cáncer y anormalidades genéticas. La introducción de ensayos de PCR cuantitativa
en laboratorios de microbiología ha mejorado el diagnóstico de enfermedades infecciosas y se
utiliza además como herramienta para detectar nuevas enfermedades emergentes.

Usos microbiológicos
La Q-PCR es utilizada también por microbiólogos en el campo de seguridad y deterioro de los
alimentos, riesgo microbiológico en la calidad del agua y en la protección de la salud pública.

Usos en investigación

En el campo de la investigación, la PCR cuantitativa se utiliza mayormente para mediciones

cuantitativas de la transcripción y expresión génica, determinando como cambia la expresión
de un gen concreto a lo largo del tiempo o en determinadas condiciones como la
administración de un fármaco, y analizando la respuesta de las células de un tejido al mismo,
además del progreso de la diferenciación celular o respuestas frente a cambios en las
condiciones ambientales. También se utiliza para determinar la cigosidad de animales
transgénicos utilizados en investigación, es decir, determinar la homocigosis o heterocigosis de
un individuo para un determinado gen.