EXTRACCION Y ELECTROFORESIS DE ADN

BACTERIANO
Karen Molina Atuesta – Natalia Barreto Lesmes – Belkys Vasquez Coronel
Facultad de Salud – Universidad de Santander- Semestre 2019-A

Resumen
El laboratorio de Biología Molecular y Genética se basó en una de los diferentes métodos de
extracción de ADN genómico, en este caso el Kit Qiagen, el cual se utilizó para extraer y
purificar una de las moléculas con más importancia en la vida molecular como lo es la que
contiene la información genética, para tener éxito en esta práctica se tuvo en cuentas las
indicaciones registradas en el manual de uso y conocimiento previo de lo que se realizó, es
decir, lo que ocurría con el cultivo bacteriano , como: el rompimiento celular o lisis, la unión
del ADN a diferentes columnas, la purificación de la molécula mediante un lavado y elución
para finalmente tener un almacenamiento en condiciones ambientales adecuadas para su
conservación; además la manipulación adecuada de la micropipeta fue un aspecto
fundamental, ya que se usó pequeñas cantidades de cada reactivo que debían ser exactas para
no alterar los resultados. Todo este proceso se realizó con el fin de adquirir diversos
conocimientos y destrezas, que promueven la importancia de la realización adecuada de los
diferentes procesos para obtener resultados de calidad, competentes con los estándares
exigidos en el mundo laboral, que son la base de la formación profesional integral.
Por otra parte, se realizó electroforesis para separar e identificar los ácidos nucleicos, el cual
permite visualizar la presencia de estos por medio de luz UV, para ello se requieren una serie
de elementos muy importantes como gel de agarosa, fuente y tanque de electroforesis; el uso
adecuado de estos elementos determina la efectividad de los resultados, en el cual influyen
factores como la temperatura. Estos procesos son simples, rápidos y ayudan a adquirir
destrezas en la determinación de la presencia e integridad del ADN en una muestra puesta en
análisis.

Palabras claves: ADN, lisis lavado, elución, extracción, purificación, electroforesis,

agarosa, luz UV

Introducción
El Kit DNeasy Ultra Clean Microbial proporciona la extracción y purificación de ADN
genómico de bacterias. Está diseñado para una rápida y eficiente obtención de ADN
genómico de alta calidad a partir de una variedad de especies bacterianas. (Qiagen, 2017)
Las células microbianas se agregan a un tubo de batido de perlas que contiene perlas, solución
de perlas y solución de lisis. El principal es lisar los microorganismos mediante una
combinación de calor, detergente y fuerza mecánica utilizando un tubo optimizado para batir
las cuentas. Las células se lisan utilizando un vortex. El ADN liberado se une luego a un
filtro de sílice, se lava y el ADN se recupera en un tampón Tris certificado libre de ADN.
(Qiagen, 2016)
Este procedimiento estándar demora menos de 30 minutos desde que las células bacterianas
hayan sufrido lisis. El desempeño es correcto y puede variar conforme a la especie de la
bacteria y a la edad de cultivo. (Qiagen, 2018)
Por otra parte, para separar e identificar el ADN se utiliza una técnica llamada electroforesis.
La electroforesis constituye parte importante del procedimiento rutinario del análisis de los
ácidos nucleicos y proteínas. La electroforesis nos ayuda a observar los ácidos nucleicos y
proteínas al final del procedimiento.
El principio básico de la electroforesis consiste en la migración de las moléculas a través de
un gel, La agarosa que es un polisacárido, cuyas disoluciones (típicamente de 0.5 a 2 %)
poseen la propiedad de permanecer liquidas por encima de 50 grados C y formar un gel,
semisólido al enfriarse. Este gel está constituido por una matriz o trama tridimensional de
fibras poliméricas embebida en gran cantidad de medio líquido, que retarda el paso de las
moléculas, se usa usualmente para separar moléculas grandes de alrededor 20.000
nucleótidos, en el cual, por acción de un campo eléctrico, serán separadas de acuerdo a su
tamaño o peso molecular. Para controlar el avance de la separación de las moléculas en la
matriz y establecer un patrón de fragmentos, las moléculas deberán ser teñidas con diferentes
colorantes. Estos pasos facilitan la visualización de las moléculas a manera de simples bandas
las cuales serán posteriormente analizadas e interpretadas. (Karina T. 2009)

Objetivo
Realizar la extracción de ADN bacteriano mediante el uso del kit comercial Dneasy Ultra
Clean Microbial, con el fin de entender el fundamento del procedimiento a través de la
descripción de los pasos implicados. Además, identificar y utilizar los equipos, elementos y
reactivos en la electroforesis para verificar la presencia e integridad de una muestra de ADN
mediante el gel de agarosa.

Materiales y Métodos

Materiales y equipos
 Puntas amarillas
 Puntas azules
 Puntas blancas
 Tubos eppendorf
 Sharpie punta delgada
 Probeta de 250ml
 Probeta de 100ml
 Probeta de 50ml
 Gradilla
 Cámara de electroforesis
 Trasiluminador
  Fuente de poder
 Centrifuga
 Vortex
 Micropipeta de 1000 microlitros
 Micropipeta de 100 a 200 microlitos
 Micropipeta de 1 a 10 microlitros
 Refrigerador
 Peachimetro

Reactivos
 Los que provee el kit Dneasy Ultra Clean Microbial
 Agarosa
 Agua desionizada estéril
 Tris base
 Acido bórico
 EDTA
 Glicerol
 Azul de bromofenol
 Xilencianol
 Gel red
 Marcador de peso molecular
 Buffer de carga
 Buffer de corrida

Al iniciar la experiencia en el laboratorio la docente llevo a cabo una introducción del tema
sobre el fundamento de la extracción del ADN, luego se realizó la descripción de la
metodología a utilizar para la extracción de ADN con el kit comercial ´´Dneasy Ultra Clean
Microbial´´. Después, la docente enseño la importancia de la adecuada extracción y
purificación del ADN y sus implicaciones en los ensayos posteriores.
En la segunda parte del laboratorio que fue el procedimiento de electroforesis del ADN a
partir de un cultivo bacteriano, se inició con la explicación sobre la adecuada preparación de
agarosa y preparación del gel. Posterior a esto, se realizó la preparación del buffer de corrida
y de carga de las muestras para geles de agarosa. Finalmente, la docente enseñó el principio
de la corrida electroforética y su importancia.
Actividad

Tabla 1. Comparación de dos protocolos empleados para la extracción de ADN

genómico
MÉTODO FENOL-CLOROFORMO MÉTODO DEL ACETATO DE POTASIO

FUNDAMENTO: El protocolo de extracción de ADN FUNDAMENTO: Es un método con el que se obtiene

al CTAB (GARDES & BRUNS, 1993) permite
obtener un ADN libre de proteínas y enzimas. Se ha
utilizado con aquellas muestras cuyo ADN
amplificado se quería secuenciar y tanto a partir de las
células obtenidas en cultivo, (basidiósporas o micelio)
como de teliósporas en aquellos casos en los que no
hemos podido conseguir la germinación.
un alto rendimiento y pureza del ADN en el menor
tiempo y costo, para su utilización como molde en la
técnica de ADN polimórfico amplificado al azar
(RAPD [la cual es un método simple para detectar el
polimorfismo genético del ADN]) y probablemente en
otras técnicas moleculares basadas en la amplificación
por la reacción en cadena de la polimerasa.

Semejanzas:
-Sus respectivas centrifugaciones a 8 000 g por 10 min
a 4 °C.
-El ADN se precipitó con 2 volúmenes de etanol
absoluto durante 30 min a - 20 °C.
-Precipitación de ADN genómico que se obtuvo por
centrifugación a 10 000 g durante 20 min se lavó con
etanol 70 %.
-El ADN fue resuspendido finalmente en 50 mL de
tampón tris-EDTA (TE) (tris-HCl 1 mM pH 8,0;
EDTA 1 mM pH 8,0). El ARN presente en la muestra
se digirió con la adición de Raso H (Boehringer
Mannheim, Germany), incubándose durante 1 h a 37
°C. Seguidamente se realizó una extracción empleando
un volumen de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1) y
el sobrenadante se conservó a - 20 °C.
Semejanzas:
-Su centrifugación a 8 000 g durante 10 min a 4 ºC
donde se colectó la fase acuosa.
- El ADN se precipitó a - 20 ºC durante 30 min en
presencia de 2 volúmenes de etanol absoluto
-Se centrifugó la mezcla a 10 000 g durante 20 min y
el precipitado se lavó con etanol (70 %).
-El ADN se disolvió en 50 µL de tampón TE. El ARN
restante se eliminó con RNAsa H (Boehringer
Mannheim), la suspensión se incubó a 37 ºC durante 1
h. Después de extraer con igual volumen de
cloroformo-alcohol isoamílico (24:1), la fase acuosa se
conservó a - 20 °C.

Diferencias:
-El mecanismo del procedimiento ya que la plata fue
homogeneizada de forma manual en nitrógeno líquido
y 1 mL de tampón de lisis (tris-HCl 50mM pH 8,25;
EDTA 50 mM; NaCl 50 mM; SDS 1 %).
Diferencias:
-El mecanismo del procedimiento ya que la plata fue
homogeneizada de forma manual en 100 µL de tampón
de lisis (NaCl 0,1 M; sacarosa 0,2 M; EDTA 50 mM;
tris-HCl 100 mM pH 8,25; SDS 0,05 %).

-La suspensión se incubó con 2 mg/mL de proteinasa -La suspensión se incubó durante 30 min a 65 °C.
K (Boehringer Mannheim) toda la noche a 37 °C
-Los ácidos nucleicos se extrajeron adicionando 14 µL
-Realiza 3 extracciones de proteínas con igual de acetato de potasio 8 M incubándose en hielo durante
volumen de fenol, fenol-cloroformo-alcohol 15 min. Nodarse
isoamílico (25:24:1) y cloroformo-alcohol isoamílico
(24:1).

Nota: tomada de Nodarse J, et al. (2004)

Buffers de corrida electroforética y sus componentes

Hay dos soluciones tampón muy usadas para separación de fragmentos de ADN mediante
electroforesis, son el buffer TBE y buffer TAE, que sólo se diferencian en un compuesto,
ácido bórico y ácido acético respectivamente.

Componentes:
– Tris (Tris-(hidroximetil)-aminometano): Molécula responsable del tamponamiento.
Regulación del pH.
– Ácido Bórico/Ácido Acético: contribuye a ajustar el pH deseado e igual que el anterior, a
mantenerlo.
– EDTA (Ácido Etilendiaminotetraacético): quemante de cationes divalentes, cuya función
es secuestrar Mg2+, con lo que se evita que las posibles nucleasas presentes degraden el ADN
de la muestra, ya que la mayoría de las nucleasas requieren de Mg2+ como cofactor. (Gómez,
2012)

Factores que afectan la velocidad de migración del DNA en geles de agarosa

-Tamaño molecular del ADN: las moléculas más grandes migran más lentamente a causa
de que su arrastre friccional es mayor.
-Concentración de la agarosa
-Conformación del ADN: La forma del DNA circular, circular- superhelicoidal y lineal, del
mismo peso molecular, migran a través de los geles de agarosa a diferentes velocidades.
-Voltaje aplicado: La velocidad de migración de fragmentos de DNA lineal es proporcional
a el voltaje aplicado.
- Presencia de Colorantes intercalados: El bromuro de Etidium, un colorante fluorescente,
usado para detectar DNA en geles de agarosa, reduce la movilidad electroforética de DNA
lineal cerca del 15%. El colorante se intercala entre las pares de bases, extendiendo la
longitud de la molécula del DNA haciéndola más rígida.
-Composición del Buffer de Electroforesis: la movilidad electroforética del DNA es afectada
por la composición y la fuerza iónica del buffer de Corrido electroforético. En ausencia de
iones la conducción eléctrica es mínima y el DNA migra muy lentamente. Con búferes de
alta fuerza iónica, la conductividad eléctrica es eficiente, pero sé genera cantidades
significativas de calor. (Sánchez S. 2013).

Importancia de la luz ultravioleta para visualizar el ADN al realizar la corrida

electroforética

Es de gran importancia porque a los geles de agarosa, se le añade bromuro de etidio, sustancia
que se intercala entre las bases del DNA y es fluorescente cuando se ilumina con luz
ultravioleta, la cual permite la identificación de presencia e integridad de los ácidos nucleicos.
(Sharp P. 1973)
Función del bromuro de etidio y el Gel Red en la visualización de ácidos nucleicos

- El bromuro de etidio (BrEt) es un agente intercalante usado comúnmente como aclarador

de ácidos nucleicos en laboratorios de biología molecular para procesos como
la electroforesis en gel de agarosa. Cuando se expone esta sustancia a luz ultravioleta, emite
una luz roja-anaranjada, que se intensifica unas 20 veces después de haberse unido a una
cadena de ADN. Este efecto es debido al aumento de la hidrofobia del medio, y no a la
rigidificación del anillo bencénico, no estando éste entre pares de bases del ADN. Como el
bromuro de etidio se intercala en el ADN, esta sustancia tiene un poderoso efecto mutágeno
y, posiblemente puede ser cancerígeno o teratógeno. (Armour M. 2003)

- GelRed es un tinte fluorescente, de Biotium, para ácidos nucleicos ultra sensible,

extremadamente estable y ambientalmente seguro, diseñado para reemplazar al altamente
toxico bromuro de etidio para la tinción de dsDNA, ssDNA o RNA en geles de agarosa o
geles de poliacrilamida. GelRed es mucho más sensible que el bromuro de etidio sin requerir
pasos de desteñido, virtualmente poseen el mismo espectro, así que es posible reemplazar
directamente el Bromuro de etidio por GelRed sin cambiar el sistema de imagen existente.
GelRed puede ser usado para teñir dsDNA o RNA en geles de agarosa, ya sea precorrida
(disuelto en gel caliente) o postcorrida. (Uribe P, et al. 2013)

Efectos biológicos adversos del bromuro de etidio

-El bromuro de etidio es un agente mutagénico de efecto acumulativo, es nocivo por

ingestión, tóxico por inhalación e irritante para los ojos, la piel y las vías respiratorias; debe
ser manipulado única y exclusivamente por personal capacitado.
-Mantener el envase del reactivo cerrado y en refrigeración (entre 2ºC y 8ºC).
-La manipulación de este reactivo debe hacerse en un área acondicionada para este fin
(paredes y pisos lisos, lavatorios de acero cromado, mesas de trabajo fijos preferentemente
de material inerte y resistente a la corrosión, bolsas amarillas para desecho de residuos
especiales, recipientes rígidos para descartar residuos punzocortantes, sistema de
descontaminación de bromuro de etidio, espátulas de plástico, papel toalla en dispensadores
de plástico, entre otros).
-Manipular el reactivo dentro de una campana extractora de gases químicos, considerando
las recomendaciones de la ficha de seguridad y las medidas de bioseguridad correspondientes
(respirador para vapores químicos, gafas de seguridad, guantes de caucho de nitrilo, mandil
manga larga).
-El material usado en el área de trabajo con bromuro de etidio no debe salir del área sin haber
recibido tratamiento previo. (Centro nacional de salud pública. 2006)

Resultados

La muestra utilizada para la extracción de ADN fue tomada de la bacteria E. Coli, la cual el
kit comercial que se uso es llamado Dneasy Ultra Clean Microbial. En donde inicialmente se
tomó con la micropipeta 1ml de la muestra que se encontraba en un tubo de ensayo,
trasvasándola a un tubo de eppendorf. Luego de centrifugar a 10000 x g por 1m se obtuvo la
pastilla o pellet, se realizó una segunda centrifugación con el resto del líquido de E. Coli para
terminar la obtención del pellet. A la pastilla se le añadió 250 μl de una solución formando
una mezcla homogénea cuya finalidad era lisar la célula.

fig 2. Muestra con segunda fig 3. 250 μl de solución para

fig 1. Muestra general de 1ml de lisar la celular + pellet
centrifugación obteniendo pellet
E.coli

Después de agregar la solución para lisar la célula, se realiza la utilización del tubo micro
Beat Tube el cual se le agrega 50 μl de solución SL+ el pellet que contiene la solución
homogenizada de 250 μl. luego se lleva a centrifugar a 10000xg por 1m obteniendo una
muestra de 300 μl donde se le realizo el procedimiento de Vortex. Después, se le agrego 100
μl de solución IRS la cual fue llevada a centrifugar a 10000xg por 1m.

fig 4. Muestra con 50 μl de fig 5. Muestra con 300 μl de fig 6. Muestra con 100 μl de
solución SL+ 250 μl de pellet solución SL y pellet después solución IRS después de
Discusión de centrifugar centrifugar

Una vez finalizada la centrifugación con solución IRS se le agrega 800 μl de Buffer SB a la
solución permitiendo que el ADN se adhiera a la columna. Seguidamente, se pasó 700 μl de
sustancia SB a la membrana MB Spin Column y se centrifugo a 10000xg por 2m. posterior
a esto, se agregan 300 μl de solución de lavado CB, después se agregan 50 μl de solución EB
en la comuna de MB Spin Column. Como producto final se realiza la extracción como tal del
ADN obteniendo la muestra final la cual es dejada en el refrigerador.
 fig 7. Muestra con 800 μl de fig 8. Muestra con 700 μl de fig 9. Muestra con 300 μl de
Buffer SB Buffer SB en la membrana lavado CB
MB Spin Column

fig 10. Muestra con 50 μl fig 11. Muestra final de fig 12. ADN
de solución EB en la extracción de ADN
columna MB Spin Column

Durante la práctica de electroforesis se llevó a cabo el procesamiento para identificación de

ácidos nucleicos, la cual se inició con la preparación de buffer de corrida, el buffer de carga
y el gel por medio de la agarosa para finalmente realizar el proceso de corrida electroforética.
En donde, se cargaron los pozos con el ADN por medio del uso de micropipetas, una vez
realizado lo anterior se conecta a la cámara de electroforesis con un voltaje de 90 a 100
durante 30m.

fig. 13. Inicio de la corrida electroforética fig. 14. Desplegamiento de colorantes de

acuerdo a su peso molecular
La corrida electroforética depende del peso molecular de los reactivos. Durante la práctica se
observó que el reactivo azul claro que es el silencianol corre menos debido a su bajo peso
molecular, esta subrayado de color rojo y el azul oscuro que es el reactivo bromofenol corre
más rápido debido a su mayor peso molecular esta subrayado de color negro.

fig. 15. Diferencia en el desplegamiento de los

dos reactivos según el peso molecular

El producto final del proceso de electroforesis es la visualización de bandas del ADN, la cual
se realizó por medio del trasiluminador con luz UV, en donde se observaron las diferentes
bandas del marcador molecular y las bandas del ADN genómico.

fig. 16. Visualización de las bandas del ADN

Discusión
Al realizar la prueba de extracción y purificación se observó que el kit utilizado, en este caso
el Kit Qiagen, tiene diversos químicos, los cuales varían según la casa comercial, pero tienen
la misma función.
Hay diferentes métodos de extracción de ADN, que se utilizan según el tipo cultivo, los
cuales resultan en diferente pureza y rendimiento de ADN. Algunos de los métodos han sido
evaluados sistemáticamente para aplicaciones específicas tales como muestras de suelo y
sedimento, microbioma humano, y muestras fecales. ( Peng X, et al. 2013)
El método utilizado es uno de los mas efectivos, a que existen diversos métodos artesanales
para la extracción de ADN bacteriano, como el de fenol-cloroformo en el cual, utiliza
disolventes orgánicos tóxicos, relativamente laborioso, y el fenol o cloroformo residual
pueden afectar las aplicaciones subsiguientes, tales como los procesos de la electroforesis.
(Szabó A. 2013)
Según lo evidenciado en la electroforesis en ADN cada muestra tiene una longitud diferente
de la presencia de material genético, lo cual depende de los fragmentos, los fragmentos
pequeños pueden correr hasta salirse del gel, en cambio los grandes pueden correr solo una
parte y no salir del lado positivo del gel.

Conclusión
La extracción de ADN es una práctica muy moderna, rápida y eficiente. La cual cuenta con
grandes beneficios como su aplicación en el campo de la ingeniería genética, el campo
farmacológico, así como en el campo de diagnóstico médico. Brindando así un gran avance
en la tecnología y su relación con la medicina. En la actualidad, se ha implementado la
extracción del ADN a base de kits comerciales que brindan una alternativa más rápida y
eficiente dejando a un lado los antiguos métodos artesanales que estaban basados en
productos que podían ser tóxicos además no contaban con la exactitud de las técnicas
actuales. Para la separación e identificación del ADN encontramos la electroforesis, la
practica complementaria de la extracción, esta nos permite visualizar las bandas de ADN
por adición de un agente intercalante que en presencia de luz UV permite la observación
del acido nucleico.

Bibliografía

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-Aislamiento de ADN (2016) Quiagen.
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-Szabó A, Papin C, Zorn D, Ponien P, Weber F, Raabe T, et al. The CK2 kinase stabilizes
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