PRUEBA PCR PARA LA AMPLIFICACIÒN DE UN FRAGMENTO DE ADN Y SU

REVISIÒN EN GELES DE AGAROSA.

PCR TEST FOR THE AMPLIFICATION OF A DNA FRAGMENT AND ITS
REVIEW IN AGAROSE GELS.

Cifuentes Correa Eliana Camila; Cordero Molina Daniela; Gallego Lengua Kenia Sofia
1 Universidad de Córdoba. Facultad de Ciencias Básicas. Departamento de Biología,
Montería-Colombia. e–mail: ecifuentescorrea08@correo.unicordoba.edu.co

RESUMEN
Objetivo. Emplear la técnica PCR para la amplificación de un fragmento de ADN y su
revisión en geles de agarosa. Materiales y métodos. Fueron implementados dos
procedimientos que consistían en la amplificación mediante PCR de tres regiones tipo Alu
humano y la preparación de los geles de agarosa. 1) Se realizaron los cálculos pertinentes al
número de pruebas, volumen de la PCR, concentración de los reactivos, y volúmenes del
MIX (mezcla de los reactivos), se dejaron a descongelar en frio la Taq-polimerasa Master
Mix, los primers y el agua, se preparó el MIX y se repartió entre los tubos PCR junto al
ADN, estos fueron llevados al termociclador; 2) Para el procedimiento 2, se trabajó con gel
de agarosa al 2,5%, 3,5 ml de Buffer TBE 10X, se realizó la respectiva preparación de este,
se sembraron las muestras de ADN en los pozos y pasamos a observar la presencia de este
mediante electroforesis con ayuda de un equipo transiluminador. Resultados. Se observó el
gel de agarosa en la luz ultravioleta en donde la mayoría presentaron ADN, solo en los
pozos 2, 7 y 9; Dejando observar la mayor amplificaciòn en el pozo 7, Conclusiones. La
presencia y visualización de ADN no fue exitosa, esto se puede deber a que las muestras
pueden estar contaminadas. La contaminación es una de las principales razones por las que
una PCR puede fallar. Pueden introducirse contaminantes de ADN, ARN o enzimas durante
la preparación de las mezclas de reacción o el manejo de las muestras, también pudo ser
que la calidad de estas mismas no es la adecuada para el procedimiento, La calidad y la
cantidad de la muestra de ADN son fundamentales. Una muestra de baja calidad o una
concentración inadecuada de ADN pueden dificultar la amplificación.
Palabras Clave: ADN, Amplificación, Gel de agarosa, Prueba PCR

ABSTRACT
Objective.Use the PCR technique to amplify a DNA fragment and review it in agarose
gels. Materials and methods. Two procedures were implemented that consisted of PCR
amplification of three human Alu-type regions and the preparation of agarose gels. 1) The
pertinent calculations were carried out on the number of tests, volume of the PCR,
concentration of the reagents, and volumes of the MIX (mixture of the reagents), the Taq-
polymerase Master Mix, the primers and the water, the MIX was prepared and distributed
among the PCR tubes along with the DNA, these were taken to the thermocycler; 2) For
procedure 2, we worked with 2.5% agarose gel, 3.5 ml of 10X TBE Buffer, the respective
preparation of this was carried out, the DNA samples were planted in the wells and we
began to observe the presence of this through electrophoresis with the help of a
transilluminator equipment. Results. The agarose gel will be observed in ultraviolet light
where the majority presented DNA, only in wells 2, 7 and 9; Letting us observe the greatest
amplification in well 7, Conclusions. The presence and visualization of DNA was not
successful, this may be because the samples may be contaminated. Contamination is one of
the main reasons why a PCR can fail. Contaminants from DNA, RNA or enzymes can be
introduced during the preparation of the reaction mixtures or the handling of the samples, it
could also be that the quality of the samples is not adequate for the procedure. The quality
and quantity of the sample DNA are fundamental. A low-quality sample or an inadequate
concentration of DNA can make amplification difficult.
Keywords: DNA, Amplification, Agarose gel, PCR test

INTRODUCCIÓN aquaticus que vive a altas temperaturas

(79ºC a 85ºC), de ahí su nombre
La gran complejidad de los procesos
comercial más conocido: taq polimerasa.
biológicos en los seres vivos ha sido por
Cuando hacemos una reacción de PCR
años la razón por la que los
simulamos lo que sucede en una célula
investigadores han centrado su atención
cuando se sintetiza el ADN y en el tubo
en descifrar los mecanismos que se
se mezclan todos los ingredientes
esconden detrás de esos procesos. Desde
necesarios para hacerlo: la polimerasa, el
entonces, varios grupos han mostrado un
ADN del organismo que queremos
gran interés por desarrollar métodos
estudiar –donde se encuentra el fragmento
sensibles y reproducibles que les permitan
que queremos sintetizar los
estandarizar protocolos experimentales
oligonucleótidos (llamados también
para estudiar los ácidos nucleicos. Es así
primers, iniciadores, cebadores, “oligos”,
como han ido apareciendo diferentes
etc.) necesarios para que se inicie la
tecnologías cuyos protocolos están
transcripción, dinucleótidos (dNTPs), y
dirigidos al estudio del ADN (1);
las condiciones para que la enzima trabaje
probablemente, la más importante sea la
adecuadamente (cierto pH, determinadas
PCR son las siglas en inglés de
cantidades de magnesio en forma de
Polymerase Chain Reaction o Reacción
MgCl2 , KCl, y pueden necesitarse otras
en Cadena de la Polimerasa.
sales o reactivos, dependiendo de cada
La idea básica de la técnica PCR es polimerasa). Esta técnica tan ingeniosa
sintetizar muchas veces un pedazo o tiene muchísimas aplicaciones distintas y
fragmento de ADN utilizando una se ha convertido en una herramienta muy
polimerasa que puede trabajar a importante en la biología molecular; sus
temperaturas muy elevadas, ya que aplicaciones van desde la genética de
proviene de la bacteria Thermus
poblaciones, evolución molecular y
genómica hasta la medicina forense (2).
Diversos estudios han demostrado que la
especificidad, el rendimiento y la
fidelidad de la PCR se encuentra
directamente influenciada por los diversos
componentes que integran la técnica: 1.
mezcla de reacción, 2. régimen de ciclaje
y 3. ADN polimerasa (3); pero además se
debe de tener en cuenta que la efectividad
de una PCR es también resultado del
trabajo con soluciones puras de ácidos
nucleicos, de tal modo que es factible
deducir que la sensibilidad de la técnica
puede verse dramáticamente reducida
cuando se aplica directamente a muestras
biológicas. En base a estos supuestos,
debe presumirse que una PCR aun
altamente específica puede producir
errores (4)
En esta practica de laboratorio el principal
objetivo fue amplificar una región de
ADN humano correspondiente a un sitio
que puede presentar inserciones de
secuencias Alu, estas mutaciones
corresponden a inserciones de secuencias
móviles de aproximadamente 300 pb que
han ocurrido en la raza humana en
distintas épocas, en diferentes lugares,
determinando así la asociación
filogenética de las poblaciones humanas
con la información generada por algunas
inserciones Alu ocurridas en la historia
humana.
MATERIALES Y METODOS: Esta
práctica se realizó en el mes de
septiembre de 2023 en el Laboratorio de
Genética del Programa de Biología de la
Facultad de Ciencias Básicas, en la
Universidad de Córdoba.
Procedimiento 1: Amplificación
mediante PCR de tres regiones tipo Alu
humano.
Se realizaron los cálculos pertinentes al:
volumen de la PCR, número de pruebas,
concentración de los reactivos y
volúmenes del MIX (mezcla de los
reactivos). (Tabla 1.) Posteriormente se
rotularon los tubos con una concentración
de 0,2 PCR con el símbolo de cada
estudiante y tipo de marcador, se
esterilizó la mesa con alcohol al 70% para
evitar agentes externos, para colocar
después poner un papel (kraft o
quirúrgico) sobre la mesa. La Taq-
polimerasa Master Mix, los Primers y
el Agua; se agitaron en un vortex, Se
preparó el MIX (Polimerasa, primer y
agua) y se mezcló en el vortex,
luego se repartió el MIX con las
micropipetas entre los tubos PCR
rotulados y se le agregó el ADN
correspondiente. Por último, se llevaron
los reactivos al termociclador y se corrió
bajo las condiciones del programa. (Tabla
2.)
Tabla 1. Reactivos necesarios para la
PCR
Reactivos Vol. x 1 Vol. X 6
tubo tubos
(µL) (µL)
Taq- Polimerasa 10 60
Master Mix
Primer Forward 1 6
Primer Reverse 1 6
Agua 4 24
ADN 4 -------
 Total 20 ------- polimerizara (aproximadamente 20
minutos).
Depositando el gel en la cámara de
electroforesis y se llenó la cámara con
Tabla 2: condiciones de la PCR buffer TBE 1X. seguidamente sembrando
en sus respectivos pozos del gel: 2 µL de
Cicl Actividad Tiem Tempera Buffer de carga con 8 µL de ADN (se
os po tura mezcló antes de la siembra en el pozo),
1 Desnaturali 5 95°C separando el conjunto de muestras por
zación minut marcador. se cerró la cámara, verificando
os la fuente de poder las indicaciones de
corrida (30 minutos a 100 V) y se hizo su
Desnaturali 30 95°C proceso de corrido, por último, una vez
zación segun terminado el tiempo de corrida se vio en
dos un equipo transiluminador el ADN.
Anillamient 30 58°C
30 o segun
dos RESULTADOS.

Extensión 1 72°C Finalizado el procedimiento se procedio a

minut visualizar el gel de agarosa en luz
o ultravioleta (ver imagen 1). En este
observamos que la mayoría de los pozos
1 Extensión 5 72°C no presentaron ADN, solo en los pozos
minut 2, 7 y 9; Dejando observar la mayor
os amplificaciòn en el pozo 7, teniendo en
cuenta que gel de agarosa contiene una
matriz de poros que le permite separar
fragmentos de ADN en función de sus
tamaños.
Procedimiento 2: geles de agarosa al
1% en TBE 1X
Se pesó 0,32 gr de agarosa en la balanza
analítica y se agregó en un matraz
Erlenmeyer de 100 ml, adicionando en el
matraz Erlenmeyer 35 ml de Buffer TBE
1X. Posteriormente se calentó la solución
en un horno microondas hasta que la
solución quedara traslucida y se dejó
Imagen 1. Prueba PCR revelada con luz
enfriar, (revolviendo constantemente
UV
hasta enfriarse), adicionando la solución
en el soporte del gel, se colocaron DISCUSIÒN
los peines y se esperó a que se
Las pruebas PCR es una tecnica que
permite la amplificaion exponencial de
una region especifica de ADN. Se basa en
la utilización de una enzima llamada
DNA polimerasa, que replica la cadena de
ADN en un ciclo repetitivo (5). Esto se
logra mediante la alternancia de ciclos de
desnaturalización (calentamiento del
ADN), apareamiento de cebadores
(secuencias de ADN complementarias a
la región de interés) y extensión (síntesis
de nueva cadena de ADN) (6).
La metodología de esta práctica contrasta
también con la que se utilizó para realizar
el diagnóstico e identificación rápidos por
PCR de Yersinia ruckeri aislada
de Oncorhynchus mykiss procedentes de
Canta, Lima, Perú, en donde se aislaron
22 cepas bacterianas del hígado, bazo y
riñón. Se empleó la técnica de la PCR
para la amplificación y cebadores
específicos (ARNr 16S), que permitieron
amplificar un fragmento de ADN de 575
pb de Yersinia ruckeri. Diecinueve cepas
fueron identificadas como Yersinia
ruckeri mediante la PCR, tanto en peces
sintomáticos como asintomáticos. Se
estableció un tiempo de diagnóstico de 26
horas, en comparación con los 2 ó 3 días
que duraría el diagnóstico empleando las
pruebas bioquímicas (7). Por el contario,
en Medellín- Antioquia se realizó la
detección de Brucella abortus por PCR
en muestras de sangre y leche de vacunos
en donde se analizaron 136 animales. Se
evaluó la presencia de anticuerpos en la
leche mediante la prueba del anillo
(PAL). Se amplificó el fragmento de
223pb del gen BCSP31. Se emplearon los
cebadores B4 y B5 de la región interna de
la secuencia del gen BCSP31 (GenBank,
número M20404). Dando como
resultados que un 13.2% (18/136) de las
muestras de leche fueron positivas a la
PAL. Se analizaron 33 muestras de leche
negativas por PAL de las cuales el 30.3%
(10/33) resultaron positivas por PCR. Al
analizar las muestras de sangre de los
animales positivos por PAL el 94.1%
(16/17) fueron positivas por PCR,
mientras que el 47% (8/17) de las
muestras de leche positivas por PAL,
fueron positivas por PCR (8).
CONCLUSIÒN
En conclusión, la presencia y
visualización de ADN no fue exitosa, esto
se puede deber a que las muestras pueden
estar contaminadas. La contaminación es
una de las principales razones por las que
una PCR puede fallar. Pueden
introducirse contaminantes de ADN,
ARN o enzimas durante la preparación de
las mezclas de reacción o el manejo de las
muestras, también pudo ser que la calidad
de estas mismas no es la adecuada para el
procedimiento, La calidad y la cantidad
de la muestra de ADN son fundamentales.
Una muestra de baja calidad o una
concentración inadecuada de ADN
pueden dificultar la amplificación.
BIBLIOGRAFIA
(1) Tamay de Dios, L., Ibarra, C., &
Velasquillo, C. (2013).
Fundamentos de la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) y
de la PCR en tiempo
real. Investigación en
discapacidad, 2(2), 70-78.
(2) Asuar, L. E. (2007). Guía práctica
sobre la técnica de PCR. Ecologia
Molecular. LE Eguiarte, V. Souza,
X. Aguirre (Eds). INECC. México,
517-552.
(3) Rodríguez Sánchez, Irám Jesús. DETECCIÓN DE Brucella
Pablo y Barrera Saldaña, Hugo abortus POR PCR EN
Alberto (2004) La reacción en MUESTRAS DE SANGRE Y
cadena de la polimerasa a dos LECHE DE VACUNOS.
décadas de su invención. Ciencia
UANL, 7 (3). ISSN 1405-9177
(4) Bolívar, AM, Rojas, A., & García
Lugo, P. (2014). PCR y PCR-
Múltiple: parámetros críticos y
protocolo de estandarización.
Avances en Biomedicina , 3 (1),
25-33.
(5) Ried, T., Heselmeyer-Haddad, K.,
Blegen, H., Schröck, E., Auer, G.,
& Genomic, G. (1999). Genomic
changes defining the genesis,
progression, and malignancy
potential in solid human tumors: a
phenotype/genotype correlation.
Genes, Chromosomes and Cancer,
25(3), 195-204.
(6) Bustin, S. A., Benes, V., Garson,
J. A., Hellemans, J., Huggett, J.,
Kubista, M., ... & Wittwer, C. T.
(2009). The MIQE guidelines:
minimum information for
publication of quantitative real-
time PCR experiments. Clinical
chemistry, 55(4), 611-622.
(7) SIRVAS-CORNEJO, Susana;
SANCHEZ-ROBINET, Claudia
Cecilia y PENA-DOMINGUEZ,
César. Diagnóstico e
identificación rápidos por PCR de
Yersinia ruckeri aislada de
Oncorhynchus mykiss
procedentes de Canta, Lima,
Perú. Rev. peru biol. [online].
2011, vol.18, n.3.
(8) MOSQUERA C,
Xiomara; BERNAL V,
Carmen; MUSKUS L, Carlos y
BERDUGO G,