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Extraccin de

ADN en
lentejas

Objetivos
1. Indicar las funciones biolgicas del ADN.
2. Demostrar la presencia de AN en tejidos biolgicos.
3. Explicar los principios fsico-qumicos en que se basa la extraccin y
purificacin del ADN.
4. Indicar los usos del ADN genmico humano en el diagnstico molecular,
en gentica forense e ingeniera gentica.
Introduccin
La aplicacin de tcnicas moleculares inicia con la extraccin de ADN y la
obtencin exitosa de datos confiables y reproducibles depende, en gran
medida, de la extraccin de ADN ntegro y puro.
La extraccin consiste en el aislamiento y purificacin de molculas de ADN
y se basa en las caractersticas fisicoqumicas de la molcula. El ADN est
constituido por dos cadenas de nucletidos unidas entre s formando una doble
hlice.
Los grupos fosfato tienen una fuerte tendencia a repelerse, debido a su carga
negativa, lo que permite disolver al ADN en soluciones acuosas y formar una
capa hidratante alrededor de la molcula. Pero, en presencia de etanol, se
rompe la capa hidratante y quedan expuestos los grupos fosfato. Bajo estas
condiciones se favorece la unin con cationes como Na+ que reducen las
fuerzas repulsivas entre las cadenas de nucletidos y permiten que el ADN
precipite.
A lo largo del tiempo se han diseado distintos protocolos con la finalidad de
obtener una cantidad y calidad de ADN adecuados, as como garantizar la
eliminacin de inhibidores potenciales que dificulten el tratamiento posterior
de la molcula. En general, los protocolos tradicionales consisten de cinco
etapas principales: homogeneizacin del tejido, lisis celular, separacin de
protenas y lpidos, precipitacin y redisolucin del ADN

EXTRACCIN DE ADN

Cuestionario de Revisin
1. Describa los principios generales de Extraccin de ADN.
El ADN se encuentra en el ncleo celular, muy replegado y unido a protenas formando la
cromatina. Para extraerlo es necesario homogeneizar el tejido, romper las clulas para
separar el ncleo, romper el ncleo y liberar el ADN, separar las protenas y precipitarlo
para extraerlo de la solucin. El ADN aparecer como un agregado de fibras blanquecinas
que se adhiere.

1
Fragmentacin del
tejido

Anlisis

Lisis celular

Purificacin del
ADN

4
Purificacin

3
Clarificacin

EXTRACCIN DE ADN
1. Fragmentacin del tejido (Homogenizacin del tejido): La homogeneizacin,
mecnica o qumica, consiste en romper las uniones entre las clulas para facilitar la
interaccin con las soluciones de lisis que ayudan a liberar el material gentico, es
decir no es ms que la disociacin de las clulas para que pierdan contacto entre ellas y
as volverse ms vulnerables a la lisis celular.

2. Lisis celular: Rotura de las membranas celulares y nucleares para liberar el ADN.
Entre los procedimientos usuales de lisis figuran los siguientes: rotura mecnica
(trituracin, lisis hipotnica, etc.); tratamiento qumico (detergentes, agentes
caotrpicos, reduccin con tioles) y digestin enzimtica (Proteinasa K, etc.).

3. Clarificacin: Separacin de los cidos nucleicos de los restos celulares. La


clarificacin se puede realizar por centrifugacin, filtracin o por mtodo mixto de
enzimas + centrifugacin.

4. Purificacin: Separacin del ADN de protenas solubles, de otros acidos nucleicos


no desados, de lpidos, de carbohidratos, de sales y otros compuestos orgnicos. Los
mtodos empleados para purificar los cidos nucleicos de extractos celulares suelen
ser combinaciones de dos o ms tcnicas de las siguientes: Extraccin/precipitacin
(Ej. Salting out y la desproteinizacin con fenol, Cromatografa (de intercambio
inico, de adsorcin selectiva, de permeacin sobre gel), Centrifugacin y Separacin
por afinidad.

5. Anlisis: puede ser cualitativo determinando la calidad del ADN (electroforesis) o


cuantitativo para determinar la concentracin de ADN (espectrofotometra UV).

EXTRACCIN DE ADN

2. Diga usted para qu utilizamos detergentes en el procedimiento.

EL DETERGENTE EN LA EXTRACCIN DEL ADN

Cabezas

Colas

Lpidos de la Membrana

Detergente

Agente tenso activo, reduce la tensinSepara


superficial
de las membranas
Captura
los restos
de lpidos
de las
membranas
las membranas
celulares
del tejido
vivo y protenas
Permite
la salida
del A

EXTRACCIN DE ADN

EXTRACCIN DE ADN

3. Diga usted para qu utilizamos alcohol en el procedimiento.

Deja expuestos los grupos fosfatos del ADN

Neutraliza las cargas de la solucin

Hace precipitar el ADN, hacindolo visible.

Remueve del ADN componentes como las concentraciones residuale

EXTRACCIN DE ADN

4. Diga usted qu tipo de enzimas contienen los suavizadores de carne y el jugo de


pia y para qu lo utilizamos en este procedimiento.

Tiene papana, que es una enzima proteoltica (proteasa), la cual es una protena especializada
Contiene

ABLANDADOR DE CARNE

Degrada completamente todo tipo de protenas y las separa del A


Funcin

F ab ricac
i n d e
f rm a cos
con
gen tica
reco m b i
na n te

Tera p ia
g en tica

A n lisi
s d e la
escen a
de un
crim en

M ed icin a
F oren se

D etecci
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E studi
os d e
v ariaci
n
g entic
a

P ru eba s
de
P atern id
ad

5. Diga usted cuntos usos se les puede dar al ADN una vez extrado.

EXTRACCIN DE ADN

EXTRACCIN DE ADN

6. Diga usted qu relevancia tiene e l ADN en el diagnstico clnico.

EL ADN EN EL DIAGNOSTICO CLNICO

EXTRACCIN DE ADN

7. Diga usted cules son las funciones biolgicas del ADN.

Codificacin
de protenas
Permite la
capacidad de
mutacin
(Cambios
evolutivos)

Funciones
Biolgicas del ADN

Almacena
informacin
gentica

Su replicacin
asegura la
transmisin a
las clulas
hijas

Controla la
actividad de
las clulas

EXTRACCIN

8.

ADN
El ADN es muy estable y slo se requiere
mantener las muestras congeladas antes de
su extraccin.
Inicialmente es necesario llevar a cabo una
lisis para liberar al ADN del interior celular.
Algunos paquetes comerciales de alto
rendimiento son: PURIGEN, QUIAGEN,
MILIPORE, GENTRA y MoBio.

ARN
ARN total o Sub-celular (citoslico y nuclear)
Primero es necesario agregarle una solucin
que estabilice al ARN lo antes posible
Se minimiza la actividad de ARNasa liberadas
de las clulas lisadas
Extraccin con fenol cido (pH 4.5 )
Paquetes comerciales de compaas como
QIAGEN, Ambion y RNA-works

Diga usted cules son las diferencias en cuanto a la extraccin de ADN y ARN.

EXTRACCIN DE ADN

REACTIVOS EMPLEADOS EN LA EXTRACCIN DE:


ADN

Tris (Hidroximetil amonio metano) como


tampn biolgico estabilizante del pH de
la solucin entre 7,0 y 8,0
EDTA (cido etilendiamintetractico)
como agente quelante, atrapa Mg+
inhibiendo las endonucleasas
Cloruro
de
Sodio,
a
altas
concentraciones solubiliza el ADN
Cloruro de Potasio, sal equilibrante de
fuerzas inicas
Acetato de Sodio, sal que precipita el
ADN
Acetato de Potasio, sal que precipita
protenas
Fenol, solvente orgnico que denatura
protenas; es txico
Cloroformo, solvente orgnico, que
denatura protenas, remueve lpidos,
solubiliza fenol o lo elimina; es txico
SDS (dodecil sulfato de sodio),
detergente aninico que solubiliza
protenas y membranas; es txico
Sarkosyl (Lauril sarcosina), detergente
aninico que solubiliza protenas y
membranas
CTAB (hexadecil trimetil bromuro de
amonio), detergente catinico que
solubiliza polisacridos
Tritn X-100, detergente que solubiliza
protenas y membranas
B-Mercaptoetanol, antioxidante que
inactiva protenas por reduccin de
puentes disulfuro
DTT (Ditiothreitol), antioxidante que
reduce los grupos sulfuro de las
protenas
Octanolilsoamilalcohol, alcohol funciona
como agente antioxidante y disminuye la

ARN

Uso de inhibidores de ARNasa y


denaturantes fuertes de protenas (HCL
Guanidina o Tiosanato de Guanidina con
agentes reductores)
Dado que las ARNasas no van a ser
inactivadas en su totalidad en el autoclave,
resulta esencial trabajar con material estril
y de preferencia de un solo uso.
Las micro esferas de vidrio, generalmente
utilizadas en la extraccin para incrementar
la lisis celular por accin fsica
Es importante que los reactivos que se
utilicen en la extraccin de ARN se
mantengan en alcuotas con los volmenes
mnimos necesarios para cada etapa del
proceso y en caso de ser posible se pasen
dos veces por el autoclave
El mtodo utilizado con ms frecuencia
es el de GIPS (por sus siglas en ingls;
cido Tiosanato de Guanidina, fenol,
Sarkosyl)
El cido Tiosanato de Guanidina
es sumamente fuerte y tiene un alto
poder denaturalizante
El fenol, al estar acidificado,
provoca que el ADN se acumule en
la interfase entre la fase acuosa y la
del fenol, dejando al ARN en la fase
acuosa
El Sarkosyl, por su parte, es un
detergente muy potente que ayuda a
la lisis celular, pero no reemplaza la
ruptura fsica de las clulas que
generalmente se logra con micro
esferas de vidrio agitadas con la
ayuda de un vrtex o de un
homogenizador
celular
(como
Bead-Beater)

EXTRACCIN DE ADN

formacin de espumas e interfases

PVP (polivinil pirrolidona), detergente


que
elimina compuestos fenlicos que inhiben
la actividad enzimtica
Etanol, alcohol que precipita los AN
Isopropanol, alcohol que precipita los
AN
ARNasa, enzima que degrada el ARN

El mtodo BOOM, lleva a cabo la


extraccin con el cido Tiosanato de
Guanidina,
separando
los
cidos
nucleicos con base en su alta afinidad
para enlazarse en matrices de slica, en
vez de utilizar fenol. Dado que este
mtodo aisla tanto ADN como ARN,
resulta esencial utilizar las nucleasas
especficas para ADN que lo eliminen de
la muestra. Durante su precipitacin es
comn utilizar cloruro de litio 8 M (libre
de ARNasas). Este mtodo no debe ser
utilizado para ARN que ser sometido a
transcripcin reversa

EXTRACCIN DE ADN

9. Diga usted cules son las diferencias entre los procedimientos de extraccin de

Extraccion de ADN
Vegetal

Extraccion de ADN
Animal

El ADN genmico de las plantas es


ms difcil de extraer a causa de la
pared celular de la planta, que se
elimina por homogeneizacin o
mediante la adicin de celulasa para
degradar la celulosa que forma la pared
celular.

Adems, los metabolitos presentes en


la clula vegetal pueden interferir
con la extraccin de ADN genmico
por la contaminacin de la muestra
de ADN durante el proceso de
precipitacin.

Los leucocitos de sangre perifricos son una


fuente principal de ADN genmico en
animales, pero la recogida de muestras es
difcil ya que la sangre debe ser retirada del
animal.

La sangre contiene una serie de compuestos


como protenas, lpidos, glbulos blancos,
glbulos rojos, plaquetas y plasma, que pueden
contaminar la muestra de ADN. El
contaminante principal del ADN de animal
extrado por muestras de sangre es hemo, el
componente no proteco de la hemoglobina.

ADN animal y ADN vegetal.

Diferencias
Las diferencias entre el ADN de las plantas y los animales se encuentran en la secuencia de
bases en la hlice. Los compuestos que se encuentran en las clulas vegetales estn
ausentes en las clulas animales y las secuencias de bases de ADN reflejan esto, puesto que
el ADN genmico de la planta es a menudo mayor que el ADN de los animales. Estas

EXTRACCIN DE ADN

diferencias afectan los mtodos de extraccin, ya que impacta en el rendimiento y la pureza


del ADN.

10. Diga usted qu principio de extraccin se usa para ADN plasmdico.


Las tcnicas de Minipreps o mini preparaciones de plsmidos, permiten la recuperacin de
plsmidos de DNA circular sobre el DNA cromosomal. El tratamiento de las clulas con
una base de pH alto o un detergente interrumpe el apareamiento de las bases nitrogenadas,
ocasionando que el DNA cromosomal se desnaturalice y se separe. Por el contrario la
configuracin superenrrollada del plsmido se mantiene estable.
Existen diversos protocolos para realizar lisis alcalina pero todos se rigen por los siguientes
pasos bsicos.
Remover las clulas del medio de cultivo en caldo mediante centrifugacin.
Descartar el sobrenadante para reducir contaminacin mediante fragmentos de la
pared celular del husped.
Resuspender las clulas en un amortiguador que contenga Tris, EDTA y glucosa.
Lisar las clulas con NaOH y SDS.
Unin de las hebras de DNA y remocin de contaminacin mediante el acetato de
potasio.
Precipitacin del DNA de plasmido mediante alcohol (etanol o isopropanol) y una
sal (Acetato de amonio, Cloruro de litio, Cloruro de sodio o Acetato de sodio).
Enjuague del material gentico con EtOH al 70%.
Resuspender el material gentico.
11. Explique usted por qu la concentracin de ADN se mide a 260 nm.
Las protenas y los cidos nucleicos absorben la luz en el intervalo ultravioleta, a
longitudes de onda comprendidas entre los 210 y los 300 nm. Tal como se ha sealado
anteriormente, la absorbancia mxima de las soluciones de ADN y ARN corresponde a
260 nm y la de las soluciones de protenas, a 280 nm.

EXTRACCIN DE ADN

12. Indique usted qu tipo de contaminantes podemos encontrar en un extracto de


ADN.

Biologic
os
Quimicos

13. Explique usted por qu la medicin de una muestra de ADN a 260/280 nos da
informacin sobre la pureza de la muestra.
La concentracin de cidos nucleicos suele determinarse midiendo a 260 nm y
comparando con un blanco. La interferencia de contaminantes puede determinarse
calculando un cociente. Dado que las protenas absorben a 280 nm, se emplea el
cociente A260/A280 para calcular la pureza de los cidos nucleicos. Los cocientes
respectivos del ADN y el ARN puro son aproximadamente de 1,8 y 2,0. Una
absorcin a 230 nm significa que la muestra est contaminada con hidratos de
carbono, pptidos, fenoles, compuestos aromticos u otras sustancias. El cociente
A260/A230 de las muestras puras es de 2,2 aproximadamente.
La absorbancia mxima de las soluciones de ADN y ARN corresponde a 260 nm y
la de las soluciones de protenas, a 280 nm. Dado que las soluciones de ADN y
ARN absorben parcialmente la luz a 280 nm y las que contienen protenas hacen lo
propio a 260 nm, el cociente de los valores obtenidos a 260 nm y a 280 nm
(A260/A280) proporciona una estimacin del grado de pureza de los cidos

EXTRACCIN DE ADN

nucleicos. Los cocientes A260/A280 respectivos del ADN y el ARN puros son
aproximadamente de 1,8 y 2,0. Con un paso de luz de 10 mm y una longitud de
onda de 260 nm, una absorbancia A = 1 corresponde aproximadamente a 50 g/ml
de ADN bicatenario, 37 g/ml de ADN monocatenario, 40 g/ml de ARN o 30
g/ml de oligonucletidos. Si la muestra tambin contiene protenas, el cociente
A260/A280 ser considerablemente inferior a dichos valores y no podr
determinarse con exactitud la cantidad de cidos nucleicos.
14. Diga para qu fines se puede utilizar el ADN genmico humano.

15.

Medicina
Forense

Bioinformtica

Ingeniera
gentica
y
Criminalstica
Nanotecnologa
del ADN

Cuando realizamos una extraccin de ADN, aparte de concentracin y pureza, qu


otros parmetros de calidad de la extraccin de ADN se deben investigar?

EXTRACCIN DE ADN

Pureza
Cantidad
Calidad
Concentracin

16. Diga usted para que utilizamos la sal en este procedimiento.


La sal en disolucin acta disminuyendo la solubilidad de las protenas, lo que hace
que precipiten y se separen ms fcilmente del ADN, es decir la sal evita la unin de
las protenas al ADN.
17 .Para qu se hace uso de la licuadora en este procedimiento.
La licuadora ayuda en la rotura de membranas celulares y cubiertas nucleares,
permitiendo la separacin del ADN. Rompe las clulas y expone las paredes
celulares y membranas a la accin del detergente.

EXTRACCIN DE ADN

Reporte de Laboratorio
PROCEDIMIENTOS:
MATERIALES:

Arvejas
3
4
2
Balanza de 1
compensacin
NaCl
Agua destilada
Licuadora
Beaker de 250 ml
Beaker colar la sopa resultante
Licuar
15un
seg.
Pesar 100g de lentejas
Agregar 1g NaCl y 200 mL de
H2O todo porEn
Colador plstico, o
Filtro para cafetera
Jabn lquido
7
Reloj
6
5
Tubos de ensayo 13
8
9
x 100 mm
Gradillas
Ablandador para
carne
Alcohol al 70%
Agregar 1g gramo de ablandador, mezclarlo 5 min.
Agregar alcohol y dejar reposar 10 min.
Reloj Con un pincho limpio
Distribuir la solucin
en30
tubos
de jabn
ensayo
extraer el ADN
Agregar
mL de
lquido, esperar 10 min.
Pinchos de madera
para carne

EXTRACCIN DE ADN

Para realizar el laboratorio, nos dispusimos a trabajar activamente cada uno en


un procedimiento inicial diferente, sin embargo a partir del procedimiento de
dividir la solucin en tubos de ensayo, nos reagrupamos en parejas. Cada
pareja era encargada de un tubo de ensayo, por lo cual a travs de un apoyo
mutuo finalizamos el procedimiento exitosamente.
Resultados:

Luego de ciertas dificultades con los filtros, la innovacin de utilizar papel toalla fue la

EXTRACCIN DE ADN

En esta imagen observamos los cinco tubos de ensayo, cada uno ya con ablandador d

Finalmente logramos apreciar un poco la precipitacin del ADN, a pesar que no se prec

Conclusiones
1. La extraccin de ADN, es un mtodo esencial y multidisciplinario, ya que
sus aplicaciones abarcan la Medicina clnica, Biotecnologa, Ingeniera
Gentica, Medicina Forense entre muchas ms disciplinas cientficas en las
cuales se ha abierto campo con los avances tecnolgicos de la ltima
dcada.
2. La extraccin de ARN difiere de la extraccin de ADN, ya que los
reactivos empleados son diferentes por las caractersticas fsico-qumicas
de las molculas, en la extraccin de ARN el pH debe ser cido mientras
que en el de ADN debe ser neutro.
3. Entre los buffer de extraccin de ADN tenemos el buffer CTAB, el buffer
CTAB 2x, el buffer STE. Los cuales contienen Tris-HCL, EDTA, CTAB,
NaCl, b-Mercaptoetanol entre otros reactivos.
4. En la extraccin de ARN se utiliza mayormente el mtodo GIPS, porque el
mtodo BOOM no es recomendable para ARN que ser sometido a la
tcnica de transcripcin reversa. El reactivo en comn de ambos mtodos
es el cido Tiosanato de Guanidina.
5. Los parmetros de la calidad de la extraccin de cidos nucleicos incluyen
la concentracin, la pureza, la integridad, el alto rendimiento de la muestra,
la exactitud y su fiabilidad para reproducir los datos.

Webgrafa
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.

http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/530/cap16.pdf
http://genmolecular.com/tecnicas-de-biologia-molecular/
http://funimporadnyarn3.blogspot.com/
http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual
%20ES/Sesi%C3%B3n4.pdf
http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/710/extraccion.pdf
http://www.fbmc.fcen.uba.ar/materias/ingen/practicos/arn/clases/Extrac
cion%20ARN.pdf
http://www.microbialsystems.com/web/docs/Newsletter_Microbial_03.pdf
http://www.bteduc.bio.br/guias_es/69_Extraccion_de_ADN_(procedimi
ento_basico).pdf
http://www.bteduc.bio.br/guias_es/70_Extraccion_de_ADN_de_diversa
s_fuentes.pdf