EXTRACCIÓN DE DNA

La extracción consiste en la separación y purificación del DNA con el fin de poder estudiarlo, analizarlo o
manipularlo.
1. Lisis celular
Es la ruptura de la membrana celular
Se puede llevar a cabo por 3 tipos de tratamiento.
Ruptura mecánica: Se somete la célula a lisis hipótonica en donde la célula se hinchará hasta reventar y
liberar su contenido
Tratamientos químicos: Se utilizan detergentes o agentes caotrópicos (Acetona, tolueno) y difosfato
sódico que desnaturaliza proteínas, solubiliza los lípidos de la membrana plasmática y nuclear.
Las soluciones de lisis contienen a demás un agente quelante de cationes divalentes llamado hepta que
inactiva las ADNasas por interacción por su cofactor enzimático el magnesio
Tratamiento enzimático: Lisozima rompe enlaces de peptidoglicano (bacterias) Liticasas rompe enlaces del
glucano de las levaduras, proteasas que rompen enlaces peptídicos de proteínas de pared y membrana
plasmática en la interacción célula – célula
2. Eliminación de proteínas
Después de lisar la célula en el tubo nos queda proteína y otros contaminantes es necesario someter a
enzimas proteolíticas activas ante un amplio aspecto de proteínas para desintegrarlas e inactivarlas. Se
puede utilizar pronasas pero debido a que poseen contaminantes como las nucleasas es necesario auto
digerir a 37°C unas horas antes de su uso.
3. Eliminación de ARN
Es importante puesto que al momento de la hibridación con sondas se puede cometer errores de
reconocimiento de la secuencia contaminada con ARN. Se utiliza ARNasas como la Ribonucleasa A aislada y
purificada a partir del páncreas de bobino esta ribonucleasa nos da la capacidad para aislar ADN libre de
ARN esta enzima hidroliza el arn en los residuos de citosina y uracilo
4. Eliminación de los contaminantes
El RNA es una molécula polar a causa de la carga negativa que le confiere su grupo fosfato esto nos
permite aprovechar la característica es decir la tendencia hidrofílica del RNA al agregar un solvente
orgánico que separa dos fases 1 orgánica en donde precipite a las proteínas y otra fase que mantiene
inmersa al RNA en una solución acuosa. Se utilizan solventes orgánicos tales como el fenol, cloroformo y
alcohol isoamílico los cuales tienen propiedades de desnaturalizar proteínas quedando las proteínas en la
parte inferior del tubo y al RNA en la fase acuosa
5. Precipitación del RNA
Se separa en RNA utilizando etanol en presencia de altas concentraciones de sales ya sea acetato de
amonio, acetato de sodio y acetato de potasio. El etanol permitirá que el ADN permanezca en el fondo del
tubo.
6. Redisolución del RNA
Esta etapa se trata de hidrata y eluir el RNA para ello se utiliza una solución reguladora como el Tris – HCl a
10Mm
RESUMEN
La extracción de ADN requiere una serie de etapas, primero es necesario romper la pared celular y la
membrana plasmática para poder acceder al núcleo de la célula. A continuación debe romperse también la
membrana nuclear para dejar libre el ADN. Por último hay que proteger el ADN de enzimas que puedan
degradarlo, y para aislarlo hay que hacer que precipite en alcohol.
La solución con detergente y sal es capaz de romper la pared celular y la membrana plasmática, junto con
la nuclear. El alcohol se utiliza para precipitar el ADN, pues como éste es soluble en agua, cuando se
encuentra en alcohol se desenrolla y precipita en la interfase entre el alcohol y el agua.