ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DE CHIMBORAZO

FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA DE……..
CARRERA DE…….

GUÍA DE LABORATORIO DE ……. (asignatura)

PRÁCTICA No.2 extraccion de ADN vegetal

1. DATOS GENERALES:

NOMBRES: CÓDIGOS:

…………………………………… ………………………………….

…………………………………… ………………………………….

GRUPO No.: ………….

FECHA DE REALIZACIÓN: FECHA DE ENTREGA:

aa/mm/dd aa/mm/dd
2. OBJETIVOS:

2.1. GENERAL:

 Extraer ADN de una muestra de banana.

2.2. ESPECÍFÍCOS:
 Conocer las características fisicoquímicas de la molécula de ADN y aplicarlas en su
extracción.
 Analizar y comprender el papel que cumplen los reactivos en la ruptura de la
membrana y núcleo celular para la extracción de ADN de bananas.
 Observar al microscopio la muestra obtenida de ADN y realizar comparaciones.

3. METODOLOGÍA:
Método tradicional de extracción de ADN en un laboratorio de enseñanza:
 Preparación de la muestra empleando instrumentos de trituración.
 Ruptura de membranas celular y nuclear mediante detergentes.
 Eliminación de contaminantes y restos de tejidos mediante filtración.
 Precipitación de ADN con etanol a bajas temperaturas y sales (NaCl)

4. MATERIALES, SUSTANCIAS, REACTIVOS Y EQUIPOS:

4.1 MATERIALES: 4.2 SUSTANCIAS:

-1 vaso de plástico -20 ml de agua destilada
-Una cuchara plástica para medir y mezclar -1 banana
-Papel filtro
-1 pipeta de transferencia plástica o un
gotero médico
-1 varilla de vidrio o 1 pipeta Pasteur
-2 tubos de ensayo

4.3 REACTIVOS: 4.4 EQUIPOS:

-etanol al 95% -Licuadora
-Shampoo de color claro -microscopio
-Sal de mesa, con o sin Iodo
5. MARCO TEÓRICO Y REFERENCIAL:
5.1. MARCO TEÓRICO:

El ADN es una molécula formada por dos cadenas de polinucleotidos unidas por puentes de
hidrogeno. Los nucleótidos son la timina, adenina guanina y citosina; las cuales forman los genes
que de acuerdo a la secuencia de orden en que se encuentran determinan las características
biológicas de todo ser vivo. Además esta bíomolecula está constituida de un azúcar
(desoxirribosa) y un grupo fosfato. El ADN está presente en todas las células de los organismos
vivos. En las células procariotas el ADN se encuentra disperso en el citoplasma y por el contrario
El ADN eucariótico se encuentra en el interior del núcleo de las células rodeado de proteínas
(histonas) que lo mantienen unido y compactado, (Malajovich, 2011).
El ADN al ser una molécula larga puede en conjunto ser visualizada y además al estar en todas
las células de todos los organismos, puede ser extraído con facilidad de cualquier tejido para ello
se sigue un procedimiento que implica deshacer la membrana plasmática y la envoltura nuclear
así como la desnaturalización de las proteínas. Esto involucra el empleo de reactivos en cada paso
que cumplen una función específica en la extracción de ADN, (Martínez, 2015).

A. Trituración del tejido para separar las células del plátano: facilita la absorción de las
soluciones que se añadirán.
B. Lisis de la membrana celular: El detergente ayuda a romper la bicapa de fosfolípidos de
las membranas plasmáticas y la envoltura nuclear. Los lípidos de la membrana se
descomponen debido al detergente que deshace las uniones que mantienen la
membrana junta. La estructura de los lípidos es similar a la del detergente y eso hace que
se combinen, formando una burbuja de detergente y lípidos, (Martínez, 2015).

Figura 1. Separación de la membrana Figura 2. Formación de burbujas entre el

plasmática, envoltura nuclear y la detergente y los fosfolípidos, (Martínez,
liberación del DNA, (Martínez, 2015). 2015).
 C. Extracción de contaminantes: Este paso permite separar los restos de los tejidos del
plátano y de las células que han sido rotas en los pasos anteriores. Empleando filtros se
consigue un ADN libre de la membrana nuclear
D. Precipitación del ADN:
Alcohol congelado: El ADN es una molécula polar, pero la reacción con el etanol a muy
baja temperatura hace que se vuelva apolar e insoluble en el etanol formándose un
precipitado justo entre la capa con etanol líquido y la capa con el extracto. El ADN es el
único componente de la solución que no es soluble en el etanol, y se hace visible porque
las diferentes cadenas se van aglutinando entre sí al precipitar debido a la acción de
fuerzas físicas. El alcohol es menos denso que el agua del extracto y por eso flota sobre la
capa del extracto, (Martínez, 2015).
Sal (NaCl) en la solución de extracción: La molécula de ADN es soluble en agua y por tanto
invisible, pero si se pone en contacto ADN que haya estado en un medio salado y alcohol
frío el ADN se vuelve insoluble y precipita debido a que el sodio neutraliza la carga
negativa de los grupos fosfatos, (Malajovich, 2011). Por lo tanto el agua salada ayuda a la
precipitación en el alcohol. La sal también ayuda a separar el ADN de las histonas,
(Martínez, 2015).
El procedimiento anteriormente mencionado se basa en las características fisicoquímicas del
ADN. Pues aparte de ser una molécula de alto peso molecular, muy larga y delicada, es un ácido
capaz de formar sales con iones cargados positivamente (cationes). Además, es soluble en
soluciones concentradas de sales (sal de cocina, por ejemplo), pero insoluble en alcoholes (tipo
etanol o isopropanol). Adicionalmente, el ADN es destruido a pH ácido (menor de 4,0), es
insoluble a pH 5.6, pero es soluble a pH 8,0. Por lo tanto, los procesos de extracción del ADN
deben mantener el pH óptimo y brindar una alta concentración iónica, (Rocha, 2002).

5.2. MARCO REFERENCIAL:

La práctica de Extracción de ADN de banana fue realizada en el laboratorio de Biotecnología
en la Facultad de Ciencias de la Escuela Superior Politécnica de Chimborazo en Riobamba
Ecuador.

6. PROCEDIMIENTO:
6.1. DIAGRAMA DE FLUJO DE LA PRÁCTICA:
 Licuar durante 15 o 20
segundos una banana por
taza de agua destilada
(250ml).
Llenar la pipeta plástica
Dejar la solución reposar
con el filtrado de banana
por 2 a 3 minutos sin
y agregarla a un tubo de
mover.
ensayo con alcohol.

En un vaso, preparar una

Filtrar la mezcla hasta Al ADN obtenido
solución consistente en
obtener 5 ml levantarlo con una varilla
una cucharadita de té de
aproximadamente de de vidrio (el ADN se
shampoo y dos pizcas de
filtrado para testear. enrolla a la varilla).
sal.

Agregar 20 ml (4
cucharaditas) de agua
destilada y reolverlo
lentamente evitando
formar espuma.
A la solución preparada
agregar tres cucharaditas
de té de la mezcla de
banana y mezclar de 5-10
minutos.
Colocar la muestra de
ADN sobre un
portaobjetos y teñirlo con
azul de metileno durante
3 minutos, para luego ser
observado en el
microscopio.

6.2. OBSERVACIONES:
- Inmediatamente tras agregar la solución de banana, shampoo y sal al etanol se
presenció un leve burbujeo que se propagó en todas las direcciones del tubo de
ensayo.
- Pasado tres minutos se evidenció un ligero cambio en la coloración de la solución
con la lenta aparición de un líquido viscoso en suspensión color blanquecino
- El fluido blanquecino al parecer se trataba de ADN que se disgrega fácilmente con
los movimientos bruscos.
- Con el pasar de los minutos el fluido blanquecino aumenta en tamaño tomando una
forma algodonosa y ya no de fibrillas como al principio.

7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

7.1. RESULTADOS

OBSERVACIÓN COLOR INTERPRETACIÓN

TRITURACIÓN DE Separación de una gran cantidad
LA MUESTRA DE Mezcla viscosa crema de células que facilitarán la
BANANA absorción de reactivos
posteriores.
LISIS CELULAR Cambio en la Ligeramente Ruptura de la membrana celular y
(ADICIÓN DE coloración y crema envoltura nuclear
DETERGENTE) formación de Formación de burbujas entre el
pequeñas detergente y los fosfolípidos
burbujas
ADICIÓN DE SAL no ocurre algo Ligeramente Neutralización de los grupos
apreciable a crema fosfatos del ADN por la presencia
simple vista de iones Na+, haciéndolo
insoluble en la solución
FILTRACIÓN Disminución blanquecino Eliminación de la mayor cantidad
del volumen de de restos de membrana celular y
la solución nuclear, pero aun persistiendo
original en el medio algunas proteínas
difíciles de filtrar
PRECIPITACIÓN Burbujeo leve Ligeramente Comienzo de la precipitación del
DEL ADN (ADICIÓN pero inmediato cristalino ADN
DE ETANOL) Formación de Fibras Precipitación total del ADN
fibrillas blanquecinas
blanquecinas
en suspensión
VISUALIZACIÓN EN Aglutinaciones Celeste y Presencia de ADN no puro ya
EL MICROSCOPIO de fibras de azul intenso que existe implícitamente
ADN proteínas asociadas

7.2. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

EN LA BIBLIOGRAFÍA
Como resultado final es una mezcla de
agregados moleculares, de consistencia
mucoidea, en la interfase entre la solución
acuosa y el alcohol. Los agregados
EN LA PRÁCTICA
Tras finalizar el proceso se obtuvo una
masa algodonosa en suspensión que
vendría a ser una aglutinación de fibras de
ADN, esto debido a la adición en demasía
 moleculares obtenidos son una mezcla de
proporción variable de ácidos nucleicos y
proteínas, no obstante, las células vegetales
contienen pectina, un polisacárido que
precipita en etanol, al igual que el DNA en
solución salina, (Malajovich, 2011).
de alguno de los reactivos durante el
proceso.
El ADN obtenido mediante este
procedimiento no permitió la obtención
puramente de la misma ya que es más bien
una mezcla de ADN, ARN y otras proteínas,
lo correcto para la obtención de mayor
cantidad de ADN es cumplir con más pasos
como la centrifugación y el empleo de
reactivos y enzimas, además de realizarse
tests que identifique ADN principalmente
para cerciorarse de su presencia en la
muestra final.

8. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES:
8.1. CONCLUSIONES
 Efectivamente el Método tradicional de extracción de ADN en un laboratorio de
enseñanza, permite la obtención de una muestra significativa de ADN, para poder
ser visualizada macroscópicamente y microscópicamente.
 El conocimiento de las propiedades fisicoquímicas del ADN facilita el proceso de
extracción, específicamente en la etapa de precipitación del ADN, pues al verse este
en un medio salado y en etanol frío el ADN se vuelve insoluble y precipita debido a
que el sodio neutraliza la carga negativa de los grupos fosfatos.
 Cada etapa en la extracción de ADN implican la adición de sustancias y reactivos con
el fin de en primera instancia de ocasionar la lisis de la membrana celular y la
envoltura nuclear para la liberación de ADN esto mediante el empleo de
detergentes, para luego ser precipitado mediante la adición de etanol y sales que
facilitan su visualización y extracción en forma de fibrillas en la disolución final.
 Las fibrillas de ADN visualizadas en el microscopio obviamente no presenta la
estructura de doble hélice pues la capacidad de ampliación y resolución del
microscopio no lo permite.

8.2. RECOMENDACIONES
 El uso del equipo de protección personal es indispensable pues se está haciendo uso
de reactivos cuya acción sobre la piel puede causar molestias e irritaciones.
 Realizar el procedimiento sin omitir pasos o adicionar reactivos en demasía pues
esto incide en el resultado final ya sea retardando el tiempo en que se preveía la
 aparición de fibrillas o con la aglutinación de ADN sin poder ser apreciadas las
fibrillas esperadas.
 Es necesario tener conocimientos previos sobre lo que se pretende realizar en la
práctica de laboratorio, para evitar cometer errores o alargando la culminación de
la misma.
 Mantener bien sellados los reactivos a fin de economizarlos, pues algunos reactivos
como el etanol se volatilizan fácilmente.

9. BIBLIOGRAFÍA:

9.1 BIBLIOGRAFÍA

 Malajovich, M. (2011). EXTRACCIÓN DE ADN PROCEDIMIENTO BÁSICO PARA

FUENTES ALTERNATIVAS. Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro.
 Martínez, L. (2015). EXTRACCIÓN DE DNA. Universidad Autónoma de Barcelona.
 Rocha, P. (2002). Teoría y práctica para la extracción y purificación del ADN de palma
de aceite. Laboratorio de Marcadores Moleculares, Área de Fisiología y
Mejoramiento. Cenipalma.

9.2 INTERNET

 Gómez, C. (23 de Junio de 2013). Convirtiendonos en consumidores conscientes.

Obtenido de https://santarosapapelbanano.wordpress.com/2013/06/23/la-
quimica-del-banano/

10. CUESTIONARIO:

1. ¿Por qué se puede suponer que la banana contiene ADN? ¿Dónde se

encuentra ese ADN?
La banana al ser un vegetal posee células (eucariotas), cuyo ADN se encuentra
en el interior del núcleo de las células rodeado de proteínas (histonas) que lo
mantienen unido y compactado, (Malajovich, 2011).

2. ¿Qué otro tipo de sustancias es posible encontrar entre los componentes de

la banana?
Glúcidos (fructosa, maltosa, sacarosa, almidón, pectina), aminoácidos, ácidos
grasos, fosforo, potasio, zinc, como los principales, (Gómez, 2013).
 3. ¿Cuál es la función del detergente en la experiencia?
El detergente ayuda a romper la bicapa de fosfolípidos de las membranas
plasmáticas y la envoltura nuclear. Los lípidos de la membrana se
descomponen debido al detergente que deshace las uniones que mantienen la
membrana junta. La estructura de los lípidos es similar a la del detergente y eso
hace que se combinen, formando una burbuja de detergente y lípidos,
(Martínez, 2015).
4. ¿Cuál es la función de la sal en la experiencia?
El sodio de la sal neutraliza la carga negativa de los grupos fosfatos,
(Malajovich, 2011). Por lo tanto el agua salada ayuda a la precipitación del ADN
en el alcohol. La sal también ayuda a separar el ADN de las histonas, (Martínez,
2015).
5. ¿Cuál es la función del alcohol en la experiencia?
La reacción del ADN con el etanol a muy baja temperatura hace que este se
vuelva apolar e insoluble en el etanol formándose un precipitado justo entre la
capa con etanol líquido y la capa con el extracto, (Martínez, 2015).
6. Al finalizar la experiencia se obtiene un mucus blanco y fibroso que sería el
ADN. ¿Es posible que la molécula de ADN se visualice a simple vista? ¿Por
qué?
El ADN se hace visible porque las diferentes cadenas se van aglutinando entre
sí al precipitar debido a la acción de fuerzas físicas, pero ello no significa que
sea ADN netamente puro, sino una mezcla de agregados moleculares,
(Martínez, 2015).
7. A partir de la respuesta anterior, ¿qué creen que contiene “el ADN” obtenido
en la experiencia
Como resultado final es una mezcla de agregados moleculares, de consistencia
mucoidea, en la interfase entre la solución acuosa y el alcohol. Los agregados
moleculares obtenidos son una mezcla de proporción variable de ácidos
nucleicos y proteínas, no obstante, las células vegetales contienen pectina, un
polisacárido que precipita en etanol, al igual que el DNA en solución salina,
(Malajovich, 2011)

11. ANEXOS
 a. b. c.

Extracción del ADN de una muestra de

NOTAS
CATEGORÍA DEL ESPOCH banana
a. Proceso de extracción del DIAGRAMA FACULTAD DE CIENCIAS LÁMINA ESCALA FECHA
ADN de banana ESCUELA DE CIENCIAS QUÍMICAS
b. Precipitación del ADN en □ POR CALIFICAR CARRERA DE BIOTECNOLOGÍA
etanol AMBIENTAL
c. observación al microscopio 1 1:1 08-11-17
LABORATORIO BIOTECNOLOGÍA
de las fibras de ADN
obtenidas.