Extracción de ADN

Cabrera-Bonilla, Aura-Maria, Pamo Bacca, Harby-Hoossen

Bioquímica

Docente: Lidia Susana Lara Bosso

Resumen
Para el proceso de extracción de ADN en la hoja de espinaca y en el hígado de vaca se
requiere hacer varias series de etapas básicas. En primer lugar, tienen que romperse la
pared celular y la membrana plasmática para poder acceder al núcleo de la célula. Después
debe romperse la membrana nuclear para dejar libre el ADN. Por último, hay que proteger el
ADN de enzimas que puedan disminuirlo y para lograr que este se aislé hay que hacer que
se precipite con alcohol. Para el procedimiento de extracción tanto el hígado como la
espinaca debían estar macerados para poder agregarle la solución buffer posterior a esto se
agregó etanol al 96% para que se realizará la lisis celular.

Palabras clave: ADN, Extracción, Rompimiento celular, Núcleo.

Introducción de las moléculas de ADN que se intentan

La extracción de ADN se realizó para
obtener las moléculas aisladas con alto
grado de pureza. La mayor parte de los
métodos que existen para extraer el ADN
consisten en lograr primero la lisis o
ruptura de la célula, para luego separar
las moléculas de ADN del resto de los
constituyentes de la célula. Los pasos
necesarios para una correcta extracción y
purificación del ADN mediante un
procedimiento químico son: 1. Lisis de las
células. 2. Degradación de la fracción
proteica asociada al ADN.
Se consigue mediante la adición de una
proteasa. 3. Purificación. Consta de 3
fases, la precipitación del ADN. Si se opta
por realizar el lisado de las células
mediante un proceso mecánico hay que
tener en cuenta la posibilidad de ruptura
extraer, por lo que este debe bastar para
lograr la lisis de las células, pero no ser
muy agresivo para proteger el ADN.
Durante la práctica, evitando prolongar
por mucho tiempo la trituración para no
provocar daños en el ADN. El NaCl en
disolución actúa disminuyendo la
solubilidad de las proteínas, lo que hace
que precipitan y se separen más
fácilmente del ADN. La acción de la sal es
cubrir los terminales fosfatos negativos,
permitiendo así que los extremos se unan
y el ADN precipite en la solución de
alcohol, debido a que el sodio neutraliza
la carga negativa de los grupos fosfatos.
La adición de un detergente es necesaria
a menudo para eliminar las membranas.
Los detergentes rompen la barrera lipídica
solubilizando las proteínas e
interrumpiendo la interacción lípido-lípido,
lípido-proteína y proteína-proteína. Los
detergentes, al igual que los lípidos, se
asocian entre ellos y se unen a superficies
hidrofóbicas. Al romperse las membranas
celulares se permite la salida del ADN al
exterior. El ablandador de carne contiene
papaína. La papaína es una enzima que
se extrae del fruto llamado papaya. Las
propiedades peptolíticas de la papaína
provocan la ruptura de múltiples enlaces
en las proteínas animales. La papaína
bruta, contiene un poco de agua, glúcidos,
ácidos orgánicos y una mezcla de
enzimas, donde destacan las
denominadas proteasas que actúan
rompiendo los enlaces peptídicos en
cualquier lugar de la cadena peptídica en
la que se hallen situados. El ADN es
soluble en alcohol, pero se torna insoluble
en presencia de sal (NaCl) porque el
sodio neutraliza la carga negativa de los
grupos fosfatos. El etanol formará una
capa en la superficie por ser menos denso
que la solución acuosa.
En teoría la extracción consiste en el
aislamiento y purificación de moléculas de
ADN y se basa en las características
fisicoquímicas de la molécula. El ADN
está constituido por dos cadenas de
nucleótidos unidas entre sí formando una
doble hélice. Los nucleótidos están
integrados por un azúcar (desoxirribosa),
un grupo fosfato y una base nitrogenada
(adenina, guanina, timina o citosina). La
unión de los nucleótidos ocurre entre el
grupo fosfato y el azúcar, mediante
enlaces fosfodiéster, dando lugar al
esqueleto de la molécula. Las bases de
cadenas opuestas se unen mediante
puentes de hidrógeno y mantienen
estable la estructura helicoidal. Los
grupos fosfato están cargados
negativamente y son polares, lo que le
confiere al ADN una carga neta negativa y
lo hace altamente polar, características
que son aprovechadas para su extracción.
Los grupos fosfato tienen una fuerte
tendencia a repelerse, debido a su carga
negativa, lo que permite disolver al ADN
en soluciones acuosas y formar una capa
hidratante alrededor de la molécula. Pero,
en presencia del alcohol, se rompe la
capa hidratante y quedan expuestos los
grupos fosfato. Bajo estas condiciones se
favorece la unión con cationes como Na +
que reducen las fuerzas repulsivas entre
las cadenas de nucleótidos y permiten
que el ADN precipite (Sambrook et al.
1989). Por otro lado, la carga neta
negativa del ADN le permite unirse a
moléculas y matrices inorgánicas
cargadas positivamente (Nasón 1965,
Travaglini 1973, Sambrook et al. 1989,
Sinden 1994). A lo largo del tiempo se
han diseñado distintos protocolos con la
finalidad de obtener una cantidad y
calidad de ADN adecuados, así como
garantizar la eliminación de inhibidores
potenciales que dificulten el tratamiento
posterior de la molécula. Los métodos
tradicionales, desarrollados en los años
50, utilizan solventes orgánicos para
separar a las proteínas del ADN y, una
vez suspendido en la fase acuosa, aislarlo
por precipitación con etanol. Estos
métodos requieren preparar soluciones y
la extracción puede tomar desde unas
horas hasta varios días por los numerosos
pasos que deben realizarse. En general,
los protocolos tradicionales consisten de
cinco etapas principales:
homogeneización del tejido, separación
de proteínas y lípidos, precipitación y
redisolución del ADN.
Materiales y Métodos
Se usaron como materiales vasos de
precipitado de 150 ml, 3 tubos de ensayo
2 tubos falcón de 15 ml, gradilla - Varilla
de vidrio, Pipetas Pasteur, mortero y
pistilo agua destilada, hielo, cebolla
cabezona, espinaca, hígado, detergente
líquido, sal, bicarbonato de sodio, ablanda
carnes, alcohol de 96 % muy frío, se,
centrifuga.
En un vaso de precipitado se adiciono 120 Tabla 3. Pesos tejidos en tubo Falcon
ml de agua destilada, con 1,5 g de sal, y 5
g de bicarbonato sódico. 5 ml de
detergente líquido o champú. Se mantuvo
en un baño de hielo triturado, se cortó el
hígado y la espinaca en trozos, le
adicionamos agua destilada y trituramos
con mortero y pistilo. Se mezcló en tubos
falcón 5 ml del triturado celular con 10 ml
del tampón frío y se agitó. Se centrifugó a
baja velocidad 5 minutos y después se
llevó a cabo pipetear el sobrenadante.
Seguimos a retirar 5 ml del caldo
molecular a un tubo de ensayo y añadir
una pizca de ablanda carnes, el siguiente
paso fue de añadir con la pipeta 10 ml de
alcohol frío donde se dejó escurrir
lentamente el alcohol por las paredes del
tubo que debidamente se inclinó. El
alcohol quedó flotando sobre el tampón.
Después se agitó suavemente por 2 a 3
minutos para extraer fibras blancas de
ADN.

Resultados Imagen 1. Muestra hígado

Muestra Cantidad de tejido

Hígado 2.810

Espinaca 2.516

Tabla 1. Cantidad de tejido pesado

Muestra Peso solución

buffer

Hígado 35.547

Espinaca 33.783

Tabla 2. Peso tejido pesado con solución

buffer

Muestra Peso tubo Falcon

Hígado 20.592

Espinaca 21.752
Imagen 2. Muestra espinaca con
precipitado en la superficie

Análisis de resultados

El ADN es el material genético de los

organismos, su nombre completo es ácido
desoxirribonucleico. Una subunidad de
ADN se conoce como nucleótido, consiste
de una base nitrogenada, un azúcar y un
grupo fosfato. Cientos de miles de
nucleótidos se unen dando lugar a una
cadena polimérica, y dos cadenas de
nucleótidos se entrelazan por enlaces
débiles intermoleculares, de manera que
forman una doble hélice para construir la
molécula completa de ADN. Esta
sustancia está contenida en los
cromosomas presentes dentro del núcleo
celular. La secuencia de las subunidades
del ADN determina las características de
cada organismo. Se puede extraer ADN
con los tejidos de un organismo con un
Imagen 3. Muestra espinaca e hígado con
procedimiento. Este procedimiento
precipitado en la superficie
consiste en que, las células tanto
vegetales como animales, son tratadas
con una sustancia jabonosa (detergente),
que degradará los lípidos en la célula y
las membranas nucleares. La mezcla de
DNA luego se separará de las
membranas celulares y las proteínas. El
DNA en solución se puede precipitar
usando alcohol. Dependiendo de la
cantidad de la muestra, el DNA puede ser
visible al ojo humano sin ayuda de un
microscopio; aunque este procedimiento
simple no produce necesariamente DNA
de alta pureza.

Al extraer el ADN del tejido animal, del

hígado de vaca el cual se encuentra en el
núcleo celular, disperso y muy replegado,
unido a proteínas para formar la
cromatina, donde fue necesario
homogenizar el tejido, y romper las
células para separar el núcleo, además de
Imagen 4. Muestra hígado y espinaca
la envoltura nuclear para liberar su lisis celular, inactivar las nucleasas
contenido. celulares y separar los ácidos
nucleicos de los restos celulares.
Las características fisiológicas y
bioquímicas de todo ser vivo están
contenidas en sus respectivos genomas.

Las hojas de la espinaca contienen

células que a su vez contienen núcleos
con ADN. Al triturar las hojas, las
rompemos y separamos las células que Referencias
las forman. Pero el ADN sigue protegido
-Becerra, J. (2017). Extracción de ADN
por las membranas y es necesario
Genómico. Retrieved 14 October 2020,
romperlas para poder extraerlo, para ello
fromhttps://d1wqtxts1xzle7.cloudfront.net/
utilizamos el detergente, que se une a la
56836751/Bioquimica__T4_Reporte__6_
grasa y proteínas que forman estas
Meza.pdf?1529561834=&response-
membranas y las rompe y separa,
content-disposition=inline%3B+filename
entonces, el DNA se libera del núcleo y se
%3DExtraccion_rudimentaria_de_ADN.pd
disuelve en el agua que hemos utilizado
f
para triturar las hojas.
-Nasón A. (1965). Biología. Ed. Limusa,
Conclusiones
México.

-Sambrook J., E. F. Fritsch y T. Maniatis.

● Se logró correctamente extracción
1989. Molecular Cloning: A Laboratory
y separación del ADN a partir de
Manual. Cold Spring Harbor Laboratory
tejido animal, con la separación de
Press, Cold Spring Harbor, New York,
interfaces y seguidamente la
EE.UU.
obtención de hebras blancas que
corresponden a las miles de fibras -Sinden R. R. (1994). DNA Structure and
de ADN. Function. Academic Press, EE. UU
● En la extracción del ADN animal
se puso de manifiesto su -Travaglini E. C. (1973). Methods for the
estructura fibrilar y el grado de extraction and purification of
arrollamiento, que permite el desoribonucleic acid from eukariote cells.
empaquetamiento en el núcleo En: D. M. Prescott (ed.). Methods in cell
celular de las largas cadenas de biology. Academic Press, EE.UU.
esta molécula.
● Los métodos de extracción de -Velázquez, L., Aragon, M., & Romero, A.
ADN permiten obtener ácidos (2005). Extracción y purificación de ADN.
nucleicos purificados a partir de Retrieved 11 October 2020, from
diversas fuentes para después http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/l
realizar análisis específicos de ibros/710/extraccion.pdf
modificaciones genéticas mediante
la reacción en cadena de
polímeros (PCR). Para extraer los
ácidos nucleicos del material
biológico es preciso provocar una