BIOTECNOLOGÍA E.P.

INGENIERIA AMBIENTAL

Práctica N°5: Crecimiento microbiano

1. OBJETIVO

✓Comprender los requerimientos mínimos de un cultivo en lotes

✓ Determinar la curva de crecimiento de un cultivo bacteriano.

2. INTRODUCCION

El conocimiento del transcurso temporal o cinético del crecimiento microbiano y producción de

metabolitos resulta fundamental en el tratamiento cuantitativo de los procesos biotecnológicos.
El adecuado conocimiento de la cinética de un cultivo permite la predicción del transcurso de la
fermentación. Asimismo, la evaluación de las velocidades, rendimientos y productividades nos
entrega información útil para establecer estrategias de producción y optimización del proceso.

El comportamiento cinético de un cultivo está determinado por un conjunto complejo de factores

genéticos y ambientales. Entre estos últimos destacan las denominadas condiciones de operación
y la modalidad del cultivo.

Se entiende que un cultivo por lotes constituye un sistema cerrado en el cual no existe una
renovación de nutrientes ni una eliminación de productos, con excepción de algunos compuestos
gaseosos que fluyen con el aire a través de los filtros del reactor. En esta modalidad de cultivo se
cargan los nutrientes inicialmente y luego se inocula con una determinada cantidad de células
viables. Se inicia así el cultivo, el que transcurre en una forma característica, dada por la llamada
curva de crecimiento, hasta que algún evento, tal como el agotamiento de un nutriente esencial,
lo detiene.

La figura mostrada a continuación representa una típica curva de crecimiento. La forma que se
aprecia se da siempre que se cumplan ciertas condiciones: el cultivo se realiza por lotes, todas
las células que componen la población se reproducen a intervalos regulares, no existen en el
medio de cultivo sustancias inhibidoras del crecimiento y su composición es simple, en especial
en relación con las fuentes de carbono y nitrógeno.

La curva presenta varias zonas o fases, a saber:

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• Fase de latencia (a): se produce inmediatamente después de inoculado el cultivo. Durante ella
no hay iniciación de replicación de ADN ni separación de nuevas células. Fase en la cual se
produce el reacomodo de la composición macromolecular al nuevo ambiente en que se
encuentran las células inoculadas.
• Fase de crecimiento exponencial o logarítmico (b): las células se encuentran en plena
reproducción a una velocidad que es la máxima para el juego de condiciones existentes, por no
existir limitación de nutrientes.
• Fase estacionaria (c): se alcanza cuando se agota un nutriente, razón por la cual se detiene el
crecimiento.
• Fase de muerte o decaimiento (d): esta fase se presenta en aquellos cultivos en los que se
inducen enzimas autolíticas en condiciones de inanición.
• Fase de crecimiento críptico (e): en algunos cultivos es posible apreciar una zona de crecimiento
lento después de la fase de muerte. El contenido citoplasmático liberado por las células lisadas
proporciona los nutrientes requeridos para el crecimiento.

En la práctica realizada se utilizará como microoorganismo a Pseudomonas aeruginosa, este

pertenece a la familia Pseudomonaceae. Se trata de un bacilo recto o ligeramente curvado Gram
negativo, con un tamaño de 2–4 x 0,5-1 micras, y móvil gracias a la presencia de un flagelo polar, en
relación con su metabolismo, es aerobio (aunque puede desarrollarse en condiciones anaerobias
utilizando nitrato), catalasa positiva y oxidasa positiva.

Su temperatura óptima de crecimiento es de 37ºC, pero puede tolerar temperaturas de hasta 45ºC-
50ºC. El medio TSB contiene: Bacto Tryptone (digerido pancreático de caseína) 17,0 g; Bacto Soytone
(digerido péptico de harina de soja) 3,0 g; glucosa (dextrosa) 2,5 g; Cloruro sódico 5,0 g y Fosfato
dipotásico de hidrógeno 2,5 g.

3. MATERIAL

• Cultivo de P. aeruginosa de 18-24 horas en 30 mL de TSB en matraz

• Caldo TSB em matraz de 1L conteniendo 300 mL
• Micropipetas y tips de 1000 µL
• Espectrofotómetro
• Shaker – Incubadora

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4. PROCEDIMIENTO
Proceso de escalamiento (10% de volumen de inóculo) de P. aeruginosa en un medio completo
(TSB)

Tomar muestras en intervalos de tiempos definidos (cada 2 horas) para visualizar el crecimiento
microbiano mediante lecturas de densidad óptica. De ser necesario, realizar diluciones.

Diseño experimental
• Cultivo de 300 mL en medio completo (TSB) sin agitación a 37°C por 12 horas

Interpretación de Curva patrón de Absorbancia y Biomasa

Para determinar la población bacteriana mediante densidades ópticas es necesario tener una
curva patrón, de la que se obtiene una ecuación de recta y por medio de reemplazo de variables
de esta misma es que se puede obtener una población bacteriana ‘X’ que corresponde a una
absorbancia ‘A’.

Para la presente práctica, la curva de patrón nos sirve para obtener nuestro valor de interés,
biomasa (mg/mL), partiendo de densidades ópticas (absorbancias) obtenidas de cada uno de los
tiempos de cinética. Por ejemplo:

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Absorbancia=5.7558xBiomasa-0.010

5. RESULTADOS

CRECIMIENTO DE Pseudomonas aeruginosa EN CALDO TSB

Factor de D.O real = D.O * Factor de mg/mL de
Tiempos D.O.
dilución Dil. biomasa
T0
T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
T8
T9
T10
T11
T12

Ejemplo:

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