Curso: Acuicultura IV Prof. Dr.

Luis Rivera Chipana

PRÁCTICA N° 4
CULTIVO DE ALIMENTO VIVO (MICROALGAS)

Introducción.
Las microalgas como organismos autotróficos requieren luz, y un medio de cultivo que contiene los
macros y los micronutrientes constituidos por una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno y
fósforo y metales traza que en conjunto van disueltos en el medio de cultivo. El crecimiento en
función del tiempo, dependiendo del tipo de cultivo mostrará que tan eficiente es la adaptación de la
cepa al entorno y como acuicultores nos interesará que esta sea de la mayor rapidez, ya que así se
obtendrá un alto crecimiento y una alta productividad. En un cultivo estático o “batch”, los nutrientes
se adicionan desde el principio y el cultivo se desarrolla de acuerdo al consumo de nutrientes; al
inicio el medio es rico en nutrientes, pero conforme aumenta la densidad celular, los nutrientes
disminuyen, así como la cantidad de luz que recibe cada célula. En estos sistemas es posible
observar diferentes fases de crecimiento similares a las de otros microorganismos; la curva de
crecimiento presenta las siguientes fases de crecimiento: latencia, exponencial, estacionaria y muerte
(Fig. 1). Para el caso de la acuicultura, nos interesa el mantener los organismos en una fase de
crecimiento acelerado como es la exponencial ya que en esta fase se obtendrá la mayor tasa de
crecimiento.

Figura 1. Curva de crecimiento poblacional de un cultivo de microalgas en sistema estático o “batch”.

Se observan las fases de latencia, exponencial, estacionaria o meseta y muerte.
Tomado de https://slideplayer.es/slide/12116375/.

La fase de latencia se relaciona con el periodo de adaptación que ese microorganismo experimenta
ante las condiciones diferentes que se han impuesto cuando se inicia el cultivo. En producción se
busca que esta fase sea lo más corta posible para llegar a la fase exponencial durante la cual el
crecimiento es acelerado. Algunos factores que influyen en la duración de la latencia son los
siguientes:
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 Volumen de inóculo – por lo general se recomienda adicionar un 10% del volumen total a cultivar,
un menor volumen puede ocasionar una mayor latencia
 Inóculo en fase exponencial
 La cepa deberá estar lo más limpia posible (cultivo monoalgal y con una baja carga bacteriana)
 Un exceso de irradiancia en esta etapa puede inducir una fotoinhibición que se podrá reflejar en
una latencia con mayor duración.
La fase exponencial indica que ya el cultivo se ha adaptado a las condiciones del nuevo medio y
aprovecha la presencia de nutrientes tanto disueltos (macro y micronutrientes) como la iluminación.
En esta fase las células tienen condiciones óptimas para su crecimiento y por lo tanto se replican
más fácilmente hasta que sus nutrientes y la luz disminuyen por su alta densidad celular. El cultivo
pasa a una fase exponencial tardía, donde la tasa de crecimiento disminuye, antes de pasar a una
fase de meseta durante la cual se mantiene la densidad celular constante para luego empezar la
fase de muerte. En esta fase los nutrientes han disminuido y los desechos han aumentado (Fogg y
Thake, 1987, Harrison et al., 1990).
Una vez que el cultivo se ha establecido, es importante evaluar el crecimiento instantáneo y la tasa
de crecimiento de nuestro cultivo, pues esto nos puede entre otras cosas:
 Indicar el éxito del método de cultivo
 Permitir la planeación y el establecimiento de un programa de siembra – cosecha para los
escalamientos.
 mantenimiento de la cepa

Una vez que se inicia el cultivo es necesario evaluar su crecimiento, los métodos de evaluación
pueden ser varios e implican el determinar la absorbancia, la densidad celular y el incremento de
biomasa, la medición de otros contenidos celulares como la clorofila a (Lee et al., 2013). La tasa de
crecimiento (µ)equivale a la variación de la densidad celular en función del tiempo (Wood et al., 2005)
y es un indicador del comportamiento del cultivo en la fase exponencial, esta se calcula como se
indica en la siguiente expresión:

µ = (ln N – ln N0) / t
Donde N y N0 equivalen a la densidad final e inicial de células por unidad de volumen y t es el
tiempo transcurrido entre estos dos valores. El tiempo transcurrido para que el valor de N sea igual
a 2N0 es el tiempo de duplicación (G):
ln N – ln N0= ln 2 entonces µ = ln 2/ t por lo que G = t = ln 2 / µ ; G = 0.6931/µ
de donde el número de divisiones por día es k = µ / 0.6931

Los métodos de evaluación del crecimiento requieren de medir de alguna forma la biomasa en
cultivo, en general se consideran de dos tipos: directos e indirectos. Entre los primeros está el
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conteo por cámara de Neubauer y la evaluación de la densidad de biomasa; entre los segundos la
determinación de la densidad óptica o absorbancia (generalmente a 750 nm), o cualquier otro factor
que dependa del cultivo, por ejemplo: concentración de pigmentos, proteínas, o algún otro producto
metabólico del cultivo.
1. OBJETIVOS:
Objetivo 1. Conocer las características microscópicas de las principales especies de cultivo en
acuicultura marina.
Objetivo 2. Evaluación del crecimiento de la biomasa.
Objetivo 3. Conocer los diferentes sistemas de cultivo de microalgas: estático, semi- continuo,
continuo en interiores y exteriores.
2. METODOLOGÍA

2.1 Observación de las características de las cepas en cultivo a través del microscopio Evaluar
visualmente las características morfológicas de las cepas en cultivo, tamaño, forma, movilidad, color
y presencia de otros microorganismos. Se empleará porta y cubreobjetos simples donde se
colocará una gota del cultivo. Esto permitirá identificar las células que van a ser contadas, determinar
si tienen movilidad; se observará la densidad general y así se determinará si deben ser diluidas. En
el caso de células flageladas es necesario fijarlas ya sea con lugol o con formol adicionando a la
muestra 100 μL de cualquiera de estos dos reactivos por cada 10 mL.

2.2. Evaluación de la densidad celular y de la biomasa

 Conteo de células
El conteo de células se realizará en cámara de Neubauer y se requiere que las células no
tengan movilidad.

Figura 2. Cámara de Neubauer. A) Cuadrícula de conteo. B) Adición de la muestra. C) Secuencia de

conteo sugerida.
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Cámara de Neubauer (Fig. 2).

La cámara de Neubauer o cámara de conteo está adaptada para uso con el microscopio de campo
claro o de contraste de fases. Consta de un portaobjetos muy grueso, con dos excavaciones en la
parte media. La parte central está dividida en dos superficies por otra excavación; en cada una se ha
marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula de dimensiones conocidas. La cámara
(portaobjetos) se cubre antes de adicionar la muestra con un cubreobjetos de dimensiones
adecuadas, una vez adicionada la muestra, se adhiere por simple tensión superficial. El volumen que
hay entre el portaobjetos y el cubreobjetos en la cuadrícula, es equivalente a una diezmilésima de
mililitro. (Guillard y Sieracki, 2005; Lee et al., 2013)

Preparación de la cámara Neubauer

a) Lavar cuidadosamente la cámara de Neubauer con agua destilada cuidando de no frotar la zona
brillante o central y el cubreobjetos. Secar con papel adsorbente cuidando de no frotar la zona
brillante. Colocar el cubreobjetos sobre la zona central limitada por dos excavaciones laterales.

b) Tomar una muestra de 1 mL de cultivo de microalgas y fijarla con lugol.

c) Homogeneizar la muestra por agitación suave, tomar de inmediato una alícuota con pipeta
Pasteur y depositar por capilaridad una gota entre el portaobjetos y el cubreobjetos por el borde
de la cámara (Fig. 2 B) evitando el exceso, dejando que la muestra se distribuya por capilaridad.

d) Dejar en reposo esta muestra durante 2 minutos, lo que servirá para que las células a contar
sedimenten y se pueda contar en un solo plano. Colocar la cámara en la platina del microscopio
y localizar con el objetivo seco débil (10X) la zona de conteo que se muestra en la Fig. 2 A. La
cámara contiene dos cuadrículas separadas por un canal central, iguales a la mostrada en la Fig.
2 A. Cada cuadrícula tiene tres cuadros de 1.0 mm por lado, en total 9 cuadros. Al observar en
objetivo seco fuerte (40X) cada cuadro de 1 mm ubicado en los extremos (Fig. 2 A-1) se observa
dividido en 4X4 cuadros pequeños de 0.25 mm por lado (Fig. 2 A-2).

e) El conteo celular se realizará en los cuatro cuadros laterales extremos de ambas cuadrículas
separadas por el canal central a 40X, contando las células contenidas en los 16 cuadros más
pequeños. El promedio de la suma de los conteos se multiplicará por 10,000 para obtener la
densidad celular en Número de células/mL. El volumen en el que se realiza el conteo
corresponde a 1/10,000 de mililitro ya que el cuadro tiene 1 mm por lado y hay un espacio de 0.1
mm entre la superficie de la cuadrícula y el cubre objetos; este conteo se deberá realizar por
duplicado. El cálculo de la densidad celular se puede expresar así:
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f) Células / mL = (promedio de células contadas en las ocho cuadrículas de 4X4 cuadros) x 10,000
x factor de dilución.

g) En caso de que el cultivo esté muy concentrado, se recomienda hacer diluciones (1:2, 1:5, 1:10
etc. según sea necesario) para facilitar el conteo.

h) Por convención en el laboratorio de microalgas se prefiere contar sólo las células que tocan la
primera línea que rodea el cuadro de 4 X 4, pero no las que están fuera.

CURVA ABSORBANCIA–DENSIDAD CELULAR.

La medida de la absorbancia tiene que ver con la cantidad de interferencias a la luz, por lo que la
medición de la absorbancia de una muestra puede ser un buen correlato de su densidad celular;
siempre y cuando las células no formen agregados y permanezcan en suspensión un tiempo
suficiente para tomar una lectura confiable.

DETERMINACIÓN DE LA ABSORBANCIA DE LA MUESTRA Y ELABORACIÓN DE UNA

CURVA ABSORBANCIA VS DENSIDAD CELULAR
a) Encender el espectrofotómetro Génesis 20 y dejarlo calentar al menos por 5 min.
b) Ajustar la longitud de onda a 750nm.
c) Llenar una cubeta de plástico con el blanco que generalmente es agua de mar filtrada o agua
dulce dependiendo de la cepa a cultivar. Ajustar a cero el equipo.
d) Homogeneizar la muestra y colocar 1 mL en la celda, cuidando de no tocar las caras de paso de
luz, inmediatamente tomar la lectura de absorbancia, que deberá ser de entre 0.5 – 1.0
unidades.
e) A partir de esta muestra, realizar al menos 5 diluciones para cubrir un intervalo de absorbancias
desde 0.05 unidades hasta la máxima absorbancia de la muestra sin dilución. Determinar la
absorbancia y realizar el conteo de células en cada dilución empleándola cámara de Neubauer.
f) Obtener la ecuación de regresión absorbancia vs densidad celular, con el coeficiente de
correlación más alto posible.

EVALUACIÓN DE LA BIOMASA CELULAR

Preparación de membranas de fibra de vidrio GF/C a peso constante.
Para obtener el peso de la biomasa de las células es importante contar con membranas de fibra de
vidrio de peso constante conocido. A continuación, se explica su preparación:
a) Las membranas GF/C se lavan en agua destilada para eliminar pequeñas partículas que
pudiesen contribuir con errores en la pesada. Emplear pinzas con punta roma para su
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manipulación, siempre cuidando de no romperlas.

b) Colocar las membranas recién lavadas sobre un papel absorbente hasta que sequen por
completo. También puede emplearse el secado en estufa a 60 °C.
c) Fabricar sobres de aluminio de tamaño de la membrana y rotularlos de manera que el marcaje
resalte y se observe a simple vista. Esto con el fin de evitar que se borre la marca con el
quemado o manejo de los sobres durante la determinación del peso constante.
d) Colocar las membranas secas en los sobres y éstos en una charola, hornear por 4h en la mufla a
450 – 490 °C.
e) Colocar las membranas en estufa a 60°C para enfriar y en seguida colocar en el desecador
previamente adicionado con silica previamente deshidratada en estufa por 24h, hasta que
alcancen la temperatura ambiente.
f) Realizar al menos tres pesadas y determinar el peso constante de cada membrana en balanza
analítica, cuidando de manejarlas siempre con pinzas de punta roma.
g) Una vez determinado el peso constante guardar las membranas en una bolsa Zip-lock doble en
un lugar seco.
DETERMINACIÓN DEL PESO SECO MICROALGAL.
h) Se emplearán membranas GF/C, de peso seco constante conocido y que se encuentran
guardadas en sobres individuales bien identificados. Las membranas deberán manejarse con
mucho cuidado mediante pinzas para no alterar el peso seco, estas una vez secas se colocarán
en desecador con sílica deshidratada.
i) De una muestra de microalgas recién homogeneizada, se tomará un volumen que se hará pasar
por una membrana GF/C de peso constante conocido. La cantidad de cultivo será determinada en
base a la densidad celular. Se recomienda adicionar pequeños volúmenes de cultivo homogéneo,
hasta que la filtración se reduzca, para evitar que el flujo de filtración cese por completo, lo que
podría dañar las células por la excesiva presión aplicada. Es importante evitar la iluminación y
mantener en baja temperatura las muestras en caso de que el procedimiento de muestreo sea
muy largo, ya que las cepas pueden alterar su densidad.
j) Determinar la densidad del cultivo a evaluar.
k) Filtrar un volumen conocido del inóculo empleando un sistema por filtración Millipore (presión
negativa aplicando vacío).
l) Lavar el filtrado con formiato de amonio 3% para eliminar las sales. (el formiato sustituye a las
sales marinas en el exterior celular y se descompone a 56°C). Doblar las membranas a la mitad y
colocarlas nuevamente en su sobre.
m) Secar las muestras en estufa a 60°C por 24h.
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n) Enfriar las muestras en desecador que contenga silica seca y fría.

o) Pesar las membranas en balanza analítica, realizando siempre un manejo cuidadoso mediante
pinzas de punta roma y determinar su peso constante (dejando secar al menos de 4-5 h entre
pesada y pesada). Generalmente es suficiente de 2 a tres veces cuando se usan membranas de
25mm de diámetro. Filtros de mayor tamaño pueden requerir mayor número de pesadas y de
tiempo entre ellas.
p) Una vez que la muestra se haya secado, es importante que, si no se realizan las pesadas en el
tiempo indicado, se guarden en el desecador para evitar una pérdida de lípidos ya que pueden
volatilizarse y modificar el peso.
q) Cundo se obtenga el peso seco constante de la muestra, se determinará el peso seco de la
biomasa por diferencia respecto al peso seco de la membrana.
r) Las muestras de peso seco constante se quemarán en mufla a 450°C por un mínimo de 6 h para
eliminar la materia orgánica y dejar sólo las cenizas. Al final enfriar en estufa a 60°C y luego
colocar en desecador hasta temperatura ambiente.
s) Determinar el peso seco constante de las cenizas. Calcular por diferencia el peso seco de la
materia inorgánica; la diferencia entre el peso seco y el peso de las cenizas, equivale al peso
seco libre de cenizas, éste es un correlato del peso orgánico.
t) Calcular el peso seco, peso libre de cenizas y pesocenizas en unidades de densidad (mg/ml de
cultivo filtrado) y en relación a la densidad celular pre-determinada (mg/millón de células o
pg/cél).

DETERMINACIÓN DE CLOROFILA A, CLOROFILA C, Y DE PIGMENTOS CAROTENOIDES.

a) Las muestras obtenidas en tubo Eppendorf, se centrifugarán por dos minutos cuidando que la
temperatura no se altere.
b) Retirar el sobrenadante y adicionar 1mL de metanol grado reactivo.
c) Calentar por un minuto en baño María a temperatura de 80 °C y centrifugar por 1 min. Si el
precipitado muestra coloración y el sobrenadante también, extraer el sobrenadante en otro tubo
y adicionar nuevamente la misma cantidad de metanol y repetir el procedimiento.
d) Conjuntar los sobrenadantes y ajustar a 2 ml el volumen con metanol.
e) Leer los extractos de las muestras a longitudes de onda de 662, 646 y 470 nm en celda
de cuarzo y calcular el contenido de clorofila a, clorofila c y carotenoides totales en cada muestra,
mediante las ecuaciones de Lichtentaler and Wellburn (1985), que se muestran a continuación:

Ca=15.65 A662 - 7.340 A646

Cb=27.05 A646 - 11.21 A662
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Cx+c = (1000 A470 - 2.860 Ca - 129.2 Cb) /245

2.1. SISTEMAS DE CULTIVO:

semi-continuo, continuo, cultivo en interiores y en exteriores. Escalamiento y manejo de los

diferentes sistemas de cultivo
El sistema semi-continuo consiste en cosechar diariamente un porcentaje del volumen,
adicionando igual volumen de medio fresco, esto se inicia cuando el cultivo alcanza la fase
exponencial. El porcentaje o tasa de recambio dependerá de la especie, así como de las
necesidades de empleo del cultivo (Lee et al., 2013).

Métodos de escalamiento. Se realizará una visita al laboratorio de producción de microalgas del

CIBNOR, para observar los diferentes niveles de escalamiento de cultivos de microalgas. Así
también se realizará una cosecha al cultivo semicontinuo establecido previamente, de acuerdo a
las indicaciones del profesor y se observará el sistema continúo establecido en el laboratorio,
valorar la densidad celular en cada caso.

2.1.6. Referencias
Fogg, G. E. y Thake, B. 1987. Algal Cultures and phytoplankton ecology. The University of
Wisconsin Press. London, UK. 268 pp.
Harrison, P. J. Thompson, P. A. y Calderwood, G. S. 1990. Effects of nutrient and light limitation on
the biochemical composition of phytoplankton. Journal of Applied Phycology 2: 45-56. Lee, Y. K.,
Chen, W., Shen, W., Han, D., Li, Y., Jones, H. D. T., Timlin, J. A., Hu, Q. 2013. Basic Culturing
and Analytical Measurement Techniques. En: Richmond, A. y Hu. Q. (Eds.) Handbook of Microalgal
Culture Applied Phycology and Biotechnology. Pp. 37-68. Wiley
Blackwell, UK.
Lichtenthaler, H. K. y Wellburn, A. R. 1985. Determination of total carotenoids and
chlorophylls a and b of leaf in differentsolvents. Biol. Soc. Trans. 11. 591-592.
Fogg, G. E. y Thake, B. 1987. Algal cultures and phytoplanktonecology. The University of

Wisconsin Press. 269 pp.

Wood, M. A., Everroad, R. C. y Wingard, L. M. 2005. Measuring Growth Rates in Microalgal
Cultures. En: Andersen, R. A (Ed.) Algal culture techniques Pp. 269- 285. Elsevier Academic
Press. Phycological Society of America. London, UK.