CINÉTIC

PRACTICA 7
A DE
CULTIVO
POR
LOTES
FISIOLOGÍA MICROBIANA
ROGER PALOMINO
OBJETIVOS
1. Determinar la curva de crecimiento de un cultivo bacteriano.
2. Determinar algunos parámetros cinéticos.

INTRODUCCIÓN
 El conocimiento del transcurso temporal o cinético de crecimiento y producción de metabolitos resulta fundamental en
el tratamiento cuantitativo de los procesos biotecnológicos. El comportamiento cinético de un cultivo está determinado
por un conjunto complejo de factores genéticos y ambientales. Entre estos últimos destacan las denominadas
condiciones de operación y la modalidad del cultivo.
 Se entiende que un cultivo por lotes constituye un sistema cerrado en el cual no existe una renovación de nutrientes ni
una eliminación de productos, con excepción de algunos compuestos gaseosos que fluyen con el aire a través de los
filtros del reactor. En esta modalidad de cultivo se cargan los nutrientes inicialmente y luego se inocula con una
determinada cantidad de células viables.
 La figura mostrada abajo representa una típica curva de crecimiento. La forma que se aprecia se da siempre que se
cumplan ciertas condiciones: el cultivo se realiza por lotes, todas las células que componen la población se reproducen a
intervalos regulares, no existen en el medio de cultivo sustancias inhibidoras del crecimiento y su composición es
simple, en especial en relación a las fuentes de carbono y nitrógeno.
 La curva presenta varias zonas o fases, a saber:

Fig. 11.1. Cinética de cultivo por lotes. Se detallan las diferentes fases de crecimiento: (a) fase de latencia, (b) fase logarítmica, (c) fase estacionaria, (d) fase de muerte y
(e) fase de crecimiento críptico.

• Fase de latencia (a): se produce inmediatamente después de inoculado el cultivo. Durante ella no hay ini-ciación de replicación de ADN ni separación de
nuevas células. Fase en la cual se produce el reacomodo de la composición macromolecular al nuevo ambiente en que se encuentran las células
inoculadas.

• Fase de crecimiento exponencial o logarítmico (b): las células se encuentran en plena reproducción a una velocidad que es la máxima para el juego de
condiciones existentes, por no existir limitación de nutrientes.

• Fase estacionaria (c): se alcanza cuando se agota un nutriente, razón por la cual se detiene el crecimiento.

• Fase de muerte o decaimiento (d): esta fase se presenta en aquellos cultivos en los que se inducen enzimas autolíticas en condiciones de inanición.

• Fase de crecimiento críptico (e): en algunos cultivos es posible apreciar una zona de crecimiento lento después de la fase de muerte. El contenido
citoplasmático liberado por las células lisadas proporciona los nutrientes requeridos para el crecimiento.
PARÁMETROS CINÉTICOS El parámetro μ es de especial relevancia en el estudio de la cinética de
fermentaciones. Si se examinan sus dimensiones básicas, éstas resultan de tiempo-
 El crecimiento de una población bacteriana puede ser representado por: 1, por lo que se le expresa en h-1 comúnmente, o bien min-1 o s-1.

Relacionado con μ existe otro parámetro cuya interpretación física puede parecer
como más directa: el tiempo de duplicación Td, definido como el intervalo de
tiempo entre dos duplicaciones. Si imponemos esos límites para integrar la
ecuación (1), resulta:
 Donde μ es la velocidad específica de crecimiento, cuyo valor es constante
durante la fase de crecimiento exponencial y en lo Figura 1 corresponde a la
pendiente de un gráfico semilogarítmico en la fase exponencial, ya que:

 Durante la fase exponencial es posible integrar la ecuación (1) entre límites

adecuados, resultando:
 Cultivo de P. aeruginosa de 18-24 horas
en de 30 mL de TSB en matraz.
MATERIALE
Caldo Mínimo de Davies en matraz de 1 L

Caldo TSB en matraz de 1L

S

Micropipetas y tips de 1000 μL

Espectrofotómetro

Shaker - Incubadora
PROCEDIMI
ENTOS
1. Proceso de
Escalamiento
(10% de
volumen de
inóculo) de P.
aeruginosa
2. Tomar muestras en intervalos de tiempos definidos para visualizar el crecimiento
microbiano mediante lecturas de densidad óptica.
3. DISEÑO DEL EXPERIMENTO
• Cultivo de 300 mL en medio completo (TSB) en agitación (150 RPM) a 37 °C por 12 horas.
• Cultivo de 300 mL en medio completo (TSB) sin agitación a 37 °C por 12 horas.
• Cultivo de 300 mL en medio mínimo (MMD) en agitación (150 RPM) a 37 °C por 12 horas.
• Cultivo de 300 mL en medio mínimo (MMD) sin agitación a 37 °C por 12 horas.
4. INTERPRETACIÓN DE CURVA PATRÓN
DE ABSORBANCIA Y BIOMASA
Para determinar la población bacteriana mediante densidades ópticas es necesario tener una curva patrón, de la
que se obtiene una ecuación de recta y por medio de reemplazo de variables de ésta misma es que se puede
obtener una población bacteriana “X” que corresponde a una absorbancia “A”. Para la presente práctica, la curva
patrón nos sirve para para obtener nuestro valor de interés, biomasa (mg/mL), partiendo de densidades ópticas
(absorbancias) obtenidas de cada uno de los tiempos de la cinética. Por ejemplo:
CASO REAL:
5. DETERMINACIÓN DE LA VELOCIDAD DE CRECIMIENTO
MICROBIANO (Μ)

 Como se mencionó, el μ se determina a partir de la formula .Pero para esto es necesario

poder reconocer las fases de una cinética de crecimiento, principalmente la fase exponencial, en la cual
𝑋𝑜 es la biomasa presente al inicio de la fase exponencial y 𝑋 es la biomasa presente para cualquier
tiempo posterior al inicio de la exponencial, pero no biomasas que estén fuera de la exponencial (fase
estacionaria y de muerte). Por ejemplo:
Desde la hora 0 hasta la hora 2 se puede observar la fase lag, en donde el crecimiento es ínfimo y lento. A
partir de la segunda hora hasta la hora 10 se evidencia la fase logarítmica debido a que el crecimiento
poblacional se duplica a lo largo del tiempo (crecimiento exponencial) y, finalmente, el resto de la cinética se
muestra la fase estacionaria, en donde el crecimiento poblacional es mínimo.
Con la fase exponencial identificada, se procede a hallar el μ.
Donde:

Entonces:

Ojo: Cabe recalcar que se puede usar cualquier otro de los puntos como 𝑋 dentro de la exponencial para
hallar el μ. En este caso, se usó 𝑋10.
RESULTADOS
RESULTADOS
RESULTADOS
RESULTADOS
RESULTADOS
RESULTADOS
RESULTADOS
RESULTADOS
RESULTADOS
RESULTADOS
DISCUSIÓN
 La fase exponencial siguió hasta que algún nutriente del medio de cultivo se agota y el crecimiento se detiene o también puede detenerse el
crecimiento por acumulación de alguna substancia inhibidora formada por los mismos microorganismos, pero supóngase por ahora que éste no es el
caso y que la primera alternativa es la válida. Luego hay dos aspectos claramente diferenciables que hacen al crecimiento microbiano: uno
estequiométrico, por el cual la concentración final de microorganismos obtenidos dependerá de la concentración y composición del medio de cultivo,
y el otro cinético, el que dirá con qué velocidad se lleva a cabo el proceso. (Prescott y col .,1999).
 Como ya se ha indicado anteriormente, el crecimiento se define como un incremento en el número de células microbianas en una población, lo cual
también puede ser medido como un incremento en masa microbiana en este contexto, la velocidad de crecimiento se define como el cambio en
número de células o masa celular por unidad de tiempo (Madigan y col .,1999). La velocidad del aumento de bacterias en un tiempo dado es
proporcional al número o masa de bacterias presentes durante ese tiempo (Stanier y col.,1989). Entonces en la mesa 5, 1 y 2 tienen una velocidad de
crecimiento de 0.5304, 0.4638 y 0.381 respectivamente que muestra unas cantidades altas a comparación de las demás mesas por lo tanto la masa de
bacterias presentes durante ese tiempo es proporcional a sus velocidades por otro lado la agitación influyo en la oxigenación de la muestra y por ende
en su crecimiento evidenciando en la mesa 1 y 5 una mayor velocidad de crecimiento por otro lado también influyó mucho el medio de cultivo que
utiliza como sustrato ya que con el medio TSB de la mesa 1.2 y 5 tuvieron un mejor crecimiento mientras que la mesa 3 y 4 que estuvo con MMD
tuvieron bajas cifras corroborando lo que dice Madigan y col .,1997 que la tasa del crecimiento exponencial se ve influenciada por las condiciones
ambientales (temperatura, composición del medio), así como por las características genéticas del microorganismo.
 Con respecto al tiempo de generación es el tiempo necesario para duplicar la población microbiana (Según Stanier y col., 1989), se define como el
tiempo requerido para que todos los componentes del cultivo aumenten en un factor de 2 por lo que muchas bacterias tienen tiempos de generación
de 1-3horas, conociéndose pocos microorganismos que crezcan muy rápidamente dividiéndose en menos de 10minutos, otras tienen tiempos de
generación de varias horas o incluso días .el tiempo de generación es útil como indicador del estado fisiológico de una población celular, y es usado
con frecuencia para comprobar el efecto negativo o positivo de un determinado tratamiento sobre un cultivo microbiano ( Madigan y col .,1997), por
lo tanto a mayor velocidad de crecimiento microbiano será menor el tiempo que necesite en duplicarse la bacteria y eso se corrobora con los datos
obtenidos en práctica ya que se obtuvo en la mesa 1, 2 y 5 velocidades mayores que en las demás mesas por ende sus tiempos de duplicación serán
los más bajos en comparación con las otras mesas o sea inversamente proporcional.
 El comportamiento microbiano se ve
El crecimiento microbiano hace afectado por diversos factores
referencia al aumento del número de intrínsecos y extrínsecos ya sea por los
microorganismos a lo largo del tiempo componentes del medio de cultivo o
y no al aumento de tamaño de un por la oxigenación que vimos en esta
microorganismo. práctica mientras que en otras
prácticas toman temperatura, pH, y
actividad de agua.

CONCLUSIONES

La masa de bacterias presentes durante ese

tiempo es proporcional a sus velocidades
por otro lado la agitación influyo en la Probablemente sea la temperatura el
oxigenación de la muestra y por ende en más importante de los factores
su crecimiento evidenciando en la mesa 1 ambientales que afectan a la viabilidad
y 5 una mayor velocidad de crecimiento y el desarrollo microbiano
GRACIAS
!